CC BY
170
УДК 615.074,615.072
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ МАНЖЕТКИ ОБЫКНОВЕННОЙ ДШЕМШ твДВ/П. Б.1.
Ж.С. Лесовая Д.И. Писарев О.О. Новиков ТА Романова
Белгородский
государственный
университет
e-mail:
zhannalesovaya@yandex.ru
В надземной части манжетки обыкновенной обнаружен богатый комплекс биологически активных веществ, среди которых преобладают фенольные соединения, а именно флавоноиды, которые, как известно, обладают широким спектром терапевтического эффекта. На основании этого в статье изложена методика оценки качества травы манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L.S.L. по флаво-ноидам.
Ключевые слова: трава манжетки обыкновенной, флавоноиды, кверцетин, лютеолин-7-гликозид (цинарозид).
Оценку качества травы манжетки обыкновенной предложено проводить по содержанию флавоноидов. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом УФ-спектрофотометрии в пересчете на кверцетин и лютеолин-7-гликозид (цинарозид). Наличие данных флавоноидов подтверждено также хроматографически и методом масс-спектроскопии.
Изучены условия извлечения флавоноидов из сырья последовательной сменой этанола 96%, 70% и 40% концентрации. Соотношение сырья и общего объема экстрагента 1:100, время трехкратного извлечения на кипящей водяной бане 90 минут.
Для расчета суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин оптическую плотность измеряли по собственному поглощению спиртового извлечения травы манжетки обыкновенной после гидролиза при длине волны 370 нм. Расчет суммы флавоноидов проводили с использованием оптической плотности раствора стандартного образца кверцетина. Относительная ошибка предложенной методики 1,77%. Содержание фла-воноидов в надземной части манжетки обыкновенной составляет 1,378%±0,03%.
Для расчета суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид измеряли оптическую плотность окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, при длине волны 400 нм. Расчет суммы флавоноидов проводили с использованием теоретического значения удельного показателя поглощения государственного стандартного образца лютеолина-7-гликозида (цинарозида). Относительная ошибка предложенной методики 3,88%. Содержание флавоноидов в траве манжетки обыкновенной составляет 2,492%±0,0б%.
Введение. Манжетка обыкновенная - многолетнее травянистое растение из семейства розоцветных (Rosaceae) с округло-сердцевидными мягко опушёнными коротко пальчато-лопастными листьями, складчато сложенными до распускания.
Ареал манжетки чрезвычайно обширен и охватывает все районы Европы, Африки и Азии, она обычна во всех областях Средней России.
В научной медицине России манжетка обыкновенная в настоящее время не применяется по причине отсутствия нормативной документации на сырьё, хотя в народной медицине с успехом используется при широком спектре заболеваний, в первую очередь женской половой сферы [2].
Для введения растения в список официально используемых, в первую очередь необходима разработка объективных методов количественной оценки действующих биологически активных веществ. Экспериментально установлено, что основным действующим началом манжетки обыкновенной является полифенольный комплекс и в первую очередь флавоноиды.
Целью настоящего исследования является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной с использованием метода УФ-спектрофотометрии.
Экспериментальная часть. В результате проведенных исследований нами было установлено, что максимум оптической плотности УФ-спектра собственного поглощения спиртового извлечения из травы манжетки после гидролиза совпадает с максимумом оптической плотности УФ-спектра раствора государственного стандартного образца кверцетина (рис. 1).
Для выбора оптимального режима экстрагирования травы манжетки обыкновенной нами сравнивались два метода экстракции:
1) с использованием этанола 70% концентрации (как наиболее универсального экстрагента для флавоноидов);
2) с последовательной сменой этанола 96%, 70% и 40% концентрации.
Расчеты показали, что при экстрагировании первым методом сумма флавоноидов в пересчете на кверцетин составила около 0,9%. Относительная погрешность единичного измерения - 2,68%.
При экстрагировании сырья вторым методом, с последовательной сменой спиртов различной концентрации, сумма флавоноидов в пересчете на кверцетин составила около 1,378%. Относительная погрешность единичного измерения - 1,77%.
Таким образом, наиболее оптимальным методом экстракции для травы манжетки оказался метод с последовательной сменой этанола 96%, 70% и 40% концентрации.
Методика получения спиртового извлечения из травы манжетки обыкновенной (метод экстракции с последовательной сменой этанола 96%, 70% и 40% концентрации). Точную навеску травы манжетки, измельченной до размера частиц 1-3 мм, около 1,0 г помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 30 мл 96% этанола, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане в течение 30 минут. Затем колбу охлаждали под струей воды до комнатной температуры и содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Затем указанным выше способом экстракцию повторяли поочередно 70% и 40% этанолом. Извлечения фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Объем фильтрата доводили до метки 96% спиртом. Полноту извлечения флавоноидов из сырья подтверждали отрицательной цианидиновой пробой.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной в пересчете на кверцетин. 10 мл полученного спиртового извлечения из сырья манжетки обыкновенной упаривали на водяной бане, остаток высушивали в сушильном шкафу при 110°С в течение 15 минут, затем растворяли в 10 мл 10% серной кислоты. Гидролиз вели в колбе, подсоединенной к обратному холодильнику, при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2 часов. В данных ус-
д
0.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Длина волны, нм
250
300
350
400
Рис. 1. УФ-спектры раствора ГСО кверцетина (1) и спиртового извлечения травы манжетки обыкновенной после гидролиза (2)
ловиях происходит гидролиз только 3-О-гликозидов, 7-О-гликозиды, как более устойчивые, гидролизу подвергаются в более жестких условиях. Затем колбу охлаждали до комнатной температуры и содержимое ее фильтровали через бумажный фильтр. Осадок, оставшийся на фильтре, промывали водой очищенной и растворяли в 100 мл горячего 96% этанола.
Аликвоту полученного раствора объемом 10 мл доводили до метки в колбе на 25 мл 96% спиртом этиловым и измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре Sf56 в диапазоне длин волн 250-450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин вели по формуле 1:
х 4 x СИІ x W x 100 (1)
4» x ñ x va ’
где Ах - оптическая плотность исследуемого раствора;
Сст - концентрация раствора стандартного образца кверцетина;
W - разведение, мл;
Аст - оптическая плотность раствора стандартного образца кверцетина;
Сх - концентрация исследуемого раствора;
Va - объем аликвоты, мл.
Результаты статистической обработки данных параллельных измерений показали, что содержание флавоноидов в траве манжетки обыкновенной в пересчете на кверцетин составило 1,378%±0,02438%, ошибка единичного определения при доверительной вероятности 98% составила 1,77% (табл. 1).
Таблица 1
Результаты количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки обыкновенной в пересчете на кверцетин
X (%) X - X,. (X - X, )2 Метрологические характеристики
1,300 0,078 0,006084 X = 1,378% £( X - X )2 = 0,001809 „ _ IZ(X-X,)2_ 0,007765 x \ n(n -1)
1,358 0,02 0,0004
1,372 0,006 0,000036
1,436 -0,058 0,003364 AX = Sx ■ tx = 0,02438
1,401 -0,023 0,000529 є = 1,77%
1,399 -0,021 0,000441
Х=1,378 2=0,001809
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки в пересчете на лютеолин-7-гликозид (цинарозид). В основу количественного определения флавоноидов в сырье в пересчёте на лютеолин-7-гликозид положен метод спектрофотометрического анализа в непосредственном извлечении из сырья, основанный на химическом взаимодействии флавоноидов с алюминия хлоридом безводным в среде кислоты хлористоводородной разведённой с образованием окрашенных продуктов - хелатных комплексов. При этом максимум поглощения первой полосы смещается на 35-50 нм к видимой области (батохромный сдвиг), по сравнению с исходным флавоноидом. При добавлении кислоты хлористоводородной нестабильные комплексы в орто-дигидроксигруппах разрушаются, а комплексы между карбонильной группой при С4 и гидроксильными группами при С3 и С5 сохраняются.
У спиртовых извлечений из исследуемых образцов максимум поглощения при добавлении AЮlз+НСl находился при 400 нм (рис. 2).
Рис. 2. УФ-спектр комплекса спиртового извлечения из травы манжетки обыкновенной с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида
Аналогичный максимум поглощения отмечен для комплекса ГСО лютеолин-7-гликозида (цинарозида).
5 мл спиртового извлечения из травы манжетки помещали в колбу на 25 мл, прибавляли 5 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида и 2-3 капли разведенной соляной кислоты. Объем смеси доводили до метки 96% спиртом этиловым. Время прохождения реакции комплексообразования в защищенном от света месте 45 минут.
Для приготовления раствора сравнения в колбу вместимостью 25 мл помещали 5 мл спиртового извлечения из травы манжетки, 2-3 капли разведенной соляной кислоты и доводили объем до метки 96% этанолом.
С целью пересчета содержания суммы флавоноидов на цинарозид использован удельный показатель поглощения, заимствованный из литературных источников. Согласно найденным данным удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО цинарозида с алюминия хлоридом при аналитической длине волны 400 нм составляет 145,0±2,3. На этом основании в формулу расчета включено теоретическое значение Е1%1см = 145 [1].
Расчет вели по формуле 2:
^ Ах х Ж х Ж2 _
X = —^--------- , (2)
Е% х т х ¥а
где Ах - оптическая плотность исследуемого раствора;
W, 2 - разведения, мл;
Е1%1см - удельный показатель поглощения стандартного раствора цинарозида;
m - масса навески исследуемого сырья, г;
Va - объем аликвоты, мл.
Статистическая обработка данных параллельных измерений показала, что сумма флавоноидов в траве манжетки обыкновенной в пересчете на лютеолин-7-гликозид 2,492%±о,о6%. Ошибка единичного измерения равна 3,88% (табл. 2).
Таблица 2
Результаты количественного определения суммы флавоноидов
в траве манжетки обыкновенной в пересчете на лютеолин-7-гликозид
X (%) X - X, (X - X,)2 Метрологические характеристики
2,395 0,097 0,009409 X = 2,492% £ (X - X )2 = 0,028473
2,517 -0,025 0,000625
2,490 0,002 0,000004 0 IX (X - X, )2 0,030807 х \ п(п-1) = 0,096735 е = 3,88%
2,601 -0,109 0,011881
2,419 0,073 0,005329
2,527 -0,035 0,001225
Х=2,492 2=0,028473
Выводы. 1. Проанализированы методы экстракции травы манжетки. В качестве наиболее оптимального метода для данного вида сырья выбран метод экстракции с последовательной сменой этанола 96%, 70% и 40% концентрации.
2. Предложена методика дифференциального количественного определения 7-О-гликозидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид (относительная ошибка определения при доверительной вероятности 98% составляет 3,88%) и 3-О-гликозидов в пересчете на кверцетин (относительная ошибка определения при доверительной вероятности 98% составляет 1,77%) после кислотного гидролиза, что позволяет наиболее полно определить содержание флавоноидов в сырье. Общая сумма флавоноидов по результатам данной методики составила 3,87%±0,1%.
Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., государственный контракт №П425 от 12.05.2010 г.
1. Андреева, В.Ю. Разработка методики количественного определения флавоноидов в манжетке обыкновенной Alchemilla Vulgaris L.S.L./ В.Ю. Андреева, Г.И. Калинкина // Химия растительного сырья. - 2000. - №1. - С. 85-88.
2. Дикорастущие полезные растения России / Отв.ред. А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. -СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. - 663 с.
Литература
DEVELOPMENT OF METHODS OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN ALCHEMILLA VUIGARISLSL
Zh. S. Lesovaya D. I. Pisarev O. O. Novikov TA Romanova
In the overground part of Alchemilla Vulgaris LSL a rich complex of biologically active substances was found, which are dominated by phenolic compounds, namely flavonoids, which are known to possess a wide range of therapeutic effect. On the basis of this article the technique of assessing the quality of herb of Alchemilla vulgaris LSL by flavonoids.
