CC BY
21
Серия «Биология. Экология»
2016. Т. 18. С. 5-13 Онлайн-доступ к журналу: http://^vestia_bio.isu.ru/ru/index.html
И 3 ВЕСТИЯ
Иркутского государственного университета
УДК 58.084.1
Различная устойчивость к канамицину трансгенных
клонов Populus^berolinensis, экспрессирующих ген nptII
1 12 В. В. Павличенко , М. В. Протопопова , Э. М. Байрамова , 2 2 1 Е. Д. Золотовская , А. Д. Коновалов , В. К. Войников
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск
2 Иркутский государственный университет, Иркутск E-mail: vpavlichenko@gmail. com
Аннотация. Проведена оценка устойчивости трансгенных линий тополя берлинского, трансформированных генетической конструкцией на основе плазмиды pBI121, несущей ген nptII. Наличие гена nptII в геномах трансгенных линий подтверждали с помощью ПЦР. Всего в исследовании использовали 6 трансгенных и 1 контрольную линию тополя. Определение устойчивости линий проводили по эффективности корнеобразования на средах с различными концентрациями канами-цина: 12,5, 25, 50 и 75 мг/л. Результаты показали, что все трансгенные линии отличались по устойчивости к канамицину. Наиболее устойчивыми оказались растения линий II и III, которые укоренялись даже при использовании максимальной концентрации канамицина в питательной среде. Мы предполагаем, что различия в устойчивости могут быть обусловлены разным количеством копий импортированных генов в геномах трансформированных растений, а также различной эффективностью их транскрипции.
Ключевые слова: агробактериальная трансформация, канамицин, nptII, uidA, GUS-репортерная система, Populus^berolinensis, устойчивость, трансгенные растения.
Введение
Генетическая трансформация растений может приводить к появлению линий растений с различной степенью проявления целевого признака. Кроме того, даже в результате последующего вегетативного размножения полученных трансформантов могут выщепляться различные фенотипические варианты. В случае агробактериальной трансформации механизм такого расщепления не всегда однозначен и может быть обусловлен рядом причин, например различными местами встройки генетической конструкции в геном растения [7] и её активностью, а также копийностью целевого гена в геноме растения-реципиента [1]. В связи с необходимостью отбора растений лишь с определённым набором полезных признаков, методологические работы, направленные на исследование эффекта фенотипического расщепления в результате генетической трансформации, представляют научный интерес.
Одним из селективных генов, наиболее часто используемым при генетической трансформации, является ген неомицин фосфотрансферазы II
(nptll), обусловливающий устойчивость к ряду антибиотиков, включая ка-иамиции. В результате генетической трансформации могут выщепляться клоны с различной степенью проявления нового признака, в том числе и с различной степенью устойчивости к селективному агенту.
Настоящее исследование направлено на сравнительную оценку степени устойчивости к канамицину нескольких клонов тополя берлинского, трансформированных по гену nptll.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования выбран тополь берлинский (Populus хberolinensis Dippel), являющийся гибридом тополя лавролистного (Populus laurifolia Ledeb.) и тополя чёрного (Populus nigra L.). Представители семейства Ивовые часто используются в качестве модельного объекта для изучения влияния генетической трансформации на рост, развитие, метаболизм растений, а также для отработки методики создания древесных растений с новыми свойствами. Наиболее перспективными в этом отношении являются виды рода Populus ввиду их высокой способности к трансформации, регенерации и вегетативному размножению, а также небольшого размера полностью аннотированного генома [3; 4]. Существует мнение, что виды рода Populus играют такую же роль в изучении древесных растений, как Ara-bidopsis thaliana для двудольных травянистых [5].
Агробактериальную генетическую трансформацию тополя берлинского проводили с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens C58C1 с хелперной плазмидой pMP90. В качестве бинарного вектора для трансформации использовали коммерческую плазмиду pBI121 (Clontech, США), содержащую селективный и репортерный гены. В качестве селективного использовался ген неомицин фосфотрансферазы II (nptll), определяющий устойчивость к сульфату канамицина (далее по тексту - канамицин), а роль репортерного выполнял ген uidA из E. coli, кодирующий бактериальный фермент ß-D-глюкуронидазу.
Перенос векторной конструкции в клетки A. tumefaciens осуществляли с помощью прямой трансформации методом замораживания-оттаивания с авторскими модификациями [6]. Непосредственно генетическую трансформацию растений осуществляли при помощи инкубации растительных экс-плантов (отрезки стеблей без пазушных почек) в суспензии A. tumefaciens. Инкубацию проводили в жидкой среде для культивации A. tumefaciens -YEB без антибиотиков в течение двух суток на перемешивающем шейкере при температуре 26 °C. Трансформированные и отмытые от агробактерий экспланты переносили на питательные среды для получения регенерантов. Для освобождения растительного материала от агробактерий и получения регенерантов использовали цефотаксим в финальной концентрации 200 мг/л. Для образования регенерантов питательную среду готовили на основе 50%-ной среды Мурашиге - Скуга MS 5524 (Sigma, Germany) [2], содержащую полную норму хелата железа и микроэлементов среды MS, тиамин (1 мг/л), пиридоксин (0,5 мг/л), никотиновую кислоту (0,5 мг/л), мезо-
инозит (50 мг/л), аденин сульфат (40 мг/л), бензиладенин (0,2 мг/л), нафти-луксусную кислоту (0,01 мг/л) и тидиазурон (0,02 мг/л). В качестве источника углеводов использовали сахарозу в финальной концентрации 2 %. Для получения твёрдой среды применяли агар в финальной концентрации 7 г/л. Кислотность среды доводили до значения pH 5,7. Для проведения селективного отбора трансформированных растений в стерильную (автоклавирован-ную) остывшую до 55 °C питательную среду добавляли канамицин в финальной концентрации 12,5 мг/л. В сосуды для культивирования объёмом 100 мл разливали по 25 мл готовой питательной среды и закрывали прозрачными крышками Magenta B-Cap (Sigma, Germany). На поверхность затвердевшей и остывшей до комнатной температуры питательной среды помещали экспланты растений. Сосуды с эксплантами экспонировали в световой комнате с фотопериодом 16/8 ч. (день/ночь) при температуре 24 °C. Через 20 суток отмечали появление первых регенерантов, которые срезали и переносили на питательную среду для укоренения на основе 1/2 MS 5524 (Sigma, Germany), содержащую полную норму хелата железа и микроэлементов среды MS, тиамин ( 1 мг/л), пиридоксин (0,5 мг/л), никотиновую кислоту (0,5 мг/л), инозит (50 мг/л), индолилмасляную кислоту (0,15 мг/л), сахарозу (2 %), агар (Биотехновация, Россия) (7 г/л), канамицин (12,5 мг/л). Кислотность среды доводили до значения pH 5,7. Растения, укоренившиеся на питательной среде с канамицином, считали потенциально трансформированными и вегетативно размножали для дальнейших экспериментов. Контрольные растения параллельно переносили на аналогичную питательную среду и среди них не отмечали корнеобразования. Всего было отобрано шесть трансгенных линий тополя берлинского. Трансгенность отобранных линий тополя была дополнительно подтверждена c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), детектирующей гены nptII и uidA, а также качественной реакции гидролиза 5-бром-4-хлор-3-индолил-/#-0-глюкуронида (X-gluc) - субстрата фермента ß-глюкуронидазы (продукта гена uidA).
Качественную реакцию на активность GUS-репортерной системы проводили путём инкубирования отрезков листьев трансгенных растений в растворе X-gluc (1 мМ X-gluc в 50 мМ Na2HPO4, pH 7,0) в течение 20 ч при 37 °C. Наличие активности фермента ß-глюкуронидазы детектировали по окрашиванию растительных тканей в синий цвет.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в ДНК-амплификаторе T100 (Bio-Rad) с использованием набора для ПЦР GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Реакцию проводили в объёме 20 мкл с финальной концентрацией каждого праймера 250 нМ. В работе использовали следующие праймеры: для гена uidA - прямой - 5'-TGT GGG CAT TCA GTC TGG ATC G-З' и обратный - 5'-GCC AGT CCA GCG TTT TTG CAG-З'; для гена nptII -прямой - 5'-AGG TTC TCC GGC CGC TTG-З' и обратный - 5'-AGT ACG TGC TCG CTC GAT GC-З'. Температурный режим реакции: инициирующая денатурация (95 oC, 5 мин); З5 циклов амплификации: денатурация (95 °С, 20 с), отжиг праймеров (60 °С, 20 с) и элонгация (72 °C, 1 мин); заключи-
тельная элонгация (72 oC, 7 мин). Качество ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией на гель-документирующей системе GelDoc XR+ (Bio-Rad).
Всего в исследовании использовали шесть трансгенных (I-VI) и одну контрольную линию тополя. Каждая из групп была получена из одного растения, что свидетельствует об одинаковом генотипе внутри каждой группы. Определение устойчивости линий проводили по эффективности корнеобра-зования на среде с различными концентрациями канамицина: 12,5; 25; 50 и 75 мг/л. На каждом виде питательной среды укореняли по 10 растений, каждое из них содержали в отдельной пробирке в 10 мл вышеописанной питательной среды для укоренения в световой комнате с фотопериодом 16/8 ч (день/ночь) при температуре 23 °C.
Результаты и обсуждение
На первом этапе были проведены анализы, подтверждающие трансгенную природу отобранных для исследования линий тополя. Так, качественная реакция на активность GUS-репортерной системы показала наличие активности гена uidA у всех шести отобранных трансгенных линий тополя: в присутствии X-gluc листья растений окрашивались в синий цвет (рис. 1). У контрольных растений окрашивания листьев не происходило. Результаты ПЦР подтвердили наличие генов uidA и nptII в геномах всех шести трансгенных линий тополя (рис. 2, 3).
Растения из всех трансгенных групп укоренялись со 100%-ной эффективностью в случае использования финальной концентрации канамицина в питательной среде 12,5 мг/л, которая также была использована для отбора регенерантов после генетической трансформации (табл., рис. 4). При использовании более высокой концентрации канамицина (25 мг/л) наблюдали 100%-ное укоренение трансгенных линий II и III. Остальные трансгенные линии при использовании данной концентрации канамицина показали более низкий процент укоренения: I - 70 %, IV - 70 %, V - 50 % и VI - 90 %. Использование концентрации канамицина в питательной среде до значения 50 мг/л привело к ещё большему разделению трансгенов по степени устойчивости к канамицину по сравнению с предыдущей концентрацией: I - 40 %, II - 80 %, III - 90 %, IV - 10 %, V - 40 % и VI - 70 %. При максимальной концентрации канамицина в питательной среде (75 мг/л) укоренение наблюдали только в двух линиях из шести: II - 30 %, III - 10 %. Представители остальных групп в случае использования данной концентрации показали 100%-ную гибель. Контрольные растения не образовывали корни и погибали уже при концентрации канамицина в питательной среде 12,5 мг/л (рис. 5).
Рис. 1. Результаты качественной реакции на активность GUS-репортерной системы у трансгенных (I-VI) и контрольной (K) линий растений тополя берлинского, ✓ - наличие синего окрашивания, Л - отсутствие синего окрашивания
Рис. 2. Результаты ПЦР на наличие гена uidA у линий тополя берлинского. М -ДНК-маркер (GeneRuler DNA Ladder, Fermentas), I-VI - трансгенные линии; P -позитивный контроль (плазмида pBI121), С - контрольная линия, N - негативный контроль (без добавления ДНК)
Рис. 3. Результаты ПЦР на наличие гена nptII у линий тополя берлинского. М -ДНК-маркер (1 kB plus GeneRuler DNA Ladder, Fermentas), I-VI - трансгенные линии; С - контрольная линия, N - негативный контроль (без добавления ДНК)
Таблица
Эффективность корнеобразования у растений шести трансгенных линий тополя
берлинского на средах с различными концентрациями канамицина (% укоренившихся растений от общего числа использованных в исследовании)
№ линии Концентрация канамицина (мг/л)
12,5 25 50 75
I 100 70 40 0
II 100 100 80 30
III 100 100 90 10
IV 100 70 10 0
V 100 50 40 0
VI 100 90 70 0
Результаты исследования выявили наличие доза-зависимого эффекта канамицина на эффективность укоренения у всех исследованных трансгенных линий тополя берлинского. Данный эффект выражался в снижении процента укоренившихся растений при увеличении концентрации канамицина. Было также показано, что все полученные трансгенные линии тополя по гену прШ отличались устойчивостью к канамицину. Так, из шести полученных трансгенных линий наиболее устойчивыми к канамицину оказались растения линий II и III. Наибольшую устойчивость к канимицину показали трансгенные растения линии II. Растения четырёх оставшихся линий были менее устойчивы к высоким концентрациям канамицина в питательной среде. Кроме того, было обнаружено фенотипическое расщепление у растений каждой линии. Так, в большинстве случаев, не все растения одной линии укоренялись на селективной среде, либо укоренялись с разной эффективностью. Для каждой из линий расщепление по фенотипу увеличивалось в пользу неукоренившихся растений с усилением давления селективного фактора (увеличение концентрации канамицина в среде).
Результаты исследования показали, что при использовании более высоких концентраций селективного агента можно отбирать трансгенные растения с наиболее выраженным эффектом генетической трансформации. Использование же более низких концентраций может приводить к снижению селективности и отбору растений с менее выраженным эффектом генетической трансформации. Последняя стратегия в свою очередь может быть применена в случае необходимости отбора трансформантов с менее выраженным фенотипическим эффектом генетической трансформации, в том числе связанных с нежелательной активностью селективного гена. Наблюдаемые различия в устойчивости трансгенных линий тополя берлинского по гену прШ к канамицину могут быть связаны с генетическими особенностями полученных линий. Такими особенностями могут являться различное количество копий импортированных генов в геноме, а также различная эффективность их транскрипции у отобранных линий тополя, что планируется подтвердить в ходе дальнейших исследований.
ь го:
С
л» („ао^
Линия II, канамицин 75 мг/л
Рис. 4. Образование корней на питательной среде с различным содержанием канамицина у трансгенных линий тополя. В качестве примера представлены результаты для линии II
Рис. 5. Нарушение корнеобразования у контрольной линии тополя берлинского на питательной среде с канамицином (12,5 мг/л)
Заключение
Результаты исследования показали, что все изученные трансгенные линии тополя берлинского экспрессирующие ген nptll отличались по устойчивости к канамицину. Наиболее устойчивыми оказались растения линий II и III, которые укоренялись даже при использовании максимальной концентрации канамицина в питательной среде (75 мг/л). Мы предполагаем, что различия в устойчивости могут быть обусловлены различным количеством копий импортированных генов в геномах трансформированных растений, а также эффективностью их транскрипции.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке стипендии Президента РФ (СП-3823.2015.1), Комплексной программы фундаменталъ-
ных исследований СО РАН (проект № 0343-2015-0005) и проекта РФФИ 1404-31681 мол а. Авторы признательны К. 3. Гамбургу за помощь в селективном отборе трансгенных растений тополя. Авторы благодарят Байкальский аналитический центр (ЦКП) при Президиуме ИНЦ СО РАН за предоставленную возможность использования необходимого для исследования оборудования.
Список литературы
1. Karami O. Factors Affecting Agrobacterium-mediated Transformation of Plants / O. Karami // Transgenic Plant Journal. - 2008. - Vol. 2(2). - P. 127-137.
2. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum. - 1962. - Vol. 15. -P. 473-497.
3. Rishi A. S. Genetic modification for improvement of Populus / A. S. Rishi, N. D. Nelson, A. Goyal // Physiology and molecular biology of plants. - 2001. - Vol. 7. -P. 7-21.
4. Studart-Guimaraes C. Evaluation of heterologous promoters in transgenic Populus tremula x P. alba plants / C. Studart-Guimaraes, C. Lacorte, A. C. M. Brasileiro // Biologia plantarum. - 2006. - Vol. 50 (1). - P. 15-20.
5. Taylor G. Populus: Arabidopsis for forestry. Do we need a model tree? / G. Taylor // Annals of Botany. - 2002. - Vol. 90. - P. 681-689.
6. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens / M. Holsters [et al.], // Molecular and general genetics. - 1978. - Vol. 163(2). - P. 181-187.
7. Ugarli C. Expression and genomic integration of transgenes after Agrobacterium-mediated transformation of mature barley embryos / C. Ugarli, F. Tufan, F. Gurel // Genetic and Molecular Research. - 2015. - Vol. 14(1). - P. 1096-1105.
Different Degrees of Resistance to Kanamycin of Populus^berolinensis (Salicaceae) Transgenic Clones Expressing nptll Gene
1 12 V. V. Pavlichenko , M. V. Protopopova , E. M. Bairamova , 2 2 1 E. D. Zolotovskaya , A. D. Konovalov , V. K. Voinikov
1Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk 2Irkutsk State University, Irkutsk
Abstract. The resistance to kanamycin of several transgenic lines of Popu-lus^berolinensis transformed by genetic construction on the base of pBI121 binary vector and containing nptII gene was evaluated. The presence of nptII gene in the transgenic plants genomes was approved by PCR. Six transgenic lines and one control line of poplar were tested. The degrees of resistance of the studied lines of poplar to kanamycin were determined by their rooting ability. In experiments 12.5, 25, 50 and 75 mg/L of kanamycin sulphate in the growth media were tested. The results showed the different degrees of resistance of all studied poplar transgenic lines to kanamycin. The lines II and III were the most resistant and were rooted even at the highest used concentration of kanamycin in the growth media. We suppose, that differences in the resistance may be caused by different copy numbers of imported genes in the transgenic plants genomes and by differences in their expression.
Keywords: Agrobacterium mediated transformation, kanamycin, nptII, uidA, GUSreporter system, Populusxberolinensis, resistance, transgenic plants.
Известия Иркутского государственного университета 2016. Т. 18. Серия «Биология. Экология». С. 5-13
Павличенко Василий Валерьевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел. (3952) 42-46-59 факс (3952) 51-07-54 e-mail: vpavlichenko@gmail. com
Протопопова Марина Владимировна
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Сибирский институт физиологии
и биохимии растений СО РАН
664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
тел. (3952) 42-46-59
факс (3952) 51-07-54
e-mail: marina. v.protopopova@gmail. com
Байрамова Эльвира Махаловна студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: bairamovaelvira@gmail. com
Золотовская Елена Дмитриевна студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К.Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: zolotovskayaelenad@gmail. com
Коновалов Алексей Дмитриевич студент
Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1 тел.: (3952) 24-18-70 e-mail: konovalov. alexey. d@gmail. com
Войников Виктор Кириллович доктор биологических наук, главный научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел. (3952) 42-46-59 факс (3952) 51-07-54 e-mail: vvk@sifibr.irk.ru
Pavlichenko Vasiliy Valeryevich
Candidate of Science (Biology),
Senior Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: vpavlichenko@gmail. com
Protopopova Marina Vladimirovna
Candidate of Science (Biology),
Senior Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
tel. (3952) 42-46-59
fax (3952) 51-07-54
e-mail: marina. v.protopopova@gmail. com
Bairamova Elvira Makhalovna Student
Irkutsk State University 1, K.Marx st., Irkutsk, 664003 tel.: (3952) 24-18-70 e-mail: bairamovaelvira@gmail.com
Zolotovskaya Elena Dmitryevna Student
Irkutsk State University 1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003 tel.: (3952) 24-18-70 e-mail: zolotovskayaelenad@gmail. com
Konovalov Aleksey Dmitryevich Student
Irkutsk State University 1, Karl Marx st., Irkutsk, 664003 tel.: (3952) 24-18-70 e-mail: konovalov. alexey. d@gmail. com
Voinikov Victor Kirillovich
Doctor of Sciences (Biology), Principal
Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel. (3952) 42-46-59
fax (3952) 51-07-54
e-mail: vvk@sifibr.irk.ru
