Разработка методики количественного определения суммы кумаринов в донника лекарственного траве ( Melilotus officinalis L. ) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 135-141.

УДК 615.322

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ КУМАРИНОВ В ДОННИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ТРАВЕ (MELILOTUS OFFICINALIS L.)

© Л.М. Федосеева', Т.А. Харлампович

Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина, 40,

Барнаул, 656038 (Россия), e-mail: ludmila@agmu.ru

Предложена методика количественного определения суммы кумаринов в донника лекарственного траве, сущность которой заключается в определении кумарина методом ВЭЖХ после предварительного кислотного гидролиза водно-спиртовых извлечений. Пригодность методики подтверждена валидацией.

Ключевые слова: Melilotus officinalis, кумарин, мелилотозид, ВЭЖХ, гидролиз,

Введение

Кумарины - производные бензо-альфа-пирона, широко распространены в мире растений. В настоящее время число выделенных природных кумаринов значительно превышает 200 соединений, которые находятся как в свободном состоянии, так и в виде гликозидов. Доказано, что структурные фрагменты кумаринов входят в молекулы антибиотиков, фитонцидов и полифенольных соединений [1-3].

Кумарины донника лекарственного травы достаточно изучены. Доминирующими в их составе являются кумарин и его гликозид мелилотозид, который гидролизуется с образованием кумарина. О-кумаровая и мелилотовая кислоты - метаболиты кумарина, содержатся в незначительных количествах. Дикумарол является продуктом микробиологической биотрансформации кумарина, образуется в пораженном плесенью растительном сырье [4-8].

Для разработки нормативной документации и стандартизации необходимо определение количественного содержания биологически активных соединений (БАС) в сырье. На сегодняшний день для установления качества донника лекарственного травы в России действует ГОСТ 14101 «Трава донника» от 1969 г., включающий в себя определение подлинности по макроскопическим признакам и доброкачественности сырья (товароведческие показатели, без количественного определения БАС) [9]. Европейская фармакопея для установления количественного содержания кумарина донника лекарственного травы предлагает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Учитывая разницу в ареалах произрастания, нормы, установленные Европейской фармакопеей, могут не выдерживаться.

Цель нашего исследования - эмпирическая оценка существующих методов и разработка методики количественного определения кумарина в донника лекарственного траве.

Экспериментальная часть

Федосеева Людмила Михаиловна - заведующая кафедрой фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии, профессор, Для исследования использовали образцы

доктор фармацвтическихнаук, тел,: (3852) 24-02-78, e-mail: ludmila@agmu.ru

Харлампович Татьяна Анатольевна - аспирант кафедры фармацевтической химии, тел.: (3852) 24-02-78, e-mail: ludmila@agmu.ru

донника лекарственного травы, заготовленной в июле 2010 г., в период цветения, в Завьяловском, Ма-монтовском, Зональном, Бийском, Алтайском, Красногорском районах Алтайского края.

* Автор, с которым следует вести переписку,

Сырье, измельченное до размера частиц не более 2 мм, подвергали экстракции в соотношении сырья и экстрагента 1 : 100. В качестве экстрагента применяли метанол, спирт этиловый в концентрации 96, 80, 60, 50, 40%. Извлечение готовили с использованием ультразвуковой ванны Elmasonic S (УЗ), перемешивающего устройства с вращающейся платформой LS 110 (ПУ) или водяной бани.

Полноту и влияние условий экстракции (экстрагент, способ мацерации, время, температуру) контролировали методом ВЭЖХ по содержанию кумаринов и кумаровых кислот в полученных извлечениях. Анализ проводили на хроматографическом модуле «Alliance» фирмы Waters, оснащенном диодноматричным детектором и хроматографической колонкой Wakosil C18 RS (250*4,6) мм, 5цм в следующих условиях: элюент А - раствор ортофосфорной кислоты 0,1%; элюент В - ацетонитрил; градиентный режим: 20 мин - от 5 до 30% элюента В; 10 мин - 30% элюента В; аналитическая длина волны - 275 нм; скорость потока - 1,5 мл/мин; объем инжекции - 20 мкл.

Кумарины и кумаровые кислоты идентифицировали по спектрам поглощения и временам удерживания в сравнении со стандартными образцами. В качестве стандартных образцов использовали о-кумаровую кислоту (Sigma, кат. №И2, 280-9), кумарин (Sigma, кат. №С4261), скополетин (Sigma, кат. №S2500 ), ум-беллиферон (PhytoLab, кат. №80098), мелилотовую кислоту (Aldrich, кат. №39,353-3).

По результатам исследования определили оптимальные условия пробоподготовки для методики количественного определения кумаринов в сырье.

Для количественного определения кумаринов нами апробированы спектрофотометрический и колориметрический методы как наиболее приемлемые для рутинного анализа. Проведена оценка их специфичности по отношению к объекту исследования: возможность достоверно определять содержание кумаринов в донника траве в присутствии сопутствующих веществ - гликозидов кверцетина и кемпферола [10].

Специфичность метода прямой спектрофотометрии оценивали по спектрам поглощения извлечений травы донника лекарственного, стандартного раствора кумарина, растворов модельных смесей кумарина и рутина. Спектры регистрировали на спектрофотометре «Cary 300» (Varian).

Специфичность колориметрического метода, основанного на реакции азосочетания, была оценена по спектрам поглощения продуктов реакции диазореактива с флавоноловыми гликозидами, кумарином и извлечениями донника лекарственного травы.

Следующий этап - разработка методики количественного определения кумарина в донника лекарственного траве. В результате предложена методика количественного определения суммы кумаринов, основанная на определении кумарина методом ВЭЖХ после предварительного кислотного гидролиза водно-спиртовых извлечений.

Методика. Около 1 г (точная навеска) растительного сырья, измельченного до размера частиц не более 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 50% и экстрагируют на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Извлечение декантируют в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях. Объединенные извлечения охлаждают, доводят спиртом 50% до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр «синяя лента».

10,0 мл фильтрата помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 5 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и выдерживают в течение часа на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Гидролизат охлаждают, количественно переносят спиртом этиловым 96% в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр «синяя лента» (испытуемый раствор).

Испытуемый раствор и раствор СО кумарина попеременно хроматографируют в условиях, указанных выше.

Содержание кумарина в растительном сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

S ■ а0 ■ 100 • 50 • 1 • P • 100

X —---------------------------,

S0 • а ■ 10 • 50 • 50 • (100 - W)

где S - площадь пика кумарина на хроматограмме испытуемого раствора; S0 - площадь пика кумарина на хроматограмме раствора СО кумарина; а - навеска растительного сырья, г; а0 - навеска СО кумарина, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; Р - содержание основного вещества в СО кумарина, %.

Приготовление раствора СО кумарина. Около 0,01 г кумарина (Sigma или аналогичного качества) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в спирте 96%, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора спиром 96% до метки и перемешивают.

Обсуждениерезультатов

Для количественного определения кумаринов в донника лекарственного траве оценивалась возмож-ность использования классических методов, широко применяемых для рутинного анализа растительного сырья: метод прямой спектрофотометрии и колориметрический метод. Проведена оценка их специфичности по отношению к объекту исследования - возможность достоверно определять содержание кумаринов в изучаемом сырье в присутствии сопутствующих веществ [11].

Критерий приемлемости для спектрофотометрических методик: области поглощения стандартного и испытуемого растворов должны совпадать, сопутствующие вещества не должны мешать исследованию.

При оценке специфичности спектрофотометрического метода установлено, что в спектрах водноспиртовых извлечений донника лекарственного травы происходит наложение области поглощения кума -ринов и гликозидов флавонолов, входящих в состав растения. Об этом свидетельствует отклик спектрофотометра в указанной области на добавку к извлечению раствора рутина или гиперозида (рис. 1).

Низкая специфичность метода по отношению к объекту исследований обусловлена тем, что флавоноиды, дубильные вещества и другие фенольные соединения, входящие в состав растительного сырья, в электронных спектрах имеют полосу поглощения при 250-280 нм, характерную в том числе и для кумарина.

Колориметрический метод также не специфичен применительно к доннику ввиду значительного влияния флавонолов, образующих с диазореактивом окрашенные соединения, поглощающие в той же области, что и кумарин.

Лекарственные препараты на основе донника лекарственного, как правило, включают рутин или растительные источники флавоноидов (Ультравит венен, Нидерланды). Применение спектрофотометрических методик определения кумаринов в донника лекарственного траве и препаратах на его основе требует предварительного выделения кумаринов. Это существенно усложняет рутинный анализ и уменьшает его воспроизводимость.

При исследовании методом ВЭЖХ в извлечениях донника лекарственного травы обнаружены кума -рин и компонент с временем удерживания 11,629 мин, имеющий спектр кумарина (рис. 2). Отсутствие данного компонента на хроматограмме гидролизата (рис. 3) и пропорциональное увеличение площади пика кумарина позволило идентифицировать его как гликозид кумарина. Результаты идентификации кумаринов и кумаровых кислот в извлечениях и их гидролизатах представлены в таблице 1.

Доминирующее содержание кумарина и его гликозида в составе кумаринов травы донника лекарственного (более 90% от суммы, полученной методом нормирования), коммерческая доступность стандартного образца кумарина позволяют заменить малоспецифичные групповые методы на анализ по пику кума -рина методом ВЭЖХ после предварительного гидролиза.

і її

5

0,8

/ I

Рис. 1. Спектры поглощения спиртовых растворов: 1 - кумарин; 2 - гиперозид; 3 - смесь кумарина и гиперозида; 4 - извлечение донника лекарственного травы; 5 - извлечение донника лекарственного травы с добавкой гиперозида

0,0

200

300

400

Wavelength (nm)

500

600

Следует отметить, что метод ВЭЖХ, представленный в Европейской фармакопее для количественного определения кумарина, не учитывает наличие гликозида кумарина.

При исследовании влияния условий экстракции на степень извлечения кумарина из растительного сырья установлено, что использование в качестве экстрагента спирта этилового в концентрации от 40 до 80% позволяет достигать максимального содержания кумарина и его гликозида в извлечениях (табл. 2).

Как видно из данных таблицы 2, способ экстракции не оказывает существенного влияния на выход кумаринов. Использование ультразвуковой ванны нецелесообразно, так как при простом перемешивании полнота экстракции достигается в течение того же времени. Использование температуры кипения не вызывает деградации кумаринов, а полнота экстракции достигается в течение более короткого времени.

Таким образом, оптимальными условиями пробоподготовки для количественного определения кумаринов в донника лекарственного траве является двукратная экстракция по 30 мин спиртом этиловым 50% на кипящей водяной бане с обратным холодильником: экстрактивные вещества - 36%, свободный кумарин - 0,64%, кумарин после гидролиза - 0,92%.

Рис.2. Хроматограмма водно-спиртового извлечения донника лекарственного травы

0.26

0.24

0.22

0.20

О.

0.

0.

0.

0.

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00-

Рис. 3. Хроматограмма гидролизата водно-спиртового извлечения донника лекарственного травы

Таблица 1. Результаты идентификации кумаринов и кумаровых кислот донника лекарственного травы в сравнении с аутентичными образцами

Название компонента Время удерживания компонента на хроматограмме извлечения (рис. 2), мин Время удерживания компонента на хроматограмме гидролизата (рис. 3), мин

Гликозид кумарина 11,629 Не обнаружен

Мелилотовая кислота 15,222 15,281

О-кумаровая кислота 16,296 16,369

Кумарин 19,579 19,651

Скополетин - -

Умбеллиферон - -

Примечание. «-» - не обнаружен.

20.00

Мп^е

Таблица 2. Влияние условий экстракции на степень извлечения кумарина из донника лекарственного травы

Экстрагент Способ экстракции, время, мин Свободный кумарин, % Кумарин после гидролиза, % Экстрактивные вещества, %

Метанол УЗ 60 ПУ 30 0,63±0,03 0,33±0,02

ПУ 120 Баня 30 0,50±0,03 0,66±0,04 0,82±0,04 32,1±2,6

Баня 60 0,66±0,03

Баня 90 0,65±0,03

Этанол 96% УЗ 60 ПУ 30 0,62±0,03 0,28±0,02

ПУ 120 Баня 30 0,45±0,02 0,60±0,03 0,83±0,04 26,7±1,9

Баня 60 0,65±0,03

Баня 90 0,65±0,03

Этанол 80% УЗ 60 ПУ 30 0,65±0,03 0,65±0,03

ПУ 120 Баня 30 0,67±0,04 0,66±0,03 0,91±0,05 34,5±2,4

Баня 60 0,66±0,03

Баня 90 0,67±0,03

Этанол 60% УЗ 30 УЗ 60 0,64±0,03 0,64±0,03

ПУ 30 ПУ 120 0,63±0,03 0,64±0,03 0,91±0,04 37,4±2,2

Баня 30 0,64±0,03

Баня 60 0,64±0,03

Спирт 50% УЗ 60 ПУ 30 0,62±0,03 0,64±0,03

ПУ 60 ПУ 120 0,64±0,03 0,64±0,03 0,92±0,05 36,0±1,8

Баня 30 0,63±0,03

Баня 60 0,64±0,03

Этанол 40% УЗ 60 ПУ 30 0,66±0,03 0,69±0,04

ПУ 120 Баня 30 0,75±0,04 0,67±0,03 0,86±0,03 36,0±2,0

Баня 60 0,74±0,04

Баня 90 0,72±0,04

Далее проведена оценка валидности разработанной аналитической методики.

Специфичность методики оценивали по следующим критериям:

- основной пик (кумарин) на хроматограммах извлечения до и после гидролиза должен быть «спектрально чист», спектр должен соответствовать спектру стандартного образца кумарина;

- времена удерживания основного пика на хроматограммах гидролизата и стандартного раствора кумарина должны совпадать;

- изменение режима элюирования и геометрии колонки не должно вызывать различий в хроматографической подвижности основного пика на хроматограммах извлечения, гидролизата и стандартного раствора кумарина.

Оценку линейности проводили по графику зависимости площадей пика кумарина от концентрации и графику зависимости экспериментальных значений площадей пика кумарина от значений, полученных по уравнению линейной регрессии. Использовали калибровочные растворы кумарина с концентрациями, соответствующими содержанию кумарина в сырье от 0,1 до 3%.

Правильность, устойчивость и повторяемость методики оценивали, используя способ «введено -найдено». В навески растительного сырья вводили расчетные количества стандартного раствора кумарина.

Повторяемость методики исследовали на трех уровнях диапазона применения методики - 50, 100, 150% от фактического содержания кумарина в образце сырья. Относительное стандартное отклонение (Я8Б) рассчитывали для трех параллельных испытаний на каждом уровне.

В результате исследований было установлено, что открываемосгь методики составляет около 96%, коэффициент корреляции - 0,999, относительное стандартное отклонение в условиях повторяемости - менее 2%.

Методика достаточно устойчива к изменению температуры, времени и среды гидролиза, а также к изменениям условий хроматографирования (колонка, режим элюирования). Гидролизаты стабильны в течение не менее суток.

В ходе дальнейшего исследования проведен анализ образцов донника лекарственного травы, заготовленного в шести районах Алтайского края по разработанной методике.

Установлено, что суммарное содержание свободного и связанного кумарина в растительном сырье составляет от 0,4 до 1,5% (табл. 3).

Таблица 3. Содержание кумарина в образцах донника лекарственного травы в пересчете на абсолютно сухое сырье, %

Место сбора Сумма кумаринов Свободный кумарин Связанный кумарин

Бийский район 1,48±0,04 0,40±0,02 1,08±0,04

Красногорский район 1,23±0,06 0,50±0,02 0,73±0,03

Алтайский район 1,09±0,05 0,25±0,01 0,84±0,04

Зональный район 0,40±0,02 0,28±0,01 0,12±0,01

Завьяловский район 1,00±0,05 0,70±0,02 0,30±0,01

Мамонтовский район 0,84±0,03 0,56±0,02 0,28±0,01

Выводы

1. Проведена оценка приемлемости групповых спектрофотометрических методов для определения кумарина в траве донника лекарственного. Установлена их низкая специфичность по отношению к объекту исследований.

2. Разработана методика количественного определения суммы кумаринов в донника лекарственного траве методом ВЭЖХ после предварительного кислотного гидролиза.

3. Проведена валидация аналитической методики. Установлено, что в диапазоне содержания кумарина в сырье от 0,1 до 3% линейность, правильность, воспроизводимость методики не выходят за пределы приемлемых значений. Методика специфична и позволяет с достаточной степенью достоверности устанавливать содержание кумарина в образце в присутствии сопутствующих и балластных веществ. Методика устойчива - незначительные изменения параметров пробоподготовки и условий хроматографирования не оказывают влияния на результат анализа.

4. По разработанной методике выполнен анализ образцов сырья, заготовленного в шести районах Алтайского края.

Список литературы

1. МаксютинаН.П., Комисаренко Н.Ф., Прокопенко А.П. Растительные лекарственные средства. Киев, 1985. 280 с.

2. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.

3. Орлов Ю.Е. Полярография кумаринов // Успехи химии. 1977. Т. XLVI, вып. 7. С. 1303-1333.

4. European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use. Melilotus officinalis (L.) Lam., herba. Assessment report for the development of community monographs and for inclusion of herbal substance(s), preparation(s) or combinations thereof in the list / Doc. Ref. EMEA/HMPC354183/2007. London, 2008. 38 c.

5. Минина C.A., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов. М., 2009. 560 с.

6. Akeson W.R., Gorz H.J., Haskins F.A. Effect of Genotype and Growth Stage on Distribution of Melilotic Acid, o-Coumaric Acid, and Cournarinic Acid in Melilotus alba Desr. // Published in Crop Science. 1963. Vol. 3, N2. Pp. 167-171.

7. Martino E., Ramaiola I., Urbano M., Bracco F., Collina S. Microwave-assisted extraction of coumarin and related compounds from Melilotus officinalis (L.) Pallas as an alternative to Soxhlet and ultrasound-assisted extraction // Journal of chromatography A. 2006. N1125. Pp. 147-151.

8. Guerrero-Rodrigues J.D. Growth and nutritive value of Lucerne (Medicago sativa L.) and Melilotus (Melilotus albus Medik) under saline conditions. Australia, 2006. 158 p.

9. ГОСТ 14101. Трава донника. М., 1969. 4 с.

10. Suhail A.M., Mohtasheem M., Igbal A., Ahmed S.W., Bano H. Chemical constituents from Melilotus officinalis // Basic and Applied Sciences. 2008. Vol. 4, N2. Pp. 89-94.

11. Фармакопея США: USP 29; Национальный формуляр: NF 24. М., 2009. T. 2. С. 2929-2933.

Поступило в редакцию 20 июля 2011 г.

После переработки 2 марта 2012 г.

Fedoseeva L.M.*, Harlampovich T.A. DEVELOPMENT OF THE METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF COUMARIN IN MELILOTUS OFFICINALIS L.

Altai State Medical University, st. Lenina, 40, Barnaul, 656038 (Russia), e-mail: ludmila@agmu.ru

The method describes the qualitative determination of total coumarin in Melilotus officinalis. The essence of method is HPLC determination of coumarin after acid hydrolysis of water-alcohol extraction. The efficiency of the method is confirmed by validation.

Keywords: Melilotus officinalis, coumarin, melilotozid, HPLC, hydrolysis.

References

1. Maksiutina N.P., Komisarenko N.F., Prokopenko A.P. Rastitel’nye lekarstvennye sredstva. [Herbal Remedies]. Kiev, 1985. 280 p. (in Russ.)

2. Grinkevich N.I., Safronich L.N. Khimicheskii analiz lekarstvennykh rastenii. [Chemical analysis of medicinal plants]. Moscow, 1983. 176 p. (in Russ.)

3. Orlov Iu.E. Uspekhi khimii, 1977, Vol. XLVI, no. 7, pp. 1303-1333. (in Russ.)

4. European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use. Melilotus officinalis (L.) Lam., herba. Assessment report for the development of community monographs and for inclusion of herbal substance(s), preparation(s) or combinations thereof in the list / Doc. Ref. EMEA/HMPC354183/2007. London, 2008. 38 c.

5. Minina S.A., Kaukhova I.E. Khimiia i tekhnologiia fitopreparatov. [Chemistry and Technology of herbal medicines]. Moscow, 2009, 560 p. (in Russ.)

6. Walter R., Akeson H., Gorz J., Haskins F.A. Published in Crop Science, 1963, vol. 3, no. 2, pp. 167-171.

7. Martino E., Ramaiola I., Urbano M., Bracco F., Collina S. Journal of chromatography A, 2006, no. 1125, pp. 147-151.

8. Guerrero-Rodrigues J.D. Growth and nutritive value of Lucerne (Medicago sativa L.) and Melilotus (Melilotus albus Medik) under saline conditions. Australia, 2006. 158 p.

9. GOST 14101. Trava donnika. [GOST 14101. Grass clover]. Moscow, 1969, 4 p. (in Russ.)

10. Suhail A.M., Mohtasheem M., Igbal A., Ahmed S.W., Bano H. Basic and Applied Sciences, 2008, vol. 4, no. 2, pp. 89-94.

11. Farmakopeia USA: USP 29; Natsional'nyi formuliar: NF 24. [USP 29, NF 24]. Moscow, 2009, vol. 2, pp. 2929-2933. (in Russ.)

Received July 29, 2011 Revised 2 March, 2012

* Corresponding autor.