CC BY
35
УДК 58.085, 582.572.2
А.А. Эрст A.A. Erst
А.С. Эрст A.S. Erst
РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO РЕДКОГО ВИДА - FRITILLARIA DAGANA TURCZ. EX TRAUTV.
ИЗ ЛУКОВИЧНЫХ ЧЕШУЙ
IN VITRO PROPAGATION OF RARE PLANT FRITILLARIA DAGANA TURCZ. EX TRAUTV.
FROM BULB SCALES
Аннотация. Показан высокий регенерационный потенциал частей луковичных чешуй Fritillaria dagana на среде В5, дополненной 5мкМ БАП и 2мкМ НУК. Для эффективного укоренения адвентивных луковичек необходим период культивирования при пониженной температуре. Способ микроразмножения in vitro из луковичных чешуй Fritillaria dagana наиболее эффективен по сравнению с размножением in vivo, имеет важное значение для сохранения биологического разнообразия. Периодическая пересадка адвентивных луковичек на среды, содержащие 5мкМ БАП и 2мкМ НУК, позволяет получить высокий коэффициент размножения данного вида, сохранить его в культуре in vitro и длительное время культивировать без снижения регенерационного потенциала.
Ключевые слова: Fritillaria, регенерация луковичек, сохранение биоразнообразия.
Summary. A high regeneration potential of Fritillaria dagana was developed from bulb scale sections on a medium B5 supplemented with 5дМ BAP and 2^M NAA. A low temperature was needed for effective rooting of adventitious bulblets during cultivation. In vitro propagation of Fritillaria dagana bulb scales is more effective than traditional methods and has a great importance for conservation of biological diversity. Subcultivation of adventitious bulblets on a medium supplemented with 5дМ BAP and 2дМ NAA provides a high multiplication rate, to conserve in vitro culture and to cultivate a long time without decrease of regenerative potential.
Key words: Fritillaria, regeneration of bulblets, conservation of biodiversity.
Fritillaria dagana Turcz. ex Trautv. (Lilia-ceae Juss.) имеет статус редкого вида - 3 (R) и является эндемиком России (горы Южной Сибири) и Северной Монголии (Малышев, 2008). Виды рода рябчик относятся к луковичным геофитам и обычно размножаются луковицами. В естественных условиях произрастания, а также в интродукции скорость вегетативного размножения невысока и от одной луковицы можно получить только две новые за год. Такой низкий потенциал не позволяет размножать виды рода Fritillaria традиционным делением луковицы. Семенное воспроизводство рябчиков очень длительное и составляет 5-6 лет (Баранова, 1999). Размножение in vitro является эффективными альтернативным способом воспроизведения растений и позволяет получить большое количество растений в короткие сроки. В настоящее время разработаны методики микроразмножения ряда редких и декоративных видов рябчиков (Вечернина, 2004; Mohammadi-Dehcheshmeh et al., 2007; Otani,
Shimada, 1997; Paek, Murthy, 2002). В данной работе представлены материалы по размножению Fritillaria dagana при использовании в качестве исходного материала частей луковичных чешуй.
Материалы и методы. В качестве исходного материала использовались луковицы F. dagana, полученные из естественных мест произрастания - Красноярский край, хр. Ергаки в мае 2010 г. (рис. 1а). Для культивирования in vitro использовали части чешуй луковиц (5^5 мм) и дочерние луковички. Стерилизацию растительного материала проводили 70% этанолом (30 сек.), затем 0,1% HgCl2 с добавлением 1% Tween 80 (30 мин.). Подобный режим стерилизации успешно применялся для луковичных чешуй Fritillaria camtsсhatcensis (L.) Ker-Gawl. и F. thunbergii Miq. (Otani, Shimada, 1997; Paek, Murthy, 2002).
Для культивирования эксплантов были подобраны следующие условия: фотопериод -16/8 часов свет/темнота, освещенность - 2-3 клк, температура — 24±1°С. Дочерние луковички пос-
00<XXXXXXXX)00000000000000<X>0000000000000000000<X>00000000000<ххххххххх>о<ххх><хх>о<ххх>о<х)<х><хх>ооооооооооо<х>ооооооооооооооооооо<х>ооооооооооо<х>о<юоооооооооооооооо<х>ооо<>
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолинская, 101; 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: annaerst@yandex.ru, erst andrew@yahoo.com
Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Zolotodolinskaya str., 101; 630090, Novosibirsk, Russia
Поступило в редакцию 09.09.2011 г.
Submitted 09.09.2011
Рис. Этапы процесса микроразмножения Fritillaria dagana из луковичных чешуй: а) исходный материал - луковицы; б) адвентивное побегообразование на части луковичной чешуи на среде В5, дополненной БАП 5мкМ и НУК 2мкМ; в) стадия размножения адвентивных луковичек; г) регенерант Fritillaria dagana, укорененный на среде В5 с 5мкМ НУК.
ле поверхностной стерилизации дополнительно выдерживали при температуре +7°С в темноте 2 месяца с целью создания холодного периода покоя.
Основной питательной средой выбрана среда В5 (Gamborg, Eveligh, 1968), успешно применяемая для размножения луковичных растений, например, Fritillaria imperialis L., F. me-leagris L., F. verticillata Will. и Lilium longiflorum Thunb. (Вечернина, 2004; Arzate-Fernandez et al., 1997; Mohammadi-Dehcheshmeh et al., 2007). Данную среду дополняли регуляторами роста: 6-бензиламинопурином - БАП (ICN Biomedicals, USA) 2 и 5 мкМ, а-нафтилуксусной кислотой -НУК (AppliChem, Germany) 2 и 5 мкМ; сахарозой 50г/л; агаром 6г/л (Difco, USA). Автоклави-рование среды проводилось при 121°С в течение 20 мин, pH среды доводили до 5,8.
Результаты и обсуждение. Высокий регенерационный потенциал отмечен при использовании луковичных чешуй у Fritillaria cam-tschatcensis и F. thunbergii (Otani, Shimada, 1997; Paek, Murthy, 2002). В наших исследованиях чешуи луковиц Fritillaria dagana после поверхностной стерилизации делили на части 5*5 мм. Использование эксплантов такого размера является оптимальным, так как обеспечивает морфогенный ответ тканей экспланта (George, 2008). Части луковичных чешуй помещали на питательные среды различного состава (табл.). Через месяц культивирования наблюдали разрастание и позеленение тканей луковичных чешуй, а через 50 дней на эксплантах отмечали образование меристематических очагов, из которых развивалось 8-12 адвентивных луковичек (рис. 1б). Та-
Таблица
Влияние компонентов питательной среды на регенерацию луковичек Fritillaria dagana в культуре in vitro, n=10
Питательная среда Тип ответа первичного экспланта % морфогенеза Количество луковичек на эксплант, шт.
В5 +БАП 5мкМ Прямая регенерация 80 8,6±1,6
В5 +НУК 5мкМ Каллусообразование 0 0
В5 +БАП 5мкМ+ НУК 5мкМ Каллусообразование 0 0
В5 +БАП 5мкМ+ НУК 2мкМ Прямая регенерация 100 10,1±2,2
кой морфогенный ответ первичного экспланта (прямая регенерация) отмечен на средах, содержащих только цитокинины или при концентрации цитокининов, превышающих содержание ауксинов.
Отмечено, что регенерационным потенциалом обладают только экспланты от материнской луковицы, дочерние луковички не прорастали на всех исследуемых средах даже спустя год наблюдений.
Полученные микролуковички переносили на среды с 5мкМ БАП и 2мкМ НУК для дальнейшего размножения (рис. 1в). К концу пассажа дополнительно развивалось 2-3 адвентивные луковички, что позволяет получить за год культивирования примерно 2000 растений. Для укоренения полученных микролуковичек достаточно было исключить из состава среды цитокинин и увеличить концентрацию ауксина до 5мкМ НУК (Таварткиладзе, Вечернина, 1997) (рис. 1г). При этом отмечено, что укоренение наступает только при культивировании при пониженной температуре. Сходные особенности ризогенеза были отмечены и для других видов рода Fritillaria, например Fritillaria meleagris Ь. (№коПс et а1., 2008; и др.). Согласно нашим наблюдениям, для укоренения необходимо выдерживать микролуковички при температуре +7°С в течение 5 дней или культивировать в условиях с температурным
режимом 18±2°С. Оба режима укоренения оказались успешными и через 3 недели культивирования на среде с 5мкМ НУК получили растения-регенеранты с развитой корневой системой (5-6 корней на побег). При дальнейшем культивировании на данной среде у регенерантов развивался побег с двумя листьями, луковички увеличивались в размерах.
Показана высокая эффективность размножения Fritillaria dagana в культуре in vitro из луковичных чешуй по сравнению с размножением in vivo. Периодическая пересадка адвентивных луковичек на среды, содержащие 5мкМ БАП и 2мкМ НУК, позволила получить высокий коэффициент размножения данного вида (2000 растений в год), сохранить его в культуре in vitro и длительное время культивировать без потери регенерационного потенциала. Методика размножения in vitro дает возможность сохранения этого редкого таксона в культуре, позволяет в достаточном количестве получать растительный материал для интродукции в условиях ботанических садов и имеет важное значение для сохранения биологического разнообразия редких видов.
Исследования выполнены при поддержке гранта №23 Президиума РАН «Биологическое разнообразие».
ЛИТЕРАТУРА
Баранова М.В. Луковичные растения семейства Лилейные: география, биоморфологический анализ, выращивание. - СПб.: Наука, 1999. - 229 с.
Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений: монография. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2004. - 205 с.
Малышев Л.И. Fritillaria dagana Turcz. ex Trautv. // Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / Гл. редколл.: Ю.П. Трутнев и др.; сост. Р.В. Камелин и др. - М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2008. - С. 321-322.
Таварткиладзе О.К., Вечернина Н.А. Размножение и длительное хранение Fritillaria meleagris L. in vitro // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: тез. докл. VII междунар. конф. (25-28 ноября 1997 г.). - М., 1997. - С. 533.
Arzate-Fernandez A.-M., Nakazaki T., Okumoto Y., Tanisaka T. Efficient callus induction and plant regeneration from filaments with anther in lily (Lilium longiflorum Thunb.) // Plant Cell Reports, 1997. - Vol. 16, № 12. -P. 836-840.
Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem., 1968. - Vol. 46, № 5. - P. 417-421.
George E.F. Plant propagation by tissue culture. 3rd Edition, 2008. - 384 p.
Mohammadi-Dehcheshmeh M., KhalighiA., Naderi R., Ebrahimie E., Sardari M. Inderect somatic embryo-genesis from petal explant of endangered wild population of Fritillaria imperialis // Pak. J. Biol. Sci., 2007. - Vol. 10, № 11. - P. 1875-1879.
Nikolic M., Misic D., Maksimovic V., Jevremovic S., Trifunovic M., Subotic A. Effect of low temperature on rooting rate and carbohydrate content of Fritillaria meleagris bulbs formed in culture in vitro // Arch. Biol. Sci., 2008. - Vol. 60, № 1. - P. 5-6.
Otani M., Shimada T. Micripropagation of Fritillaria camts^atcensis (L.) Ker-Gawl., «Kuroyuri» // Bull. RIAR, Ishikawa Agr. Coll., 1997. - Vol. 5. - P. 39-44.
Paek K.Y., Murthy H.N. High frequency of bulblet regeneration from bulb scale sections of Fritillaria thun-bergii // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult., 2002. - Vol. 68. - P. 247-252.
