CC BY
30
Орипнальш AOOAiAKeHHq
Original Researches
актуальна Тнфектологш
УДК 619:616.993.1 DOI: 10.22141/2312-413x7.4.2019.178881
Яковенко Д.В.1 , Похил С.1.2 , Тимченко О.М.2 , Торяник I.I.2 , Чигиринська Н.А.2 , Костиря I.A.2
1 КМУ «Дитяче територ1альне медичне об'еднання», м. Краматорськ Донецько! обл., Укра'на
2 ДУ «1нститутмкробюлоги та ¡мунологи 1м. I.I. Мечникова НАМН Укра'ни», м. Харк1в, Укра'на
рщ w
Поширешсть криптоспоридюзу у д^еи з дiaреeю в ДонецькiИ областi, УкраТна
For citation: Aktual'naa Infektologia. 2019;7(4):204-210. doi: 10.22141/2312-413x.7.4.2019.178881
Резюме. Актуальтсть завдання щодо зниження сощально-медичного тягаря протозойних киш-кових хвороб, обумовлених аткомплексними паразитами роду Cryptosporidium, обГрунтовуе необ-хiднiсть вивчення 1х поширеностi серед груп населення високого ризику, до яких належать i дти. Для встановлення рiвня поширеностi криптоспоридюзу в Донецькт областi проведено цшьове об-стеження 295 дтей (вком до 17 ротв) iз гострою кишковою шфекщею з водянистою дiареею. За результатами мжроскопи мазтв фекалш (n = 295), збагачених формалш-етилацетатною седи-ментащею у фекальному концентраторi Mini Parasep® SFта забарвленихмодифкованим способом за Цилем — Ншьсеном, частота екскреци ооцист криптоспоридш (ЧЕО) становила 4,2 %. Вияв-лет ооцисти мали характерт морфологiчнi i тинкторiальнi властивостi та методом полiмеразноi ланцюгово1 реакцИ iдентифiкованiяк C.parvum. За допомогою реакци непрямоi iмунноi флуоресцен-ци iз дiагностикумом ПОАгС.rypto (фжсоват до поверхт предметного скельця очищет ооцистире-гюнального штаму C.parvum ЛНМ1З 3/2018) у зразках сироватки кровi вiд дтей (n = 78) визначено частоту наявностi i титри специфiчних IgZ, IgG, IgM та IgA. При пороговому титрi специфiчних IgG 1: 16 ндекс серопоширеностi (1СП) криптоспоридозу у когортi обстежених дтей досягав 21,8 % та перевищував виявлену у них ЧЕО (р < 0,05). З урахуванням показнитв ЧЕО та 1СП До-нецьку область лд вiднести до регютв iз вiдносно невисоким рiвнем спорадичноi захворюваностi дтей на криптоспоридюз.
Ключовi слова: дти; криптоспоридюз; екскрещя ооцист; специфiчнi iмуноглобулiни
Вступ
Криптоспоридюз (ICD-10, A07.2; ICD-11, 1A32 Cryptosporidiosis) — група уб^гтарно поширених i pi3H0MaHirara за ктшчними проявами хвороб, спри-чинюваних найпростшими роду Cryptosporidium (тип Apicomplexa), яю здатш до швази, розмноження та па-разитування в ештелюцитах слизових оболонок шлун-ково-кишкового тракту (переважно тонкого кишечника), дихальних шляхiв, протоюв шдшлунково! залози i жовчовивщно! системи. Разом iз безсимптомною формою криптоспоридюзу найбтьш типовим його кшшч-ним проявом е водяниста дiарея з широким спектром варiацiй тяжкост переб^у — вщ гострих самообмежу-ючих субктшчних i легких (в iмyнокомпетентних оаб) до хрошчних тяжких захворювань iз летальним наслщ-ком (в осiб з iмyнними порушеннями) [1, 2].
На сьогодш криптоспоридiоз визнано глобальною бiологiчною загрозою, що вражае широкi верстви населення, завдае значних економiчних збитыв тварин-ницькiй сферi виробництва i потребуе скоординова-них зусиль Всесвгтньо'1 органiзацii охорони здоров'я (ВООЗ), Мiжнародного епiзоотологiчного бюро (з травня 2003 р. — ВООЗ тварин), нацюнальних систем охорони здоров'я та ветеринарно'1 медицини для про-тиди поширенню цього паразитозу i зниження його со-цiально-медичного тягаря [3—6].
У цшому всi люди сприйнятливi до зараження криптоспорвддями. Проте групами найвищого ризику щодо ймовiрностi виникнення обумовлених цими паразитами захворювань визнано дггей молодшого вiку, ВIЛ-iнфiкованих та хворих на СН1Д, фермерiв i пра-цiвникiв тваринницького виробництва, а також оаб,
© «Актуальна шфектологи» / «Актуальная инфектологая» / «Actual Infectology» («Aktual'naa infektologia»), 2019 © Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2019
Для кореспонденцГ(: Похил Серий 1ванович, доктор медичних наук, завщувач лабораторГГ нових та маловивчених шфекцмних захворювань, ДУ «1нститут мкробюлоги та iмунолоrií iM. 1.1. Мечникова НАМН УкраТни», вул. Пушкiнська, 14-16, м. Харш, 61057, УкраТна; e-mail: pokhil_kharkiv@ukr.net; контактний тел.: +38 (057) 731-23-62.
For correspondence: Sergiy Pokhil, MD, Head of the Laboratory of New and Little-Explored Infections Disease, I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, 14-16 Pushkinskay str., Kharkiv, 61057, Ukraine; e-mail: pokhil_kharkiv@ukr.net; phone: + 38 (057) 731-23-62.
як вiдвiдували регiони i3 високим piBHeM ендем1чно! захвоpюваностi на кpиптоспоpидiоз [2, 6—9].
Для з'ясування сучасних ешдем1чних тенден-цiй i розробки обГрунтованих заходiв боротьби з кpиптоспоpидiозом р1вень його пошиpeностi серед певних груп населення (у тому числi й датей) кон-кретних кра!н чи !х peгiонiв найчастiшe визначають за показниками частоти екскрецй ооцист (ЧЕО) Cryptosporidium spp. (piдшe — !х антигeнiв i нукле!-нових кислот) у фeкалiяx та протикриптоспоридш-них (спeцифiчниx) iмуноглобулiнiв (сумарних — IgE, або !х piзниx класiв, переважно IgG, IgM, IgA, piдко — IgD та IgE) у сироватщ кpовi обстежуваних когорт осiб [10—15]. При цьому показник ЧЕО е нижньою межею iнвазованостi популяцй крипто-споpидiями (англ. oocysts excretion prevalence, OEP, або cases per se, CPS), а показник популяцшно! частоти спeцифiчниx Ig, який також називають шдек-сом сepопошиpeностi (1СП), — вiдповiдною верх-ньою межею поширеносп кpиптоспоpидiозу (англ. sero-prevalence index, SPI, або cases post-infection, CPI) [12-17].
Мета дослвдження: встановити поширенють криптоспоридюзу у дiтeй з гострою кишковою ш-фeкцiею (ГК1) в Донецьк1й областi Укра'ни за показниками частоти фекально! екскреци ооцист па-pазитiв i наявносп спeцифiчниx iмуноглобулiнiв у сиpоватцi кровь
Матерiали та методи
Когорту обстежених становили 295 дiтeй вiком до 17 роыв iз ознаками гостро! кишково! шфекцй з водянистою дiаpeею (далi — д1ти 1з ГК1), яким надавалась ста-цюнарна медична допомога (квiтeнь 2015 — березень 2019 р.) в шфекцшному вщдтенш № 2 КМУ «Дитяче тepитоpiальнe медичне об'еднання» м. Краматорська Донецько! обл., Укра'на.
Мiкpоскопiчнe дослщження зpазкiв фeкалiй (ЗФ) (n = 295) для виявлення ооцист Cryptosporidium spp. було проведено 1з застосуванням процедур зба-гачення (в1дцентрово! седиментацй у формалш-eтилацeтатнiй сум1ш1 з використанням фекального концентратора Mini Parasep® SF — EU Facal Parasite Concentrator виробництва Apacor Ltd., Англ1я) [18], виготовлення мазков, !х фарбування модиф1кова-ним (холодним) методом за Цилем — Нiльсeном та свгтлово! мкроскопй пpeпаpатiв для в1зуал1зацй притаманних пошуковим ооцистам дифepeнцiйниx ознак, як викладено нами pанiшe [19].
Виявлення специф1чних Ig (IgE, IgG, IgM, IgA) та визначення 1х р1вн1в (титр1в) у зразках сироватки кров! (ЗСК) (n = 78) проведено за допомогою реак-ц!! непрямо! 1мунно! флуоресценцй (РН1Ф) 1з використанням експериментального дiагностикуму nOArCrypto (абpeвiатуpа в!д «повний ооцистний антиген C.parvum»), виготовленого в лаборатори нових i маловивчених iнфeкцiйниx захворювань ДУ «1нститут мкробюлогй та 1мунолог1! 1м. I.I. Мечникова НАМН Укра'ни» за технолопею, детально описан ою в [20]. Д1агностикум ПOArCrypto являе собою
предметш скельця (76 х 26 х 1 мм) з епоксидним по-криттям синього кольору та 1зольованими реакцш-ними лунками (д1аметром 12 х 5 мм), до поверхш яких 1ммоб1л1зовано кал1бровану ильюсть очищених ооцист (на р1вн1 30-60 у кожному пол1 зору за умови сумарного зб1льшення м1кроскопу х1000) регюналь-ного штаму C.parvum ЛНМ1З 3/2018, видову прина-лежн1сть якого попередньо було !дентиф1ковано методом стандартно! пол1меразно! ланцюгово! реакц!! (ПЛР) з використанням «Набору реагенлв для амп-л1ф1кац!! ДНК Cryptosporidium parvum. Gene Pak®PCR test» виробництва ф1рми IsoGene Lab. ltd (РФ).
Основний методичний принцип застосованого типового формату РН1Ф Грунтуеться на можливосп утворення специф1чного комплексу: ПOArCrypto + специф1чн1 Ig досл1джувано! сироватки + антивидов! Ig проти IgE, IgG, IgM, IgA людини, як1 м1чен1 флуоресцентним барвником (флуоресце!н-1зотю-ц1анатом, Ф1ТЦ), що дозволяе при проведенш лю-м1несцентно! м1кроскопй виявляти (в1зуал1зувати) вказаний об'еднаний комплекс [20]. Як антивидов1 флуоресц1ююч1 Ig було використано комерцшш сух1 Ig проти IgE, IgG та IgM людини виробництва ф1-л1алу «МЕДГАМАЛ» ДУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН» (РФ), а також експериментальш антивидов1 Ig флуоресц1-ююч1 р1дк1 проти IgA людини, виготовлеш в лабо-раторй 1мунологй, патоморфологй та молекулярно! генетики ДУ «1нститут дерматолог!! та венеролог!! НАМН Укра'ни» i люб'язно надан1 д-ром мед. наук О.П. Бтозоровим.
При позитивних результатах РН1Ф (коли досл1-джувана сироватка м1стить специф1чн1 Ig) спосте-р1гаеться характерне св1т1ння ПOArCrypto (смараг-дово-зелене з б1льшою яскрав1стю по зовшшньому краю ст1нки ооцист C.parvum) на темному тл1 препарату. 1нтенсивн1сть зазначено! флуоресценцй' оц1-нювали за 4-хрестовою системою (в1д «4+» до «—»), при цьому за титр специф1чних IgE, IgG, IgM та ^А приймали останне (найбтьше) розведення сироватки, яке ще обумовлюе 1нтенсивн1сть флуоресценцй' ПOArCrypto не нижче в1д «3+».
Визначення титру специф1чних Ig у досл1джу-ваних ЗСК проведено з використанням 2-кроково! тактики: спочатку тестувались ус1 ЗСК у початково-му розведенн1 1 : 8 для виявлення специф1чних IgE, а у подальшому визначали р1вень специф1чних IgE, IgG, IgM та ^А лише у тих ЗСК (з посл1довним дво-разовим !х розведенням в1д 1 : 16 до 1 : 1024), з яки-ми РН1Ф була позитивна у початковому розведенш. Для тдвищення специф1чност1 i чутливост1 РН1Ф (зниження ймов1рност1 помилкових позитивних ре-акц1й) перше розведення ЗСК робили у 0,15 М фос-фатно-сольовому буфер1 (ФСБ) з рН = 7,2, що м1с-тив 0,2 % (маса/об'ем) альбумшу сироватки бика, а наступш розведення у ФСБ без додавання остан-нього.
Статистичну обробку експериментальних даних проведено в1дпов1дно до правил альтернативно! i рядово! вар1ацшно! статистики [21].
Результати
За результатами мкроскошчного досл1дження ЗФ в1д 295 д1тей 1з ГК1, ооцисти Cryptosporidium spp. було виявлено в 11 (4,2 %) 1з них. Ооцисти мали одно-типш морфолог1чн1 i тинктор1альн1 характеристики: правильну округлу форму з товстою стшкою, д1аметр близько 4,5 х 5,5 мкм, притаманну внутр1шню струк-турованють, ст1йке збереження забарвлення карбо-ловим фуксином (у р1зн1 в1дт1нки яскраво-червоного кольору) шсля д1! кислотного деколайзера (рис. 1).
Визначеш за допомогою свГтлово! м1кроскоп1! характеристики ооцист криптоспоридш не дозволяють над1йно 1дентиф1кувати !х види. Тому приналежн1сть виявлених ооцист до виду C.parvum встановлено на основ1 позитивного результату ПЛР в1дпов1дного призначення (рис. 2).
На першому етап1 скриншг-тестування 78 ЗСК (у розведенн1 1 : 8) в1д д1тей 1з ГК1, виконаного методом РН1Ф 1з застосуванням д1агностикуму ПOAгCrypto, було отримано 68 (87,2 %) позитивних результат1в ре-акцГ1 виявлення специф1чних IgE (рис. 3).
Результати виконання другого етапу досл1джень ЗСК в1д дггей 1з ГК1 дозволили встановити як загаль-ну частоту виявлення специф1чних Ig р1зних клас1в, так i вар1ац1ю !х титр1в, як1 в жодному випадку не досягали р1вня 1 : 128 (табл. 1).
Обговорення
Виявлення ооцист Cryptosporidium spp. у випорож-неннях е одним 1з (чотирьох юнуючих) лабораторних критерпв, що найб1льш активно застосовуеться у св1-тов1й медичн1й практиц1 для встановлення д1агнозу криптоспорид1озу та вивчення його поширеност1 на певних територ1ях чи серед конкретних груп населен-ня, у тому числ1 й д1тей [1, 2, 10, 11, 22—24]. Нами при цгльовому обстеженш 295 д1тей 1з ГК1 Донецько! обл. частота фекально! екскрец!! ооцист криптоспорид1й встановлена на р1вн1 4,2 %. Виявлен1 ооцисти мали типов1 морфолог1чн1 та тинктор1альн1 ознаки (рис. 1) i методом ПЛР !дентиф1коваш як C.parvum (рис. 2). Цей вид найчаст1ше е етюлопчним чинником зооноз-ного/зооантропонозного криптоспорид1озу у аграр-них та аграрно-1ндустр1альних кра'нах св1ту, тод1 як ф1логенетично близький вид C.hominis переважае у кра'нах 1з 1ндустр1альною та 1ндустр1ально-аграрною економ1кою, спричинюючи антропонозну 1нваз1ю [3, 5—7, 26, 27]. Визначена нами частота виявлення ооцист криптоспоридш у ЗФ в1д дггей 1з ГК1 е досить близькою до аналопчного показника (OEP 1,4—4,1 %), який притаманний економ1чно розвинутим кра-!нам св1ту 1з в1дносно низьким р1внем спорадично! захворюваност1 на криптоспорид1оз (США, Канада, Англ1я, Н1меччина, Н1дерланди тощо) [4, 5, 27]. Проте середнш щор1чний р1вень захворюваност1 на криптос-поридюз населення у цих кра'нах (з урахуванням оф1-ц1йно зареестрованих випадыв) становить у ц1лому 1,29—8,25, а серед дггей — 6,6—10,5, на 100 тис., тод1 як в Укра!н1, зпдно з даними, представленими у «Щор1ч-них допов1дях про стан здоров'я населення, саштар-но-еп!дем1чну ситуац1ю та результати д1яльност1 сис-
Рисунок 1. Морфологiчнi i тинкторiальнi характеристики ооцист криптоспоридш (свтлова Mi^o-скоп'я, забарвлення модифкованим методом за Цилем — Нльсеном, масляна '¡мерс'я, сумарне збльшення х1500)
теми охорони здоров'я Укра'ни» за 2013—2016 роки, ц1 штенсивш показники е нижчими бгльш н1ж у 60 раз1в i досягають значень 0,04—0,11 та 0,11—0,20 на 100 тис. вгдповгдно. За висновком фах1вц1в Мшютерства охорони здоров'я Укра'ни, вказаш вище показники що-р1чного р1вня захворюваност1 населення на криптос-поридюз «_не в1дображають 1стинно! 1нвазованост1, що сприяе появ1 його можливих спалах1в».
Перепонами для з'ясування реального р1вня по-ширеност1 криптоспорид1озу в Укра!н1 е чисельн1 як суб'ективн1, так i об'ективн1 чинники. Основн1 серед останшх — пер1одичн1сть екскрец!! ооцист Cryptosporidium spp., що вгдображае особлив1сть жит-тевого циклу цих найпрост1ших та змушуе для !х виявлення збшьшувати кратн1сть повторюваного вгд-
V v
Рисунок 2. Приклад вiзуалiзацíí результа^в щенти-фкацп ооцист C.parvum методом ПЛР з викорис-танням «Набору реагентов для амплiфiкацií ДНК Cryptosporidium parvum. Gene Pak®PCR test» ви-робництва ф'рми IsoGene Lab. ltd (збльшення x2): треки 1 i 2 — завдомо позитивний (К+) та негатив-ний (К-) контрол'1 вдтворення ПЛР iз використано-го набору реагентв в'1дпов'1дно; треки 3-8 — пози-тивн результати ПЛР, як отримано при тестуванн ооцист, виявлених у ЗФ вд дтей з ГК1
2
3
4
5
6
7
8
Рисунок 3. Зовн'1шн'1Й вигляд експериментально-го дiагностикуму nOArCrypto3/2018 для визна-чення методом РН1Ф специфiчних Ig у ЗСК (1) та люм'1несцентно-м'1кроскотчна картина позитивного результату РНФ з нтенсивнстю свтння «4+» комплексу nOArCrypto + специфiчнi Ig + антиви-довi Ig/ФТЦ (оптична система для роботи з Ф1ТЦ, нефлуоресц'1ююча масляна 'мерЫя, сумарне збль-шення х1000)
бору i дослщження ЗФ (при 3-разовому дослщженш через добу кожне наступне додае близько 20 % пози-тивних результапв вщ частоти отриманих у першо-му/одноразовому ан^з^; домшування (> 60—80 %) субкшшчних i легких швидкоплинних форм перебь гу криптоспоридюзу iз невисоким рiвнем фекально! екскрецп ооцист, якi зазвичай залишаються недiа-гностованими; вiдносно низька чутливють мкроско-пiчного методу, що навiть за оптимальних умов його застосування дозволяе виявляти ооцисти паразипв у концентраций > 104 у 1 г/мл дослщжуваного зразка бiоматерiалу; неможливiсть за допомогою мшроскопп надшно iдентифiкувати види Cryptosporidium, у тому чи^ й найбiльш клiнiчно значущi у патологи людини C.parvum i C.hominis (спричинюють > 90 % випадтв захворювань), якi характеризуються щентичною мор-фологiею i тинкторiальними властивостями ооцист, подiбною антигенною структурою, але не здатнi обмь нюватись генетичним матерiалом, певною мiрою рiз-няться за патогенезом i клiнiчним проявом обумов-лених хвороб та епщемюлопчними особливостями !х поширення [1, 6, 23—27]. Тому саме показники частоти виявлення у дослщжуванш популяцп специфiчних
якi в силу зазначених вище та низки шших обста-вин бiльш адекватно вщображають iнтенсивнiсть ет-демiчного процесу криптоспоридюзу i вiдiграють про-вiдну роль при ощнщ сощально-медично! значимостi цього паразитозу та при визначенш прюритетних за-ходiв для протидп його поширенню [12—17].
Наскiльки нам вщомо, це перше дослiдження се-ропоширеност криптоспоридiозу як серед населення в Укра'1ш взагат, так i у когорт дiтей з ГК1 зокрема. 1з даних табл. 1 видно, що у ЗСК вщ дггей iз ГК1 загальна частота виявлення специфiчних (87,2 %) переви-щувала (р < 0,05) вщповщну частоту будь-якого 1х кла-су (^О, IgM та IgА). У свою чергу, показник наявност специфiчних IgG (50 %) е вiрогiдно вищим (р < 0,05) вщносно значень аналопчних показник1в для ^М (30,8 %) i IgА (17,9 %), а деяка вщмшшсть мiж частотою виявлення двох останшх класiв специфiчних Ig не набула статистично! значущостi (р > 0,05). Результата анал1зу кореляцшно! залежност мiж одночасною наявнiстю (в одних i тих самих ЗСК, п = 78) сумарних i рiзних класiв специфiчних Ig показали, що ^О вияв-лялись тiльки у певнш частинi ЗСК (57,4 %), яы дали позитивний результат РН1Ф щодо присутностi вщпо-вiдних (коефiцiент кореляци Фехнера, гф, стано-вить +0,26); IgМ (у 61,5 %) та ^А (у 35,9 %) — лише сумюно iз специфiчними IgG (гф набув значень +0,23 та —0,28 вщповщно), а ^А (у 58,3 %) — разом iз IgМ (Гф = +0,17). Тльки три ЗСК походили вщ дiтей iз ГК1, у фекал1ях яких було виявлено ооцисти С.рагуит. У цих ЗСК встановлена наявшсть специфiчних IgG та ^М, а у двох iз них — додатково IgА. При цьому 1х титри не були помггао вищими, нiж у ЗСК вщ дiтей без виявлено! фекально! екскрецп ооцист паразитiв.
В аспект обговорення отриманих нами результатiв дослщження необхщно пiдкреслити, що до сьогодш виявлення специфiчних Ig не набуло статусу окремо-го лабораторного критерш для дiагностики криптос-поридiозу (особливо його гострих кшшчно виражених форм) в силу багатьох причин: недостатньо вивчено особливост iмунно1 вiдповiдi хазяша при криптос-поридiйнiй iнвазií, ^ як наслiдок цього, залишаються нез'ясованими низка притаманних 1й «нетипових» iмунологiчних феноменiв; не налагоджено виробни-цтво комерцiйних (валщних) тест-систем для кшьюс-ного визначення специфiчних що, у свою чергу, обумовлюе вiдсутнiсть унiфiкованих протоколiв ви-
Таблиця 1. Частота виявлення i титри специфiчних Ig у ЗСК вщ дтей iз ГК1
Cne^0i4Hi Ig, як виявлено Титр специфiчних Ig i частота його виявлення, абс. (%)
у ЗСК вщ д^ей i3 ГК1 (n = 78) 1 : 8 1 : 16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 Усього
Igs 14 (17,9) 25 (32,1) 24 (32,1) 5 (6,4) 0 68 (87,2)
igG 22 (28,2) 7 (9,0) 9 (11,0) 1 (1,3) 0 39 (50,0)*
igM 6 (7,7) 9 (11,5) 5 (6,4) 4 (5,1) 0 24 (30,8)*
igA 9 (11,5) 5 (6,4) 0 0 0 14 (17,9)*
Примкка: * — вiдмiннiсть показника досягае статистичноi значущост (р < 0,05) порiвняно ¡з частотою виявлення специфiчних IgT..
конання тематичних досл!джень та загальноприйня-тих дiагностично-значимих титрiв (концентрацiй) пошукових Ig; ретроспективна спрямованiсть отри-муваних результапв аналiзiв, яка спричинена вiдомою «динамшою в!дставання» утворення специфiчних Ig на початковш стад!! клiнiчних проявiв хвороби та найбтьш iнтенсивноï екскрец!! паразипв; недостат-нiй рiвень спiвпадiння (< 41—82 %) як позитивних, так i негативних результапв виявлення у сироватщ кровi специфiчних Ig i3 вiдповiдними результатами мшро-скопiчного виявлення у фекалiях ооцист криптоспоридш, !х антигенiв — iмунологiчними i нуклешових кислот — молекулярно-генетичними методами [12, 14, 15, 20, 23-25, 28].
Зазначене певною мiрою стосуеться i проведення сероепiдемiологiчних дослiджень з метою вивчення поширеност криптоспоридiозу. Так, для визначення частоти наявност i титрiв специфiчних Ig у ЗСК об-стежуваних груп населення шоземними науковцями продовжують застосовуватись декiлька авторських (експериментальних) варiантiв iмуноферментного аналiзу (переважно твердофазного — Т1ФА), вер-стерн-блоту (ВБ) та РН1Ф, якi мають сво! переваги i недолiки та рiзняться мiж собою за чутливютю, спе-цифiчнiстю i вiдтворюванiстю результата, що е причиною незадовтьно! спiвставностi останнiх [14-16, 29]. Хоча за рiвнем чутливостi, специфiчностi та мож-ливiстю нiвелювання впливу суб'ективного чинника на оцшку результату досл!джень РН1Ф поступаеться методам Т1ФА i ВБ, проте ïï перевагами е в!дносна простота технолог!! вiдтворення i можливють вико-ристання для виготовлення nOArCrypto регiональних штамiв C.parvum.
Проведене нами визначення наявност специф!ч-них Ig у ЗСК в!д дггей ГК1 пiдтверджуе висновок зарубiжних науковцiв щодо придатностi РН1Ф для вивчення серопоширеност криптоспоридюзу у цто-му [15, 20]. 1нший важливий висновок iноземних фа-х!вщв полягае у тому, що самi величини титру специ-ф!чних Ig мають другорядне значення, тод! як частота !х виявлення (SPI) у досл!джуваних популяц!ях оаб е основним показником для анал!зу ризиыв поширен-ня криптоспоридюзу [12-15, 20, 29]. Тому на сьогод-ш в р!зних кра!нах св!ту при проведенш досл!джень !муноструктури населення з метою визначенням SPI криптоспоридюзу найчастше застосовуеться опти-м!зований методичний п!дступ оцшки популяцшно! поширеност специф!чних IgG (р!дше — через ниж-чу бюмаркерну надшшсть, специф!чних IgZ, IgM та IgA) тестуванням ЗСК лише у певному розведенш для встановлення наявносп/вщсутносп порогового титру зазначених Ig (англ. threshold titer Ig). При цьо-му, виконуючи так! досл!дження у регюнах в!дносно низьким р!внем спорадично! захворюваност на крип-тоспоридюз, пороговий титр специф!чних IgG переважно визначають у ЗСК при ix розведеш в!д 1 : 10 до 1 : 40, а здшснюючи так! ж сам! скриншг-тестування ЗСК в!д людей регюшв з високим ендем!чним р!в-нем цього паразитозу, розведення сироватки тдви-щують до 1 : 50 (або 1 : 100) [12-15, 29, 30].
З урахуванням проаналiзованих чисельних даних зарубiжних науковщв i результата наших власних до-слiджень (частину з яких не вщображено у цiй стат-Ti) при вивченнi серопоширеностi криптоспоридiозу серед рiзних груп населення в Укра!ш наявнiсть спе-цифiчних IgG доцтьно визначати у пороговому титрi 1 : 16 (або 1 : 20). За таких умов значення 1СП криптоспоридюзу серед обстежено! нами когорти датей iз ГК1 Донецько! обл. становить 21,8 %, що ютотно пе-ревищуе (р < 0,05) визначений у них показник ЧЕО (4,2 %). Встановлене нами значення 1СП криптоспоридюзу у датей iз ГК1 е близьким до результата (SPI 20 %) подiбних дослiджень, отриманих науковцями Федеративно! Республши Бразилiя (ФРБ), якими теж було використано РН1Ф для виявлення у сироватщ кровi в!д груп осiб високого ризику специфiчних IgG [20]. Проте, згiдно iз представленими в ix роботi да-ними, у ФРБ рiвень ЧЕО у iмунокомпетентниx дiтей з дiареею (OEP 12,1 %) е в 2,9 раза вищим вiд визна-ченого нами.
Висновки
1. Криптоспоридюз е актуальною проблемою су-часно! iнфектологiï, що обГрунтовуе необxiднiсть вивчення його поширеносп, насамперед серед груп населення з високим ризиком виникнення хвороби, до яких належать i дгти.
2. За результатами мшроскошчного дослщження зразыв фекалш вiд 295 дiтей iз ГК1 Донецько! обл. частота екскрецй' ооцист криптоспоридш становила 4,2 %. Виявлеш ооцисти мали xарактернi морфолопч-ш i тинкторiальнi властивостi та методом ПЛР щенти-фiкованi як C.parvum.
3. У 78 ЗСК в!д цих дгтей методом РН1Ф iз ви-користанням дiагностикуму ПОАгСгур!о визначено частоту наявност i титри специфiчниx IgZ, IgG, IgM та IgA, що дозволило встановити шдекс серопошире-ност криптоспоридiозу на рiвнi 21,8 % (при пороговому титрi специфiчниx IgG 1 : 16).
4. За показниками частоти екскрецй' ооцист паразита та наявностi специфiчниx IgG Донецьку область слiд вщнести до регiонiв iз вiдносно невисоким р!в-нем спорадично! заxворюваностi дгтей на криптоспоридюз.
Конфлжт штереяв. Автори заявляють про вщсут-нють конфлшту iнтересiв та власно! фшансово! заць кавленостi при шдготовщ дано! стати.
1нформашя про фшансування. Дослщження ви-конано за рахунок бюджетного фшансування НАМН Укра!ни (КПКВК 6561040) прикладно! НДР «Удоско-налення методiв лабораторно! дiагностики криптоспоридюзу», № державно! реестрац!! 0117U002283.
References
1. Chalmers RM, Davies AP. Minireview: clinical cryptospo-ridiosis. Exp Parasitol. 2010;124(1):138-146. DOI: 10.1016/j. exppara.2009.02.003.
2. Wang RJ, Li JQ, Chen YC, Zhang LX, Xiao LH. Widespread occurrence of Cryptosporidium infections in patients with
HIV/AIDS: Epidemiology, clinical feature, diagnosis, and therapy. Acta Trop. 2018;187:1617-1625. DOI: 10,1016/j.actatro-pica.2018.08.018.
3. Pisarski K. The global burden ofdisease ofzoonotic parasitic diseases: Top 5 Contenders for priority consideration. Trop Med InfectDis. 2019;4(1)44. DOI: 10.3390/tropicalmed4010044.
4. Bamaiyi PH, Redhuan EM. Prevalence and risk factors for cryptosporidiosis: a global, emerging, neglected zoonosis. Asian Biomed. 2017;10(4):309-325. DOI: 10.5372/19057415.1004.493.
5. Cacció SM, Chalmers RM. Human cryptosporidiosis in Europe. Clin Microbiol Infect. 2016;22(6):471-480. DOI: 10.1016/j.cmi.2016.04.021.
6. Putignani L, Menichella D. Global distribution, public health and clinical impact of the protozoan pathogen Cryptospo-ridium. Interdisciplinary Perspectives Infect Dis. 2010;2010(ID 753512):39. DOI: 10.1155/2010/753512.
7. Cacció SM, Putignani L. Epidemiology of human cryptosporidiosis. In Cryptosporidium: Parasite and Disease. SpringerVerlag Wien. 2014:43-79. DOI: 10.1007/978-3-7091-1562-6 2.
8. Sánchez A, Prats-van der Ham M, Tatay-Dualde Jet al. Zoonoses in Veterinary Students: A Systematic Review of the Literature. PLOS One. 2017;12(1):e0169534. DOI: 10.1371/jour-nal.pone.0169534.
9. Khalil IA, Troeger C, Rao PC et al. Morbidity, mortality, and long-term consequences associated with diarrhoea from Cryp-tosporidium infection in children younger than 5 years: a meta-analyses study. Lancet Global Health. 2018;6(7):e758-e768. DOI: 10.1016/S2214-109X(18)30283-3.
10. Korpe PS, Valencia C, Haque R et al. Epidemiology and Risk Factors for Cryptosporidiosis in Children From 8 Low-income Sites: Results From the MAL-ED Study. Clin Infect Dis. 2018;67(11):1660-1669. DOI: 10.1093/cid/ciy355.
11. Kotloff KL, Nataro JP, Blackwelder WC et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study. Lancet. 2013;382(9888):209-222. DOI: 10.1016/S0140-6736(13)60844-2.
12. Exum NG, Pisanic N, Granger DA et al. Use of Pathogen-Specific Antibody Biomarkers to Estimate Waterborne Infections in Population-Based Settings. Curr Environ Health Rep. 2016;3(3):322-334. DOI: 10.1007/s40572-016-0096-x.
13. Becker DJ, Oloya J, Ezeamama AE. Householdsocioeco-nomic and demographic correlates of Cryptosporidium seropositi-vity in the UnitedStates. PLoSNegl Trop Dis. 2015;9(9):e0004080. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004080.
14. Elwin K, Chalmers RM, Hadfield SJ et al. Serological responses to Cryptosporidium in human populations living in areas reporting high and low incidences of symptomatic cryptospo-ridiosis. Clin Microbiol Infect. 2007;13(12):1179-1185. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2007.01823.x.
15. Casemore D. Towards a US national estimate of the risk of endemic waterborne disease — sero-epidemiologic studies. J Water Health. 2006;4(2):121-163. DOI: 10.2166/wh.2006.021.
16. Elshahawy I. A serological survey on cryptosporidiosis in Najran region, Southwestern Saudi Arabia with reference to some epidemiological features of the infection. Int J Adv Med. 2017;4(4):887-893. DOI: 10.18203/2349-3933.ijam20172606.
17. Khan A, Shams S, Khan S, Khan MI, Khan S, Ali A Evaluation of prevalence and risk factors associated with Cryp-tosporidium infection in rural population of district Buner, Pakistan. PLoS ONE. 2019;14(1):e0209188. DOI: https://doi.
org/10.1371/journal.pone. 0209188.
18. Pokhil SI, Tymchenko OM, Yakovenko DV, Chigirin-skaya NA, Kostyria IA, Nesterenko AM. Practical experience in using the Mini Parasep faecal parasite concentrator for Cryptosporidium spp. oocysts detection in stool. Annals of Mechnikov Institute. 2018;3:33-40. DOI: 10.5281/zenodo.1456534.
19. Yakovenko DV, Pokhil SI, Tymchenko OM, Chigi-rinskaya N.A, Kostyria IA. Evaluation of differential efficiency of staining methods for Cryptosporidium oocysts. Bulletin of Problems Biology and Medicine. 2018;4(146):198-213. DOI: 10.29254/2077-4214-2018-4-1-146-198-203 (in Ukrainian).
20. Braz LM, Amato VN, Ferrari CI et al. Human cryptosporidiosis: detection of specific antibodies in the serum by an indirect immunofluorescence. Rev Saude Publica. 1996;30(5):395-402. DOI: 10.1590/s0034-89101996000500001.
21. Lakin GF. Biometrics: guide. 4th ed., revised and updated. Moscow: Higher school, 1990.352p. ISBN5-06-000471-6(in Russian).
22. Order of the Ministry of Health of Ukraine No. 905dated December 28, 2015«On approval of the criteria for determining the cases of infectious andparasitic diseases that are subject to registration». www. moz.gov.ua/ua/portal/dn_20151228_0905.html (in Ukrainian).
23. Checkley WA, White AC, Jaganath D et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for cryptosporidium. Lancet Infect Dis. 2015;15(1):85-94. DOI: 10.1016/S1473-3099(14)70772-8.
24. Ghazy AA, Abdel-Shafy S, Shaapan RM. Cryptospo-ridiosis in animals and man: 2. Diagnosis Asian J Epidemiol. 2015;8(4):84-103. DOI: 10.3923/aje.2015.84.103.
25. Chalmers RM, Katzer F. Looking for Cryptosporidium: the application of advances in detection and diagnosis. Trends Parasitol. 2013;29(5):237-251. DOI: 10.1016/j.pt.2013.03.001.
26. Ryan U, Fayer R, Xiao L. Cryptosporidium species in humans and animals: current understanding and research needs. Parasitol. 2014;141:1667-1685. DOI: 10.1017/S0031182014001085.
27. Painter JE, Hlavsa MC, Collier SA, Xiao L, Yoder JS. Centers for Disease Control and Prevention. Cryptosporidiosis Surveillance — United States, 2011-2012. MMWR Surveillance Summaries. 2015;64(3):1-14. Available from: https://www.cdc. gov/mmwr/pdf/ss/ss6403.pdf
28. Lee J-K, Han E-T, Huh S, Park W-Y, Yu J-R. A Hospital-Based Serological Survey of Cryptosporidiosis in the Republic of Korea. Korean J Parasitol. 2009;47(3):219-225. DOI: 10.3347/kjp.2009.47.3.219.
29. Farkas K, Plutzer J, Moltchanova E et al. Serological responses to Cryptosporidium antigens in inhabitants of Hungary using conventionally filtered surface water and riverbank filtered drinking water. Epidemiol Infect. 2015;143(13):2743-2743. DOI: 10.1017/S0950268814003859.
30. Priest JW, Bern C, Xiao L, et al. Longitudinal analysis of cryptosporidium species-specific immunoglobulin G antibody responses in Peruvian children. Clin Vaccine Immunol. 2006;13(1):123-131. DOI: 10.1128/CVI.13.1.123-131.2006.
OTpuMaHo/Received 12.06.2019 Рецензовано/Revised 23.06.2019 npuMH^TO go gpyKy/Accepted 29.06.2019 ■
Яковенко Д.В.1, Похил С.И.2, Тимченко Е.Н.2, Торяник И.И.2, Чигиринская Н.А.2, Костыря И.А.2 1КМУ «Детское территориальное объединение», г. Краматорск Донецкой обл., Украина 2 ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины», г. Харьков, Украина
Распространенность криптоспоридиоза у детей с диареей в Донецкой области, Украина
Резюме. Актуальность задачи по снижению социально-медицинского бремени протозойных кишечных болезней, вызываемых апикомплексными паразитами рода Cryptosporidium, обосновывает необходимость изучения их распространенности среди групп населения высокого риска, к которым принадлежат и дети. Для установления уровня распространенности криптоспоридиоза в Донецкой области проведено целевое обследование 295 детей (возрастом до 17 лет) с острой кишечной инфекцией с водянистой диареей. По результатам микроскопии мазков фекалий (n = 295), обогащенных формалин-этилаце-татной седиментацией в фекальном концентраторе Mini Parasep® SF и окрашенных модифицированным способом по Цилю — Нильсену, частота экскреции ооцист крипто-споридий (ЧЭО) составила 4,2 %. Обнаруженные ооцисты имели характерные морфологические и тинкториальные
свойства и методом полимеразной цепной реакции идентифицированы как C.parvum. Применяя реакцию непрямой иммунной флуоресценции с использованием диаг-ностикума nOArCrypto (фиксированные к поверхности предметного стекла очищенные ооцисты регионального штамма C.parvum ЛНМИЗ 3/2018), в образцах сыворотки крови детей (n = 78) определена частота наличия и титры специфических IgX, IgG, IgM и IgA. При пороговом титре специфических IgG 1 : 16 индекс серораспространенности (ИСП) криптоспоридиоза в когорте обследованных детей достигал 21,8 % и превышал выявленную у них ЧЭО (р < 0,05). С учетом показателей ЧЭО и ИСП Донецкую область следует отнести к регионам с относительно невысоким уровнем заболеваемости детей криптоспоридиозом. Ключевые слова: дети; криптоспоридиоз; экскреция ооцист; специфические иммуноглобулины
D.V. Yakovenko1, S.I. Pokhil2, O.M. Tymchenko2, I.I. Torianyk2, N.A. Chigirinska2, I.A. Kostyria2 1MHCI "Children's Territorial Medical Association", Kramatorsk, Donetsk region, Ukraine
21. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine
The prevalence of cryptosporidiosis in children with diarrhea in Donetsk region, Ukraine
Abstract. An urgent task is to reduce the social and medical burden of protozoal intestinal diseases caused by apicomplexan parasites of the genus Cryptosporidium. This justifies the need to study their prevalence among high-risk populations, which also include children. To determine the prevalence of cryptosporidiosis in Donetsk region (Ukraine), a targeted survey was conducted in 295 children (under the age of 17) with acute intestinal infection, which was clinically manifested by watery diarrhea. According to the results of microscopy of fecal smears (n = 295), concentrated (with formalin-ethyl acetate sedimentation in the fecal concentrator Mini Parasep® SF) and stained (by a modified Ziehl-Neelsen method), the prevalence of cryptosporidium oocyst excretion (OEP) was 4.2 %. All detected oocysts had characteristic morphological and tinctorial
properties and were identified by polymerase chain reaction as C.parvum. The presence frequency and titers of specific IgX, IgG, IgM and IgA in the blood serum of children (n = 78) were determined in the indirect immune fluorescence reaction with POAgCrypto diagnosticum (purified oocysts of the regional strain C.parvum LNLEID 3/2018, fixed on the surface of the slides). The seroprevalence index of cryptosporidiosis in the cohort of children surveyed reached 21.8 % (with a threshold titer of specific IgG 1 : 16) and exceeded the OEP found in them (p < 0.05). Taking into account the indicators of OEP and serop-revalence index, Donetsk region should be considered as area with relatively low prevalence of cryptosporidiosis in children. Keywords: children; cryptosporidiosis; oocyst excretion; specific immunoglobulins
