CC BY
92
Сер. 4 2007 Вып. 3_ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 543.544.5.068.7:54.061 А. Ю. Ещенко, И. Г. Зенкевич
РАЗДЕЛЕНИЕ ЭНАНТИОМЕРОВ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И КАТЕХИНОВ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЭЖХ С ХИРАЛЫЮЙ МОДИФИКАЦИЕЙ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ
Дигидрокверцетин—(3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон (5,7,3',4'-дигидрофлаво-нол)) и катехин (5,7,3 ',4'-тетрагидроксифл аван-3 -ол)—распространенные природные соединения класса флавоноидов, вьщеленные из различных видов растений [1]. Молекулы дигидрокверцетина и катехина имеют два асимметрических атома углерода (С2 и С3 у-пи-ронового и пиранового фрагментов молекул, соответственно). Четыре энантиомера дигидрокверцетина представляют собой две пары диастереомеров: транс-[(-)-28,38 и (+)-2К,ЗК], цис-[(-)-211,38 и (+)-28,ЗЯ]. Четыре энантиомера катехина соответствуют также двум парам диастереомеров: транс- [(-)-28,ЗЯ и (+)-211,38] (катехин), цис- [(-)-2Я,ЗЯ и (+)-28,38] (эпикатехин).
Диастереомеры катехина и дигидрокверцетина можно разделять методом обра-щенно-фазовой ВЭЖХ без применения каких-либо хиральных модификаторов, например, с использованием в качестве элюента смеси ацетонитрила или метанола с водным раствором трифторуксусной кислоты.
Разделение энантиомеров в обращенно-фазовой ВЭЖХ основано на применении колонок с хиральными сорбентами или хиральной модификации подвижной фазы. В качестве хиральных модификаторов элюента используют оптически активные аминокислоты, метиловые эфиры аминокислот, циклодекстрины, краун-эфиры и т. д. [2]. Например, для разделения энантиомеров тироксина [3] и рацематов а-аминокислот [4]
© А.Ю. Ещенко, И. Г. Зенкевич, 2007
в качестве хиральной добавки в элюент использовали 0,2 мМ/л L-пролина. В работе [5] были разделены оптические изомеры кетопрофена с применением в качестве хираль-ного агента 2,0 мМ/л норванкомицина.
Широкое применение в качестве хиральных добавок в элюент или в качестве привитых неподвижных фаз находят циклодекстрины [6-8]. Циклодекстрины могут образовывать комплексы включения с различными молекулами по типу «хозяин-гость» в соотношении 1:1, которые характеризуются различиями в константах комплексооб-разования энантиомеров [2, 3, 9]. Например, добавки а-циклодекстрина использовали для разделения (±) камфоры и а-пинена [10], а также энантиомеров миндальной кислоты [11]. Оптические изомеры хлорталидона разделяли, используя 12,5 мМ/л (3-цик-лодекстрина [12], а в работе [8] предложены условия разделения кортикостероидов с такой же добавков (12мМ/л) Р-циклодекстрина в подвижной фазе. Степень разделения (часто используют термин «селективность разделения» а = t'^ / t'R1 ) энантиомеров возрастает с увеличением содержания Р-циклодекстрина в элюенте, поэтому для разделения энантиомеров используют его растворы с относительно высокими концентрациями—12-15 мМ/л (от 14 до 17 г/л), по сравнению, например, с концентрацией аминокислот (L-пролина—0,2 мМ/л) и полипептидов (2,0 мМ/л норванкомицина). Необходимо учитывать тот факт, что концентрации p-циклодекстрина от 14 до 17 г/л близки к пределу его растворимости в водно-органических растворителях. Например, растворимости а-, р- и у- циклодекстринов в смеси метанол/вода (50:50 об.) при комнатной температуре составляют 1,2; 0,3 и 2,8% масс., соответственно [13].
В данной работе впервые разделены энантиомеры дигидрокверцетина и катехина в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием хиральной модификации подвижной фазы p-циклодекстрином. Кроме того, показана возможность изменения их степени разделения за счет изменения температуры хроматографического анализа.
Экспериментальная часть. Анализ проводили на хроматографе «Beckman» с УФ-детектором при длине волны детектирования 290 нм и колонкой Luna С18 4,6 * 150 •мм (размер частиц сорбента 5 мкм) с предколонкой длиной 20 мм, заполненной тем же сорбентом. Скорость потока элюента 1,0 мл/мин. Дозируемый объем образцов 20 мкл. Время анализа около 30 мин. Для определения мертвого времени хроматографи-ческой системы (1,5 мин) использовали раствор сульфата меди. Для анализа использованы образцы (±)-таксифолина (синоним дигидрокверцетина) [Sigma (>98%), CAS 480-18-2], (+)-катехина [Sigma (>98%), CAS 88191-48-4], (-)-эпикатехина [Sigma (>98%), CAS 490-46-0]. Точные навески дигидрокверцетина, катехина и эиикатехина растворяли в этаноле для получения растворов с концентрацией 1 мг/мл.
Условия элюирования:
1) Изократическое элюирование смесью метанол / водный раствор Р-циклодекстри-на с концентрацией 15 мМ/л (25:75 об.).
2) Градиентное элюирование смесью ацетонитрил / водный раствор Р-циклодекстрина с концентрацией 15 мМ/л с линейным изменением концентрации ацетонитрила от 10 до 100% в течение 45 мин.
3) Анализ при пониженной температуре хроматографической колонки (0° С) проводили в режиме изократического элюирования смесью метанол / водный раствор Р-циклодекстрина с концентрацией 10 мМ/л (10:90 об.).
Результаты и их обсуждение. Разделение (±) таксифолина при комнатной температуре проводили в условиях изократического и градиентного элюирования. В режиме изократического элюирования были разделены два (транс-) энантиомера дигидрокверцетина (содержание цис-изомера в использованном образце мало). В режиме
Хроматограмма А—разделение энантиомеров дигидрокверцетина в режиме изократического элюирования. Пик с временем удерживания 15,7 мин—(-)-28,38 энантиомер; 17,0 мин—(+)-2К,ЗЯ энантиомер. Отнесение конфигураций было проведено по параметрам удерживания образца сравнения основного природного энантиомера (+)-2К,ЗЯ дигидрокверцетина [15].
Хроматограмма Б—разделение энантиомеров дигидрокверцетина в режиме градиентного элюирования. Пики с временам удерживания 14,6 и 15,1 мин—энантиомеры (±) таксифолина; пики с временами удерживания—17,2 мин—(-)-28,38 энантиомер и 17,6 мин—(+)-2К,ЗЯ энантиомер дигидрокемпферола (отнесение конфигураций было проведено по аналогии с отнесением энантиомеров дигвдрокверцетина).
градиентного элюирования разделены энантиомеры дигидрокверцетина и его основной примеси дигидрокемпферола (идентифицирован по параметрам удерживания и относительным оптическим плотностям [14]), который также имеет два асимметрических атома (С2—С3) (рис. 1).
Результаты разделения в режиме градиентного элюирования оказались плохо воспроизводимыми, так как из-за изменения содержания компонентов органической и водной фазы в элюенте в процессе разделения не поддерживалась постоянная концентрация хиральной добавки и, соответственно, не устанавливалось динамическое равновесие между подвижной и неподвижной фазами, что приводило к дрейфу базовой линии.
На рис. 2 представлена хроматограмма катехинов в условиях изократического элюирования смесью метанол / водный раствор с добавкой Р-циклодекстрина 15 мМ/л (25:75 об.).
Опт. плотность
0,3 -
0,0
1,7
7,2
2,4
9,3
0,0 Время, мин
20,0
Селективность разделения энантио-меров зависит от концентрации хирального компонента в подвижной фазе и температуры колонки. Влияние температуры на коэффициент разделения можно представить с помощью термодинамических параметров [2]:
где Дв—изменение свободной энергии Гиббса, Я—универсальная газовая постоянная, Т—температура (К), К—константа равновесия реакции комплексообразования с р-циклодекстрином.
Разность изменений свободной энергии Гиббса для двух энантиомеров связана с селективностью разделения следующим соотношением:
ДД(г = -/г7Чп^- = -КТ 1п а,
К*
где К8 К^—константы равновесия реакции образования комплекса включения с Р-циклодекстрином двух энантиомеров, а-степень разделения (селективность).
На примере нескольких работ можно отметить, что при увеличении температуры колонки селективность разделения энатиомеров уменьшается как в га-зохроматографическом анализе [2], так и в ВЭЖХ [17].
В данной работе температурную зависимость селективности разделения энантиомеров рассматривали на примере ди-гидрокверцетина. При повышенных температурах (30, 40, 50° С) разделения энантиомеров не наблюдалось, поэтому можно предположить, что понижение температуры хроматографической колонки до 0° С приведет, наоборот, к улучшению их разделения. Но при температуре колонки 0° С нужно было учитывать растворимость циклодекстринов в водно-органических растворителях. Для оценок растворимости циклодекстринов (г/л) в водных растворах при разных температурах пользуются следующими эмпирическими формулами [13]: для а-циклодекстрина: С ~ 247,06 х е0756,0^ - 260,26 (Т ~ 15 - 55° С); для р-циклодекстрина: С ~ 6,34912 х е^93)+ 1,089 (Т -15 - 85° С); для у- циклодекстрина: С ~ 317,16 х е(Т/4 3>53)- 317,02 (Т ~ 15-45° С).
В результате для проведения анализа при температуре колонки 0° С было подобрано оптимальное соотношение компонентов подвижной фазы: метанол / водный раствор 10 мМ/л р-циклодекстрина (10:90 об.). В этих условиях при комнатной температуре разделения энантиомеров (±)-таксифолина не наблюдалось, тогда как снижение температуры колонки до 0° С привело к их разделению (рис. 3).
Рис. 2.
Хроматограмма смеси (+)-катехина и (-)-эпикате-хина в условиях изократического элюирования. Пики с временами удерживания 1,7, 2,4 мин-(+)-катехин-211,38 и (-)-катехин-28,311, соответственно. Пик с временем удерживания 7,2 мин соответствует (-)-2Я,ЗК- (эпикапгехин); пик со временем удерживания 9,3 мин - (+)-28,38- (эпикатехин). Отнесение конфигураций энантиомеров катехинов обсуждается в работе [16].
Рис. 3
Хроматограммы (±)-таксифолина в условиях изократического элюирования при комнатной температуре (нет разделения) (а) и при охлаждении хроматографической колонки до 0 ° С (а = 1.21) (б)
Температурная зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрок-верцетина имеет следующий вид:
Температура, ° С Концентрация Р-циклодекстрина, мМ/л Селективность разделения
0 10 1,21
22 10 1 (нет разделения)
22 15 1,09
30 15 1 (нет разделения)
1п а = а [(1/Т) х ЮОО] + Ь; а = 1,72 ± 0,18; Ь = -5,69 ±0,63; г = 0,994; = 0,048
Из приведенных данных следует, что наибольшее значение селективности разделения энантиомеров было достигнуто при меньшей концентрации хиральной добавки (10 мМ/л) и при температуре колонки 0° С. При этом надо отметить, что при комнатной температуре (изократическое элюирование с добавкой р-циклодекстрина 15 мМ/л) регистрируются более симметричные пики, чем при 0° С. Это может быть связано с увеличением вязкости элюента при пониженных температурах. Например, абсолютная вязкость воды при комнатной температуре составляет 0,9579, а при 0°С—1,7921 мПахс [18], т. е. возрастает почти в два раза, что приводит к снижению скорости массобмена между сорбентом и подвижной фазой и размыванию хроматографических пиков.
В табл. 1 представлены значения селективности разделения энантиомеров ди-гидрокверцетина, катехинов и дигидрокемпферола в разных условиях анализа.
Таким образом, в данной работе впервые разделены с отнесением конфигураций (+)-2К,ЗЯ, (-)-28,38 энантиомеры дигидрокверцетина, (+)-28,ЗЯ- катехина, (-)-211,311-эпикатехина, и (+)-211,ЗК, (-)-28,38 энантиомеры дигидрокемпферола методом обра-щенно-фазовой ВЭЖХ в условиях динамической хиральной модификации элюента с использованием Р-циклодекстрина. Установлена температурная зависимость селективности разделения энантиомеров (±)-таксифолина. Выбранные условия анализа можно рекомендовать для разделения энантиомеров других флавоноидов.
Таблица 1
Селективность разделения энантиомеров флавоноидов в разных условиях элюирования при комнатной температуре
Соединение Режим элюирования Селективность разделения, а
Эпикатехин изократический 1,37
Катехин изократический 1,41*
Дигидрокверцетин изократический 1,09
Дигидрокверцетин (0° С) изократический 1,21
Дигидрокверцетин градиентный 1,04
Дигидрокемпферол градиентный 1,02
* - значение рассчитано по неисправленным временам удерживания.
Summary
Eshchenko A. Yu., Zenkevich I. G. Separation of enantiomers of dihydroquercetin and catechins with the use of reversed phase HPLC with chiral modification of mobile phase.
(+)-2R,3R and (-)-2S,3S Enantiomers of dihydroquercetin were separated first time using reversed phase HPLC in presence of chiral P-cyclodextrin in mobile phase. The same approach seems effective in separation of dihydrokaempferol, (+)-2R,3S-catechin, and (-)-2R,3R-epicatechin enantiomers. The dependence of enantioselectivity vs. temperature of chromatographic column is revealed.
Литература
1. Запраметов M.H. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 2. Алленмарк С. Хроматографическое разделение энантиомеров. М., 1991. 3. WangR., TiaZ.-P, Chen L.-R., Gel X., Mai J., Zhang Q„ Xiel H., Ao Y, Wang J. И J. Chromatogr. 2004. Vol. 59. N 11-12. P. 749-752. 4. Nazareth P.M.P., Antunes O.A.C. И BrazJ. Chem. Soc. 2002. Vol. 13. N 5. P. 658-663.
5. GuoZ, WangH., Zhang Y. Hi. Pharmaceutical and biomedical analysis. 2006. Vol. 41. N 1. P. 310-314.
6. HanX., ZhongQ., YueD., DellaCaN., LarockR.C„ ArmstrongD.W. II]. Chromatogr. 2005. Vol. 61. P. 205-211. 7. LemrK., SelcikJ., Friedecky D., JonakovaA., Jirovsky D. II Acta universitatis palaski-anae olomucensis. 1999. P. 41-51. 8. ZarzyckiP.K., KulhanekК. M., Smith R. II J. Chromatogr. A. 2002. Vol. 995. P. 71-78. 9. Hermann D„ Christopher P. Bioorganic Chemistry. 1981. P. 580.
10. Bielejewska A., DuszczykK., Sybilska D. И J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 931. N 1. P. 81-93.
11. Bielejewska A., LukasikB.II С hem. anal. 2002. Vol. 47. P. 419. 12. Herraez-Hernandez R„ Cam-pins-Falco P. И J. Chromatogr. B. 2000. Vol. 740. P. 169-177. 13. Институт Биологии УНЦ РАН / http:// www.cyclodextrins.ru/propts_CD.html. 14. Зенкевич И.Г., Косман В.М.. II Журн. аналит. хим. 2005. Т. 60. N 8. С. 837-841. 15. Зенкевич И. Г., ЕщенкоА.Ю., Макаров В. Г., Колесник Ю. А., Шматков Д. А., Тихонов В. П., Таишицкий В. М. И Мат. X Международн. съезда «Фитофарм-2006». СПб., 2006. С. 93-109. 16. BaisH.P., Walker Т. S. KennanA.J., Stermitz F. R., Vivanco J. M. II J. Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 897-901. 17. LemliB., PelesJ., Kollar L., NagyG., Kunsagi-Mate S.ll Su-pramolecular Chemistry. 2006. Vol. 17. N 2. P. 1-7. 18. Гороновский И.Т., Назаренко Ю.П., He-крячЕ.Ф. Краткий справочник по химии. Киев, 1987.
Статья принята к печати 28 февраля 2007 г.
