CC BY
158
УДК 581+542
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В траве единвоед рдятояд
В статье изложены данные по разработке методики количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в траве галинзоги мелкоцветковой (Galinsoga рагуіНога) семейства сложноцветные (Compositae), которая в народной медицине применяется как ранозаживляющее, гемостатическое, гипотензивное средство. Снят электронный спектр водноспиртового извлечения из травы галинзоги мелкоцветковой. Установлены оптимальные параметры проведения экстракции для количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в изучаемом растительном сырье: дисперсность сырья, природа экстрагента, время экстракции. Проведена валидация разработанной методики по следующим характеристикам: линейность, повторяемость, воспроизводимость, правильность.
Ключевые слова: Galinsoga рагуіНога, сложноцветные, гидроксикоричные кислоты, хлорогеновая кислота, экстракция, валидация
Введение.
В настоящее время в медицинской практике активно применяются фармацевтические препараты, полученные из лекарственного растительного сырья. Это связано с рядом преимуществ лекарственных средств природного происхождения перед синтетическими, в частности, с широким спектром терапевтического действия и низкой токсичностью [і]. Помимо дополнительного изучения фармакопейных растений и их разновидностей, стремительно возрастает интерес к растительному сырью, ранее используемому лишь в народной медицине. Объектом нашего исследования была выбрана трава галинзоги мелкоцветковой (Galinsoga parviflora) семейства сложноцветные (Compositae), которая в народной медицине применяется как ранозаживляющее, гемомтатическое, гипотензивное средство.
Ранее в наших исследованиях [2] методом ВЭЖХ в траве галинзоги мелкоцветковой (Galinsoga parviflora), были идентифицированы гидроксикоричные кислоты, в числе которых, кислота хлорогеновая. Гидроксикоричные кислоты обладают сильными антиоксидантными, антивирусными, антибактериальными и антигрибковыми свойствами, проявляет гипоглике-мическое, гипохолестеринемическое, противораковое и гепатопротекторное действие. Установлены ее пребиотические свойства [3].
Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения гидроксикоричных кислот в траве галинзоги и демонстрация ее пригодности для применения по назначению.
Объекты и методы.
Для разработки методики количественного определения гидроксикоричных кислот использовали воздушно-сухое сырье - траву галинзоги мелкоцветковой, собранную на территории Воронежской области в период массового цветения растения. В основе метода количественного определения гидроксикоричных кислот положен метод прямой спектрофотометрии [4].
Полученные данные обрабатывали статистически посредством электронных таблиц «Microsoft Excel»: вычисляли средние арифметические, стандартное отклонение.
Валидацию проводили по линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности методики [5-7].
Результаты и их обсуждение.
На первом этапе исследования по описанной методике был снят электронный спектр поглощения водно-спиртового извлечения из травы галинзоги мелкоцветковой в диапазоне длин волн 250-350 нм (рис. 1).
B.Н.БУБЕНЧИКОВА 11
C.А.БОЕВА 21
Курский государственный медицинский университет
Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко
е-таИ:/д.кзти@таИ.ги
0 0,65 и 0,6 -0,55 -0,5 -0,45 -0,4 -0,35 -0,3 -
230 250 270 290 310 330 350 370
А, нм
Рис. 1. Спектр 70% этанольного извлечения из травы галинзоги мелкоцветковой.
На рис. 1 отчетливо наблюдаются максимум поглощения при X = 330 нм и «плечо» в области 290-310 нм, соответствующие сопряженным -СН=СН-связям в ароматических циклах гидроксикоричных кислот. Далее, при разработке методики использовали значения оптических плотностей при длине волны 330 нм, что соответствует максимуму поглощения хлороге-новой кислоты, поэтому расчет содержания гидроксикоричных кислот проводили в пересчете на хлорогеновую кислоту. Использовали удельный показатель поглощения, значение которого для хлорогеновой кислоты 504,425.
На следующем этапе исследования определяли условия проведения экстракции. Для этого изучали влияние дисперсности сырья, природы экстрагента и времени экстрагирования на полноту извлечения суммы гидроксикоричных кислот.
Траву галинзоги мелкоцветковой измельчали, просеивали через сита, брали навески с размерами частиц менее 2 мм, 1 мм, 0,5 мм. Влажность сырья составила 13%.
Х, % 4,6 -
4.4 -
4.2 -4 -
3,8 -
3,6 -
3.4 -
3.2 -3 -0
Рис. 2. Влияние степени измельчения сырья на полноту извлечения гидроксикоричных кислот
В результате можно отметить, что наибольшего выхода гидроксикоричных кислот из растения (4,43±0,13% в пересчете на хлорогеновую кислоту) можно добиться, используя сырье с диаметром частиц менее 0,5 мм, так как при большем измельчении сырья увеличивается поверхность соприкосновения фаз «растительный материал - экстрагент» (рис. 2).
Изучение влияния концентрации экстрагента (спирта этилового 30%, 50%; 70% и 96%) на полноту извлечения гидроксикоричных кислот показало, что у водно-спиртовых растворов с увеличением содержания спирта этилового экстрагирующая способность улучшается: выход гидроксикоричных кислот при экстракции 70% раствора спирта этилового составил 4,41±0,04%; использование спирта этилового 96% не обеспечило хорошего набухания сырья, уменьшило проникновение экстрагента внутрь клеток сырья и десорбцию извлекаемых ве-
0,5
1,5
2,5
^ мм
1
2
ществ: содержание суммы гидроксикоричных кислот составило лишь 1,27±0,05%, поэтому применение спирта этилового 96% в качестве экстрагента нецелесообразно (рис. 3).
20
40
60
80 100 С этанола, %
Рис. 3. Влияние природы экстрагента на полноту извлечения гидроксикоричных кислоты
1
0
Для установления оптимального времени экстракцию сырья проводили в течение 15, 30, 45, 60 минут до наступления равновесия.
Результат эксперимента показал, что динамическое равновесие в системе «сырье-экстрагент» наступает после 30 минут экстрагирования (выход гидроксикоричных кислот 4,43±0,13%) (рис. 4), и при дальнейшем нагревании общая картина выхода извлекаемых веществ не меняется. Так как гидроксикоричные кислот имеют небольшую молекулярную массу, они быстрее диффундируют, чем высокомолекулярные вещества, следовательно, при дальнейшей экстракции в вытяжку будут экстрагироваться балластные вещества, что приведет к ухудшению качества экстракта.
Х, % 4,5 -|
4 -
3.5 -3 -
2.5 -2 -
10 20 30 40 50 60
^ мин
Рис. 4. Влияние времени экстракции на полноту извлечения гидроксикоричных кислоты
Таким образом, для определения количественного содержания суммы гидроксикорич-ных кислот в траве галинзоги мелкоцветковой были подобраны следующие условия: степень измельчения сырья с диаметром частиц не более 0,5 мм, экстрагент - 70% спирт этиловый, время экстракции - 30 минут.
Валидацию разработанной методики проводили по следующим показателям: линейность, повторяемость, воспроизводимость, правильность.
Для проверки линейности брали 6 экспериментальных точек: взвешивали отдельные навески, массой от 0,7 до 1,2 г (т.н.), и готовили из них извлечнгия соответствующих концентраций.
й 0,8 -| 0,75 -0,7 -0,65 -0,6 -0,55 -0,5 -0,45 -0,4 -
0,7
0,8
0,9
1,1
1,2 1,3
т, г
Рис. 5. Зависимость оптической плотности полученных извлечений от концентрации гидроксикоричных кислот
На рис. 5 представлена зависимость значения оптической плотности полученных извлечений от содержания хлорогеновой кислоты в навеске сырья. Коэффициент корреляции, который является главным критерием приемлемости линейности, составил 0,9908, что близко к единице. Значит, наши результаты можно описать прямой, т.е. в пределах диапазона «масса навески 0,7-1,2 г» оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации хло-рогеновой кислоты в пробе.
При установлении повторяемости проводили 6 параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного отклонения (Б) и относительного стандартного отклонения (Б отн) (табл. 1). Относительное стандартное отклонение составило 8,55% (не более 10%), что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.
Воспроизводимость определяли 2 аналитика на 3 образцах в 3 повторностях. Относительное стандартное отклонение составило 8,71% - для первого образца, 7,05% - для второго образца, 11,25% - для третьего образца, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях воспроизводимости (табл. 2-4).
Таблица 1
Определение повторяемости разработанной методики
Х Л І2 82 8 АХ 8отн
1 3,64 0,22 0,047669 0,01698 0,13031 0,33 8,55
2 3,81 0,05 0,002336
3 3,9 -0,04 0,001736
4 3,84 0,02 0,000336
5 3,94 -0,08 0,006669
6 4,02 -0,16 0,026136
3,858333 0,084883
Таблица 2
Определение воспроизводимости разработанной методики (1 образец)
Х Л і2 82 8 АХ Sотн
1 3,64 0,03 0,001111 0,01559 0,12486 0,32 8,71 1 аналитик
2 3,81 -0,14 0,018678
3 3,84 -0,17 0,027778
4 3,53 0,14 0,020544 2 аналитик
5 3,58 0,09 0,008711
6 3,64 0,03 0,001111
3,673333 0,077933
Таблица з
Определение воспроизводимости разработанной методики (2 образец)
Х di di2 S2 S AX Sarn
1 З,бЗ 0,0б 0,00з6 0,010Бб 0,10276 0,2б 7,0Б 1 аналитик
2 З,Б2 0,17 0,0289
З З,72 -0,0З 0,0009
4 З,7 -0,01 0,0001 2 аналитик
Б З,7б -0,07 0,0049
б З,81 -0,12 0,0144
З,б9 0,0Б28
Таблица 4
Определение воспроизводимости разработанной методики (3 образец)
Х di di2 S2 S AX Sотн
1 2,1Б 0,07 0,00Б1Зб 0,00946 0,09726 0,2Б 11,2Б 1 аналитик
2 2,1З 0,09 0,00840З
З 2,19 0,0З 0,00100З
4 2,4 -0,18 0,0З180З 2 аналитик
Б 2,21 0,01 0,0001Зб
б 2,2Б -0,0З 0,00080З
2,221бб7 0,04728з
Правильность оценивали путем добавления к исследуемому извлечению стандартного раствора кислоты хлорогеновой с использованием 9 определений на 3 концентрациях, охватывающих требуемый диапазон. Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, его средняя величина должна находиться в пределах 100±5%. В разработанной методике процент восстановления находится в пределах от 96,78 до 102,05% (табл. 5).
Таблица 5
Определение правильности методики (эксперимент с добавками)
№п/п Содержание хлороге-новой кислоты, г Добавлено РСО хлорогеновой кислоты, г Ожидаемое содержание хлорогеновой кислоты, г Полученное содержание хлорогеновой кислоты, г Полученное содержание хлорогеновой кислоты, %
1 0,0447 0,0112 0,0ББ9 0,0Б49 98,21
2 0,0447 0,0112 0,0ББ9 0,0б6з 100,72
З 0,0447 0,0112 0,0ББ9 0,0Б41 9б,78
4 0,0447 0,0224 0,0671 0,0бБ2 97,17
Б 0,0447 0,0224 0,0671 0,068з 101,79
б 0,0447 0,0224 0,0671 0,0б7Б 100,60
7 0,0447 0,0ЗЗБ 0,0782 0,0798 102,0Б
8 0,0447 0,0ЗЗБ 0,0782 0,0788 100,77
9 0,0447 0,0ЗЗБ 0,0782 0,0771 98,Б9
Среднее значение выхода 99,6з%
В результате проведенного исследования установили, что содержание суммы гидроксикоричных кислот в изучаемом растении колеблется от 1,98±0,09% до 6,90±0,25%. Предложенная методика пригодна для стандартизации травы растений рода галинзога по содержанию суммы гидроксикоричных кислот.
Выводы.
Разработана методика количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на кислоту хлорогеновую в траве Galinsoga parviflora. Установлены оптимальные параметры экстракции: сырье с диаметром частиц не более 0,5 мм, экстрагент - 70% спирт этиловый, время экстракции - 30 минут. Разработанная методика валидирована по показателям: линейность, повторяемость, воспроизводимость, правильность.
Литература
1. Сафонова, И.А. Изучение фенольных соединений листьев пузыреплодника калинолистного (Physocarpus opulifolius (L.) Maxim) методом ВЭЖХ / И.А. Сафонова, В.Я. Яцюк, А.В. Кузьминова // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2009. - №4. - С. 128-133.
2. Бубенчикова В.Н. Изучение состава фенольных соединений галинзоги мелкоцветковой методом ВЭЖХ / В.Н. Бубенчикова, СА. Боева // Научно-практический журнал «Традиционная медицина». - 2012. -№ 5. - С. 189-191.
3. Левицкий, А.П. Хлорогеновая кислота: биохимия и физиология / АП. Левицкий, Е.К. Вертикова, ИА. Селиванская / / Мжробюлопя i бютехнолопя. - 2010. - №2. - С. 6-20.
4. Ларькина, М.С. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина / / Химия растительного сырья. - 2008. - №3. - С. 71-74.
5. Гаврилин М.В., Сенченко С.П. Валидация аналитических методик: методические указания для аспирантов и студентов. - Пятигорск: ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава, 2009. - 40 с.
6. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(Rl) // Фармация. - 2008. - №4. - С. 3-10.
7. Евдокимова О.В. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в столбиках с рыльцами кукурузы / О.В. Евдокимова / / Фармация. - 2008. - №7. - С. 14-17.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF METHODS OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF HYDROXYCINNAMIC ACIDS IN THE GRASS GALINSOGA PARVIFLORA
V.N. BUBENCHIKOVA 11 S.A. BOEVA 21
1) Kursk State Medical University
2) Voronezh State Medical Academy of the N.N.Burdenko
e-mail: fg.ksmu@mail.ru
The article presents the data on the development of methods of quantitative determination of the amount of hydroxycinnamyl acids in the grass Galinsoga parviflora family Asteraceae (Compositae), which is used in folk medicine as a healing, haemostatic, hypotensive means. Filmed electronic spectrum of water-alcohol extraction of herbs Galinsoga parviflora. Optimal parameters of extraction for the quantitative determination of the amount of hydroxycinnamyl acids in the studied plant raw material: the dispersion of raw materials, nature extractant, time of extraction. Held validation of methods developed by the following characteristics: linearity, repeatability, reproducibility, accuracy.
Key words: Galinsoga parviflora, Compositae, hydroxycinnamic acids, chlorogenic acid, extraction, validation.
