CC BY
104
УДК 615:577.127.4:665.527.92
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ДЕВЯСИЛА БРИТАНСКОГО
А. В. Яницкая, И. Ю. Митрофанова
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии и ботаники
Проанализированы различные методы экстракции травы девясила британского и как наиболее оптимальный для данного вида сырья выбран метод экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), который позволяет наиболее полно извлекать флавоноиды. Предложена методика, которая позволяет определять содержание суммы флавоноидов (в пересчете на лютеолин) в траве девясила британского в присутствии других соединений, проста в исполнении и не требует дорогостоящей аппаратуры. Полученные данные свидетельствуют, что содержание флавоноидов в траве девясила британского, произрастающего в Волгоградской области, по результатам данной методики, составляет (0,94 ± 0,003) %. Проведенная валидационная оценка свидетельствует о ее пригодности для контроля качества исследуемого сырья.
Ключевые слова: флавоноиды, девясил британский, лютеолин, спектрофотометрия.
DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE METHOD OF FLAVONOIDDETERMINATION IN INULA BRITANNICA HERB
A. V. Yanitskaya, I. Yu. Mitrofanova
Different extraction methods were analyzed. Extraction with ethanol gradual alternation was chosen as more optimal. A technique of quantifying the flavonoids equivalent to luteolin in Inula britannica herb was suggested. It allows a determination of the flavonoid quantitative order in the presence of other compounds; it does not require any expensive equipment, and it is simple in use. The flavonoid content in Inula britannica herb, which grows in the Volgograd region, was (0,94 ± 0,003) %. Validation proved that the proposed technique can be used for quality control of studied herbal raw material.
Key words: flavonoids, Inula britannica, luteolin, spectrophotometry.
Девясил британский (Inula britannica L) сем. астровые (Asteraceae) — двулетнее или многолетнее травянистое растение от 15 до 75 см в высоту [7]. Стебель прямостоячий, ребристый, простой или в верхней части ветвистый, в нижней иногда красноватый, густо покрыт прижатыми волосками [9]. Листья ланцетные, эллиптические, острые, цельнокрайние или рассеянно-мелкозубчатые, по краям с короткими шипиками, сверху голые или рассеянно-волосистые, снизу — густо-мелкожелезистые и мягко-шерстистые от прижатых волосков. Нижние листья длинночерешковые, средние и верхние — сидячие, с сердцевидным стеблеобъемлющим основанием [8]. Цветочные корзинки золотисто-желтые, гетерогамные, от средних до крупных (2—5 см в поперечнике), одиночные или собраны по 2—3. Основу корзинки образует общее цветоложе, которое окружено оберткой из видоизмененных верховых листьев. Индивидуальные цветки окружены хохолком из тонких волосков [7]. Ложноязычковые цветки трехзубчатые. Язычки и зубчики трубчатых цветков снаружи густо покрыты золотистыми железками [9]. Плод — голая ребристая семянка цилиндрической формы светло-коричневого цвета с хохолком [6, 7].
В России распространен на юге европейской части, на Северном Кавказе и в Западной Сибири. В Средней России встречается в черноземной полосе [6].
Надземная часть девясила британского содержит 0,008—0,1 % эфирного масла, в состав которого вхо-
дят сесквитерпены, а также сапонины, алкалоиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины (эскулетин, скопо-летин), флавоноиды, тритерпеноиды, стероиды (р-реза-стерол, у-тараксастерол, стигмастерол) [4].
Девясил британский используется в традиционной китайской медицине в форме настоя надземной части или цветков как отхаркивающее средство [9]. В монгольской медицине трава применяется как тонизирующее, общеукрепляющее, повышающее сопротивляемость организма, стимулирующее обмен веществ; листья и соцветия — при перитоните, головной боли, симптомах нарушения мозгового кровообращения, сильном переутомлении. В тибетской медицине надземная часть находит применение при желудочных коликах, злокачественных опухолях; соцветия — при пневмониях, а также в составе сбора — при сухом кашле, подагре, атеросклерозе, ревматизме, тахикардии, нефрите. Сок из свежесобранных растений обладает противокашлевым, местным ранозаживляющим свойствами; экстракт, эфирное масло — антибактериальными свойствами [4].
Однако в нашей стране из-за отсутствия соответствующих нормативных документов девясил британский не является официнальным растением и не используется в достаточной мере, что делает его приоритетным для фармакогностического изучения и включения в число официнальных лекарственных растений.
Выпуск 1 (45). 2013
119
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского (Inula britannica L), произрастающего в Волгоградской области, методом дифференциальной спектрофотометрии и позволяющей проводить оценку качества сырья.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования выступала трава девясила британского, заготовленная в фазу полного цветения (июль-август 2010) от дикорастущих популяций во Фро-ловском районе Волгоградской области. Все использованные в работе реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
В основу количественного определения флавоноидов в сырье положен метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на способности флавонои-дов образовывать окрашенные хелатные комплексы со спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлороводородной разведенной. При этом максимум поглощения первой полосы смещается на 35— 50 нм к видимой области по сравнению с исходным флавоноидом и основной максимум поглощения отмечается в диапазоне длин волн 390—410 нм [3].
Для выбора оптимального режима экстрагирования травы девясила британского спиртовые извлечения получали методом экстракции с последовательной сменой этанола 96 %, 70 % и 40 % концентрации и с использованием этанола 70%-й концентрации (как наиболее универсального экстрагента для флавонои-дов). Точную навеску измельченной до размера частиц 1—3 мм травы девясила британского около 1,0 г помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 30 мл 96%-го этанола, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждали под струей воды до комнатной температуры и содержимое фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли дважды поочередно 70%-м и 40%-м этанолом. Извлечения фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Объем фильтрата доводили до метки 96%-м спиртом. Полноту извлечения флавоноидов из сырья подтверждали по отрицательной цианидиновой пробе со шротом [3]. Аналогично получали извлечения с использованием 70%-го этанола [2].
Аликвоты полученных растворов объемом 5 мл помещали в колбы на 25 мл, прибавляли 5 мл 5%-го спиртового раствора алюминия хлорида и 2—3 капли разведенной соляной кислоты. Объем смесей доводили до метки 96%-м или 70%-м спиртом этиловым соответственно и оставляли для прохождения реакции комплексообразования в защищенном от света месте 45 мин.
Оптическую плотность продуктов взаимодействия спиртовых извлечений из сырья девясила британского с 5%-м спиртовым раствором алюминия хло-
рида в среде кислоты хлористоводородной разведенной измеряли на спектрофотометре Solar PV 1251 С при длине волны Xmax = 353 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин вели по формуле:
_ 4 • W • W2
Х Е1%1см ■ m • Va '
где Ах—оптическая плотность исследуемого раствора;
W1, W2 — разведения, мл;
Е1 %1см — Государственный стандартный образец (ГСО) лютеолина с алюминия хлоридом при X = 353 нм (400);
m — масса навески исследуемого сырья, г;
Va — объем аликвоты, мл [3].
Статистическая обработка результатов химического эксперимента проводилась согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» и включала проверку однородности выборки, с последующим вычислением базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды, с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) и Excel 2000 (MS Office 2000, США). Валидация методики количественного определения флавоноидов в траве девясила британского выполнялась в соответствии с рекомендациями [1] по следующим характеристикам: правильность, прецизионность, специфичность, линейность, аналитическая область (диапазон применения). Поскольку валидируемая методика проводится в легко контролируемых условиях анализа, то не было необходимости определять ее устойчивость.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований нами было установлено, что максимум оптической плотности ультрафиолетового спектра поглощения продуктов взаимодействия спиртовых извлечений из исследуемых образцов сырья, полученных как методом экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), так и с использованием этанола 70%-й концентрации, с 5%-м спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлористоводородной разведенной находится Xmax = 353 нм и близок к спектральным характеристикам УФ-спектра раствора государственного стандартного образца лютеолина* — 5, 7, 3', 4'-тетрагидрок-сифлавон. На основании полученных результатов оценку суммарного содержания флавоноидов производили в пересчет на лютеолин и использовали удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО лютео-
* лютеолин имеет максимум поглощения при 360 нм.
120
Выпуск 1 (45). 2013
лина с алюминия хлоридом, который, согласно литературным данным, при аналитической длине волны 353 нм равен Е1 %1см = 400,0 [5].
Проверку однородности выборки и идентификацию вариант, отягощенных грубыми ошибками, осуществляли исходя из размаха варьирования. Рассчитанные значения контрольного критерия (Q) не превышали соответствующие табличные ^табл (95 %; 6) с доверительной вероятностью P = 95 %. Следовательно, ни одна из вариант не отягощена грубой ошибкой, то есть выборка считалась однородной и статистические характеристики методики соответственно были признаны достоверными (табл.).
Результаты определения суммы флавоноидов в траве девясила британского
№ серии Оптическая плотность (А) Содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин (Х), % Метрологи- ческие характе- ристики
экстракция с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %)
1 0,751 0,939 Хср = 0,938 S = 0,005 Sx = 0,002 Ах = 0,003 е, % = 0,23 е едюпр^ % = 0,59
2 0,748 0,935
3 0,745 0,932
4 0,747 0,934
5 0,753 0,942
6 0,756 0,945
X? 0,750 0,938
экстракция с использованием этанола 70%-й концентрации
1 0,657 0,822 Хср = 0,83 S = 0,009 Sx = 0,004 Ах = 0,004 е, % = 0,45 е едюпр^ % = 1,17
2 0,669 0,837
3 0,651 0,814
4 0,657 0,822
5 0,668 0,835
6 0,659 0,824
X? 0,661 0,826
Содержание флавоноидов в пересчете на лю-теолин в извлечениях из травы девясила британского, полученных методом экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), составила (0,94 ± 0,003) %, в извлечениях, полученных с использованием этанола 70%-й концентрации, — (0,83 ± 0,004) %.
По результатам метрологического анализа методики установлено, дисперсия результатов количественного определения флавоноидов в сырье девясила британского составляет S2 = 0,002 и S2 = 0,004, что свидетельствует о воспроизводимости результатов анализа. Величина стандартного отклонения (S = 0,005 и S = 0,009) характеризует разброс вариант вокруг среднего и является оценкой соответствующей случайной ошибки, относительная ошибка составляет 0,23 и 0,45 % и не превышает допустимого значения 5 %. Ошибка единичного измерения равна 0,59 и 1,17 % соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проанализированы различные методы экстракции травы девясила британского и как наиболее оптимальный для данного вида сырья выбран метод экстракции с последовательной сменой этанола (96 %, 70 % и 40 %), который позволяет наиболее полно извлекать флавоноиды. Предложена методика, которая позволяет определять содержание суммы флавоноидов (в пересчете на лютеолин) в траве девясила британского в присутствии других соединений, она проста в исполнении и не требует дорогостоящей аппаратуры. Полученные данные свидетельствуют, что содержание флавоноидов в траве девясила британского, произрастающего в Волгоградской области, по результатам данной методики составляет (0,94 ± 0,003) %. Проведенная валидационная оценка свидетельствует о ее пригодности для контроля качества исследуемого сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГОСТ РИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецезионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. — М.: Изд-во стандартов, 2002.
2. ЛесоваяЖ. С., Писарев Д. И., Новиков О. О. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина и фармация. — 2010. — № 12/2. — С. 150—154.
3. Лесовая Ж. С., Писарев Д. И., Новиков О. О., Романова Т. А. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина и фармация. — 2010. — № 12/2. — С. 145—149.
4. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositeae). — СПб.: Наука, 1993. — 352 с.
5. Сампиев А. М., Никифорова Е. Б., Хочава М. Р. // Кубанский научный медицинский вестник. — 2006. — № 12. — С. 106—110.
6. Флора Европейской части СССР.: Asteraceae (Compositae) / Сост. Н. Н. Цвелев — СПб.: Наука, 1994. — Т 7. — 317 с.
7. Kobayashi T. Preventative effects of the flowers of Inula britannica on autoimmune diabetes in C57BL/KsJ mice induced by multiple low doses of streptozotocin / T Kobayashi, Q. H. Song, T Hong, H. Kitamura, J. C. Cyong // Phytoth. Res. — 2002. — № 16. — P 377—382.
8. Monograph on Inula britannica L. / A. L. Khan,
S. A. Gilani, Y. Fujii, K. N. Watanabe — Tokyo, Japan: Mimatsu Corporation. 2008. — P 21.
9. Park E. J. Cytotoxic sesquiterpene lactones from Inula Britannica / E. J. Park, J. Kim // Planta Med. — 1998. — № 64. — P 752—754.
10. Song Q. H., Kobayashi T., Hong T., Cyong J. C. // Am. J. Chin. Med. — 2002. — № 30. — P 297—305.
Контактная информация
Митрофанова Ирина Юрьевна — старший преподаватель кафедры фармакогнозии и ботаники, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: I.U.Mitrofanova@yandex.ru
Выпуск 1 (45). 2013
121
