CC BY
40
УДК 575.167
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ГРУПП MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
ПО РАЙОНАМ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ
© 2014 И.С. Концевая1, В.В. Николаевский3, А.В. Садыхова1, А.М. Ковалёв2, О.А. Игнатьева1, Ю.Д. Родионова2, Я.М. Балабанова3, О.Н. Макурина1
1 Самарский государственный университет, г. Самара 2Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н.В. Постникова, г. Самара
3Колледж королевы Марии Университета Лондона
Поступила 13.02.2014
В статье рассмотрена структура популяции возбудителя туберкулеза легких Mycobacterium tuberculosis и распространенность различных генетических групп и кластеров штаммов по районам Самарской области.
Ключевые слова: туберкулез, Mycobacterium tuberculosis, кластеры, генетические группы, районы Самарской области.
Туберкулез остается важной проблемой здравоохранения во всем мире и Российской Федерации в частности. Самарская область относится к регионам России с неблагоприятной обстановкой по туберкулезу, где уровень заболеваемости в 2011 году (78,5 случаев на 100 тыс. населения) превышает средний показатель по стране (73,0 случая на 100 тыс. населения) [11]. Особую тревогу вызывает рост уровней заболеваемости лекарственно-устойчивыми штаммами возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis. Преобладающим семейством штаммов, циркулирующим в Самарской области, является семейство Beijing [12]. Оно характеризуется высокой степенью внутригрупповой гомогенности, а также повышенной вирулентностью, патоген-ностью и ассоциированностью с лекарственной устойчивостью [3-6, 10].
К настоящему времени имеются лишь единичные данные по популяционно-генетической структуре штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области, распространенности различных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью и вирулентностью.
Целью данного исследования было изучение генетической структуры популяции и закономерностей циркуляции и распространения основных генетических групп M. tuberculosis в Самарской области.
Концевая Ирина Сергеевна, аспирант, belka@ostin.org; Николаевский Владислав Владленович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, v.nikolayevskyy@qmul.ac.uk; Садыхова Анна Викторовна, аспирант, antima2008@rambler.ru; Ковалёв Александр Михайлович, кандидат биологических наук, alexferreiro@yandex.ru; Игнатьева Ольга Андреевна, аспирант, ignatyevaolga@rambler.ru; Родионова Юлия Дмитриевна, кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией, u.d.mashk0va@gmail.com; Балабанова Янина Михайловна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, y.balabanova@qmul.ac.uk; Макурина Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор, makurina.on@mail.ru
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили 1304 изолята M. tuberculosis, выделенных из мокроты пациентов с бактериологически подтвержденным диагнозом туберкулез легких, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в противотуберкулезных учреждениях Самарской области. Из них у 807 (61,89%) пациентов туберкулез был выявлен впервые, а 497 (38,11%) пациентов получали противотуберкулезное лечение в прошлом.
Обработку мокроты, выделение чистых культур микобактерий и их идентификацию, а также тесты на лекарственную чувствительность проводили с использованием системы автоматизированных жидких питательных сред BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) в соответствии с рекомендациями производителя [18]. Выделение ДНК из изолятов производили методом нагревания с хлороформом. Молекулярно-генетический анализ ДНК изолятов включал (1) сполиготипирование с гибридизацией на мембранах с нанесенными олигонукле-отидными пробами [16] и (2) генотипирование по 9-ти и 17-ти локусам VNTR для штаммов семейства Beijing (VNTR 1982, 2163B, 3232, 4052, MIRU 10, 23, 26, 31, 40) и штаммов остальных семейств (VNTR 1982, 3232, MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40, ETR-A, B, C) соответственно [19].
Кластерный анализ проводили с использованием программы Bionumerics v. 6.1 (Applied Maths, Ghent, Бельгия). Генетические группы штаммов определяли с помощью всемирной базы данных MIRU-VNTR/>lus (http://www.miru-
vntrplus.org/MIRU/index.faces) на основании данных сполиготипирования и VNTR-типирования.
Статистическую обработку результатов геноти-пирования и выявление значимых ассоциаций проводили при помощи программы WINPEPI. Для сравнения распределения генетических групп M. tuberculosis среди штаммов, объединенных общими фенотипическими признаками, использовали критерий согласия Пирсона (х2). Для сравнения распределения генетических групп M. tuberculosis использо-
вали показатель соотношения (RR) с 95%-ным интервалом достоверности (CI).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследованной нами выборке 71,6% составляли штаммы семейства Beijing, при этом доля штаммов семейств, принадлежащих к Евро-Американской группе (Haarlem, LAM, S, Uganda, Ghana, Cameroon, URAL и X) составила 23,2%. Наибольшее количество штаммов Евро-Американской группы, обнаруженных в Самарской области, относилось к семействам LAM (8,9%) и URAL (7,5%). Штаммы остальных семейств встречались значительно реже (0,3-5,7%). Семь штаммов (0,5%) не были определены до семейства использованными в исследовании методами (таб. 1).
Таблица. 1. Распределение генетических групп в исследованной выборке M. tuberculosis
Генетическая группа Количество (% от общего числа штаммов)
Beijing 934 (71,6%)
Cameroon 11 (0,8%)
Delhi/CAS 1 (0,1%)
EAI 1 (0,1%)
Ghana 22 (1,7%)
Haarlem 74 (5,7%)
LAM 116 (8,9%)
S 11 (0,8%)
Uganda 25 (1,9%)
URAL 98 (7,5%)
X 4 (0,3%)
Неклассифированные 7 (0,5%)
Всего 1304
Таблица 2. Распределение пациентов, включенных в исследование, по районам проживания
Место проживания Количество пациентов в
(город или район) исследовании
Самара 549
Тольятти 154
Сызрань 104
Чапаевск 64
Новокуйбышевск 51
Кинельский 39
Красноярский 29
Похвистнево 26
Ставропольский 26
Отрадный 14
Жигулевск 13
Кинель-Черкасский 12
Кошкинский 12
Сергиевский 12
Шигонский 12
Приволжский 11
Безенчукский 10
Больше-Глушицкий 10
Борский 10
Челно-Вершинский 10
Богатовский 8
Больше-Черниговский 8
Клявлинский 8
Красноармейский 8
Октябрьск 7
Пестравский 7
Шенталинский 7
Елховский 5
Камышлинский 5
Алексеевский 4
Сызранский 4
Исаклинский 3
Нефтегорский 3
БОМЖ 59
Больные легочным туберкулезом, от которых были получены штаммы микобактерий, используемые в данном исследовании, проходили стационарное лечение в девяти специализированных больницах и диспансерах, расположенных в городах Самара (Самарский областной противотуберкулезный диспансер и Самарская областная туберкулезная больница), Тольятти (Тольяттинский противотуберкулезный диспансер), Сызрань (Сызранский противотуберкулезный диспансер), Новокуйбышевск (Новокуйбышевский противотуберкулезный диспансер), Чапаевск (Чапаевский противотуберкулезный диспансер), Отрадный (Отрадненский противотуберкулезный диспансер), Кинель (Кинельский противотуберкулезный диспансер) и Похвистнево (Похвистневский противотуберкулезный диспансер). Наибольшее количество больных находилось на излечении в г. Самаре (843 пациента), наименьшее - в г. Кинеле (11 пациентов).
Больные туберкулезом в нашем исследовании проживали в 9 городах и 22 районах Самарской области. Не имели определенного места жительства на момент исследования 59 пациентов (таб. 2).
С целью выявления особенностей эпидемиологии штаммов микобактерий, циркулирующих в Самарской области, на основании результатов много-локусного VNTR-типирования был проведен кластерный анализ штаммов, при этом штаммы семейства Beijing и остальные штаммы анализировались раздельно. Кластером считались два и более изолята с неразличимыми профилями VNTR. Из кластерного анализа исключили 50 штаммов (3,8%) в связи с неполными данными по профилю VNTR. Уровень кластеризации для группы определялся как отношение количества штаммов, входящих в состав кластеров, к общему количеству штаммов в выборке. Штаммы, не входящие ни в один кластер, считались уникальными. Общий уровень кластеризации составил 81,6% (1024 из 1254 штаммов), при этом уровни кластеризации среди двух групп были достоверно различны, составив в группе Beijing 87,7% (790 из 901 штаммов), а в группе остальных семейств -66,3% (234 из 353 штаммов) (RR=1,323, 95% CI=1,22-1,43). В обеих группах для дальнейшего анализа нами были выделены по 5 кластеров, содержащих наибольшее количество штаммов (табл. 3 и 4).
Наиболее крупные кластеры в семействе Beijing (Samara4, Samara24, Samara12, Samara17 и Samara16) насчитывали от 34 до 253 штаммов, при этом их доля составила 53,72% от общего количества штаммов Beijing (таб. 3). Кластеры в группе штаммов, не относящихся к семейству Beijing, были существенно мельче, при этом на долю пяти крупнейших из них (Samara255, Samara227, Samara205, Samara228 и Samara201) пришлось лишь 20,4% всех штаммов группы (таб. 4).
Уровень кластеризации внутри генетической группы является одним из важных индикаторов, характеризующих как текущий эпидемиологический процесс, так и, возможно, степень эволюционной
«успешности» группы по сравнению с другими. При высоком уровне кластеризации можно предполагать активный эпидемиологический процесс внутри той или иной группы.
Таблица. 3. MIRU-VNTR профиль 5 крупнейших кластеров штаммов, принадлежащих семейству Beijing
Кластер (количество штаммов) Число повторов в локусах
MIRU VNTR
10 23 26 31 40 2163b 3232 1982 4052
Samara4 (n=253) 3 5 5 5 3 6 12 8 6
Samara24 (n=103) 3 5 7 5 3 6 14 6 7
Samara12 (n=54) 3 5 5 5 3 6 14 8 8
Samara17 (n=40) 3 5 5 5 3 6 12 8 8
Samara16 (n=34) 3 5 5 5 3 6 15 8 8
Таблица 4. MIRU-VNTR профиль 5 крупнейших кластеров штаммов, не принадлежащих семейству Beijing
Число повторов в локусах
штаммов) MIRU ETR
2 4 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40 A B C
Samara255 (n=18) 2 2 7 2 2 5 1 1 3 2 2 3 4 2 5
Samara227 (n=17) 1 2 4 3 2 5 1 5 3 2 2 4 2 2 2
Samara205 (n=13) 2 2 4 3 2 5 1 4 3 3 2 3 2 2 3
Samara228 (n=12) 1 2 4 3 2 5 1 5 3 2 2 5 2 2 2
Samara201 (n=12) 2 2 5 3 2 5 1 5 3 3 2 3 3 2 3
Так, на основании обнаруженных нами чрезвычайно высоких показателей кластеризации внутри семейства Beijing (почти 90%), можно сделать вывод о его активной трансмиссии в Самарской области. Важно отметить, что основной вклад в распространение семейства Beijing вносят крупнейшие 5 кластеров, составляющие более половины всех штаммов семейства Beijing в данном регионе. Их особая роль в структуре заболеваемости туберкулезом легких в Самарской области может быть обусловлена как факторами самого микроорганизма (ассоциированность с лекарственной устойчивостью, патогенность и вирулентность), так и внешними популяционно-эпидемиологическими факторами (изначально более высокая распространенность данных штаммов, например в местах лишения свободы).
Полученные данные о распределении групп и уровнях кластеризации штаммов согласуются с предыдущими результатами исследований как в других регионах России [2, 6, 8, 9, 14, 17], так и в Самарской области [1, 13, 15]. Следует отметить, что доля штаммов семейства Beijing в структуре популяции M. tuberculosis в Самарской области за последнее десятилетие выросла с 62,0% в 2001-2002 гг. [15] до 67,9% в 2005 г. [7] и до 71,6% в 2008-2009 гг.
Проведенный нами анализ выявил ряд различий в распространенности генетических групп M. tuberculosis по медицинским учреждениям и районам проживания, при этом проживание в городах было ассоциировано с риском заражения штаммами семейства Beijing, а в сельской местности - штаммами других семейств. Достоверные различия в распространенности по районам были выявлены для кластеров Samara227 и Samara228, не относящихся к Beijing (х2=59,566, р=0,003 и %2=61,044, р=0,002 соответственно), а также кластера Samara17 семейства Beijing (Х2=47,66, р=0,047) и всей группы Beijing в целом (Х2=48,470, р=0,040). По медицинским учреждениям достоверно различалась распространенность кластера Samara4 семейства Beijing (х2=29,448, р<0,005), а также группы кластеров штаммов, не принадлежащих семейству Beijing и не относящихся к пяти крупнейшим кластерам (Х2=16,015, р=0,042).
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о главенствующей роли контактов по месту проживания, работы либо учебы в инфицировании штаммом семейства
Beijing, однако за эпидемиологический процесс отвечает не семейство в целом, а лишь несколько крупных кластеров внутри него. Одной из причин распространенности штаммов семейства Beijing может являться внутриболь-ничное заражение вследствие неадекватных мер инфекционного контроля. Это подтверждается выявленным нами преобладанием кластеров Samara4 (%2=8,574, р=0,003) и Samara24 (%2=6,163, р=0,013) семейства Beijing, среди пациентов, получавших лечение в прошлом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балабанова Я.М. Николаевский В.В., Радди М., Дробневский Ф., Черноусова Л.Н., Голышевская В.И., Ерохин В.В., Кузнецов С.И., Захарова С.М., Мелентьев А.С., Федорин И.М. Преобладание штаммов Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing и факторы риска их трансмиссии в Самарской области // Пробл. туб.и бол. легк. 2006. №2. С. 31-37.
2. Вязовая А.А. Журавлев В.Ю., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Павлова Е.П., Кришевич В.В., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в Псковской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 6. С. 2731.
3. Дымова М.А., Никонов С.Д., Акулинушкин А.И., Огиренко А.П., Филипенко М.Л. Преобладание Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing у больных с тяжелыми формами туберкулеза // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: биология, клиническая медицина. 2008. Т. 6. № 3-1. С. 106-109.
4. Дымова М.А, Ольховик О.И., Чередниченко А.Г., Храпов Е.А., Петренко Т.И., Филипенко М.Л. Генотипирование изолятов Mycobacterium tuberculosis, характеризующихся широкой лекарственной устойчивостью // Вестник Новосибирского государственного университета. 2013. Т. 11. № 1. С. 110-117.
5. Лац А.А., Савилов Е.Д. Делеционный анализ по RD181, RD150, RD142 штаммов генотипа Пекин Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом в Иркутской области // Сибирский медицинский журнал. 2012. Т. 113. № 6. С. 88-90.
6. Маничева, О. А., Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Вязовая А.А., Журавлев В.Ю., Барнаулов А.О., Догонадзе М.З., Оттен Т.Ф., Вишневский Б.И. Лекарственная устойчивость, жизнеспособность и вирулентность in vitro штаммов Mycobacterium tuberculosis различных генотипов // Инфекция и иммунитет. 2011. Т. 1. № 4. С. 341-348.
7. Николаевский В.В., Балабанова Я.М., Браун Т. Молекулярное генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, цир-
кулирующих в центральной России: эффективность сполиго-типирования и VNTR-MIRU // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005 . № 4 . С. 9-14.
8. Огарков О.Б. Жданова С.Н., Зарбуев А.Н., Бадлеева М.В., Унтанова Л.С., Темирбаева И.В., Лац А.А., Савилов Е.Д. Полиморфизм Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в пенитенциарной системе Бурятии: высокая распространенность генотипа Пекин // Сибирский медицинский журнал. 2012. Т. 113. № 6. С. 54-57.
9. Савилов Е. Д. Жданова С.Н., Огарков О.Б., Лац А.А., Зарбуев А.Н. Генотип LAM Mycobacterium tuberculosis в Бурятии // Сибирский медицинский журнал. 2013. Т. 121. № 6. С. 140142.
10. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Дубилей С.А., Игнатова А.Н., Шемякин И.Г. Доминирующие генотипы штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от заключенных в поселке Озерки // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2007. № 3. С. 27-32.
11. Туберкулез в Российской Федерации: аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации, 2010 г. М.: Триада, 2011. 280 c.
12. Balabanova Y., Drobniewski F., Fedorin I., Zakharova S., Niko-layevskyy V., Atun R., Coker R. The Directly Observed Therapy Short-Course (DOTS) strategy in Samara Oblast, Russian Federation // Respir Res. 2006. Vol. 7. P. 44.
13. Balabanova Y., Nikolayevskyy V., Ignatyeva O, Kontsevaya I., Rutterford C.M., Shakhmistova A., Malomanova N., Chinkova Y., Mironova S., Fedorin I., Drobniewski F.A. Survival of civilian and prisoner drug-sensitive, multi- and extensive drug- resistant tuberculosis cohorts prospectively followed in Russia // PLoS One. 2011. Vol. 6. № 6. P. e20531.
14. Chernyaeva E., Dobrynin P., Pestova N., Matveeva N., Zhemkov V., Kozlov A. Molecular genetic analysis of Mycobacterium tu-
berculosis strains spread in different patient groups in St. Petersburg, Russia // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012. Vol. 31. № 8. P. 1753-1757.
15. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevskyy V., Ruddy M., Kuznetzov S., Zakharova S., Melentyev A., Fedorin I. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia // Jama. 2005. Vol. 293. № 22. P. 2726-2731.
16. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolin-gen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J Clin Microbiol. 1997. Vol. 35. № 4. P. 907-914.
17. Mokrousov I., Vyazovaya A., Otten T., Zhuravlev V., Pavlova E., Tarashkevich L., Krishevich V., Vishnevsky B., Narvskaya O. My-cobacterium tuberculosis population in northwestern Russia: an update from Russian-EU/Latvian border region // PLoS One. 2012. Vol. 7. № 7. P. e41318.
18. Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT). Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects // FIND. 2006. 89 p.
19. Supply P., Allix C., Lesjean S., Cardoso-Oelemann M., Rusch-Gerdes S., Willery E., Savine E., de Haas P., van Deutekom H., Roring S., Bifani P., Kurepina N., Kreiswirth B., Sola C., Rastogi N., Vatin V., Gutierrez M.C., Fauville M., Niemann S., Skuce R., Kremer K., Locht C., van Soolingen D. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis // J Clin Microbiol. 2006. Vol. 44. № 12. P. 4498-4510.
PREVALENCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS GENETIC GROUPS IN SAMARA REGION
© 2014 I.S. Kontsevaya1, V.V. Nikolayevskyy3, A.V. Sadykhova1, A.M. Kovalyov2, O.A. Ignatyeva1, Y.D. Rodionova2, Y.M. Balabanova3, O.N. Makurina1
1 Samara State University 2Samara Region Clinic Tuberculosis Dispensary named after N.V. Postnikov 3Queen Mary College, University of London
The population structure of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of lung tuberculosis, as well as prevalence of various strain lineages and clusters in Samara region is investigated in the paper. Key words: tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, lineages, clusters, Samara region areas.
Kontsevaya Irina, PhD student of Biochemistry Department, Samara State University, belka@ostin.org; Nikolayevskyy Vladys-lav, PhD, Senior research associate, Queen Mary College, University of London, v.nikolayevskyy@qmul.ac.uk; Sadykhova Anna, PhD student of Biochemistry Department, Samara State University, antima2008@rambler.ru; Kovalyov Alexander, PhD, biologist of Samara Region Clinic Tuberculosis Dispensary named after N.V. Postnikov, alexferreiro@yandex.ru; Ignatyeva Olga, PhD student of Biochemistry Department, Samara State University, ignatyevaolga@rambler.ru; Rodinova Yulia, MD, Head of the laboratory of Samara Region Clinic Tuberculosis Dispensary named after N.V. Postnikov, u.d.mashk0va@gmail.com; Balabanova Yanina, MD, Senior research associate, Queen Mary College, University of London, y.balabanova@qmul.ac.uk; Makurina Olga, PhD, professor, Biochemistry Department, Samara State University, makuri-na.on@mail.ru
