CC BY
50
ßP
ИССЛЕДОВАНИЯ / Методы идентификации
Протеомные технологии
в исследованиях белкового состава _вареных колбасных изделий
М.А. Ковалева, А.В. Иванов, Л.И. Ковалев, С.С. Шишкин,
ФГБУ Институт биохимии им. А.Н. Баха Россельхозакадемии, Е.В. Хряпова
ФГБУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, РАМН
А.Б. Лисицын, академик РАСХН, доктор техн. наук, И.М Чернуха, доктор техн. наук, Н.Л. Вострикова, канд. техн. наук, ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии
При пилотном протеомном исследовании образцов вареной колбасы I IДокторская, исходного мясного сырья и некоторых белковых добавок, идентифицировано несколько видоспецифичных белков (миоглобины, легкие цепи миозина, бета-енолазы, триозофосфатизомеразы), которые могут быть использованы как потенциальные биомаркеры для анализа состава белковых компонентов мясной продукции, определения видовой принадлежности сырья и выявления белковых добавок немышечного происхождения.
Ключевые слова: вареная колбаса, про-теомика, мышечные белки, биомаркеры
^ Проблемы, связанные с поступлением на рынок мясных продуктов (в частности вареных колбас) недостаточного качества или даже фальсифицированных, представляются достаточно актуальными. Для обеспечения контроля качества мясных продуктов в настоящее время предложен целый ряд подходов и методов, включающих мониторинг фактического состава, определение присутствия белковых добавок растительного и животного происхождения, а также установление степени соответствия нормативной документации [1].
Существенный вклад в решение подобных задач могут внести так называемые протеомные технологии, которые позволяют проводить системное изучение белков в различных биоматериалах. Про-теомика как научная дисциплина сформировалась в конце XX века [2]. В настоящее время протео-мика располагает значительным технологическим арсеналом, включающим высокоэффективные методы фракционирования белков, их масс-спектрометрическую идентификацию с использованием различных биоинформационных ресурсов, и этот арсенал активно используется для изучения мышечных белков различных млекопитающих [3]. Эффективность про-
теомных технологии для анализа различных мясных продуктов быта отмечена в работах некоторых зарубежных авторов [4], однако в
отечественнои литературе подобные публикации пока практически отсутствуют.
В данноИ статье представлены
Рис.1. Типичная двумерная электрофореграмма (ДЭ) белков образца колбасы «Докторская», окраска кумасси голубым К-250. По левому краю ДЭ расположены белки-маркеры молекулярных масс, значения которых даны в кДа. По нижнему краю ДЭ показаны значения рН, полученные при изоэлектрофокусировании. Стрелками обозначены белковые фракции, идентифицированные методами масс-спектрометрии (Табл. 1). Пунктирными овалами выделены фракции некоторых главных саркомерных белков (сверху вниз - актин, тропомиозины и легкие цепи миозина).
Методы идентификации / ИССЛЕДОВАНИЯ
ЕР
результаты пилотного протеом-ного исследования образцов вареной колбасы Докторская и исходного мясного сырья, а также сравнительного анализа других образцов вареных колбас и некоторых белковых добавок. При этом в исследованных материалах выявлен ряд белков, которые могут быть использованы как потенциальные биомаркеры мышечной ткани.
Материалы и методы. В работе исследовали образцы вареной колбасы Докторская производства трех мясокомбинатов (ДК1, ДК2 и ДК3) по ГОСТ Р 52196-2003, а также исходного мясного сырья -свинины и говядины. Кроме того, параллельно анализировали препараты соевого белка, соевого текс-турата и говяжьего коллагенового гидролизата, которые иногда применяются в качестве белковых добавок при производстве вареных колбасных изделий.
Приготовление белковых экстрактов, их фракционирование методом двумерного электрофореза по О'Фарреллу, визуализацию белков окрашиванием кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром, анализ полученных двумерных электрофореграмм (ДЭ) выполняли, как описано ранее [5]. Денситометрию ДЭ и/или их отдельных фрагментов проводили после сканирования (сканер Epson expression 1680) или съемки на цифровую фотокамеру. Для определения молекулярных масс белковых фракций использовали наборы рекомбинантных белков SM0661 или SM0671; Fermentas, США. Компьютерная обработка результатов осуществлялась с помощью пакета программ ImageMaster, 2D Platinum версий 6 и 7 (Genebio, Швейцария).
Идентификацию белковых фракций на ДЭ проводили после трипсинолиза методами MALDI-TOF MS и MS/MS масс-спектро-метрии на MALDI- времяпролет-ном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Германия) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да с калибровкой их по известным пикам аутолиза трипсина. Анализ полученных масс-спектров трип-тических пептидов выполняли с помощью программы Mascot,
№ Название белка Номер в Protein NCBI Идентификация* % перекрытия Mw/pI эксперим. Mw/pI расчет.
1 Миоглобин (Sus scrofa) 47523546 157/13 77 17,0/7,75 17,1/6,76
2 Миоглобин (Bos taurus) 27806939 146/13 75 17,0/6,90 17,7/6,90
3 Альфа гемоглобин (Sus scrofa) 229626 91/9 58 15,0/8,70 15,0/8,73
4 Тропонин I, 2 гипа быстрый ске-летно-мышечный (Bos taurus) 300797481 59/10 39 22,0/8,90 21,4/8,88
5 бета-енолаза (Sus scrofa) 113205498 343/30 66 46,5/6,80 47,1/8,05
6 бета-енолаза (Bos taurus) 77736349 260/31 61 46,5/6,70 47,1/7,60
7 Тропонин I быстрого типа (Bos taurus) 300797481 172/21 57 22,0/8,80 21,4/8,88
8 Фосфоглицерат мутаза 2 (Sus scrofa) 201066358 284/28 74 30,0/7,60 28,7/8,86
9 Кароангидраза 3 (Sus scrofa) 56711366 153/11 47 30,5/7,55 29,4/7,72
10 Триозофосфат изомераза 1 (Sus scrofa) 262263205 388/24 94 27,0/6,50 26,7/6,45
11 Триозофосфат изомераза 1 (Bos taurus) 61888856 246/18 79 26,5/6,40 26,7/6,45
12 Легкая цепь миозина 6В (Bos taurus) 115496556 148/13 61 24,0/5,40 23,4/5,40
13 Казеин CSN2 (Bos taurus) 83406093 97/9 29 33,0/4,80 25,2/5,53
14 Казеин пара каппа А (Bos taurus) 229416 94/6 77 14,0/8,75 12,3/8,92
15 Альбумин (Bos taurus) 30794280 140/21 34 67,0/5,60 67,0/5,71
Таблица 1. Белковые фракции, идентифицированные масс спектрометрией в образцах вареной колбасы.
опция Peptide Fingerprint (Matrix Science, США), с точностью определения массы МН+ равной 0.01% (допуская возможность модификации цистеинов акриламидом и окисления метионинов), включая поиск по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
Результаты и обсуждение. Фракционирование двумерным электрофорезом белковых экстрактов из образцов колбасы Докторская позволило получить от нескольких десятков до сотни белковых фракций, окрашиваемых кумасси R-250. Эти фракции располагались в широком диапазоне молекулярных масс (Мм) и изо-электрических точек (pI). В частности, некоторые фракции обла-
дали Мм со значениями более 150кДа, а другие - около 10 кДа. Значения р1 детектируемых фракций варьировали от 4,5 до 9,0 рН. На рис. 1, в качестве примера показана типичная ДЭ белков из образцов колбасы Докторская ДК1.
Полученные белковые профили оказались весьма сходными с результатами протеомного анализа белков скелетных мышц человека, которые были опубликованы ранее [5]. В частности, можно было отметить характерное распределение ряда «мажорных» сар-комерных белков, располагающихся в левом нижнем углу ДЭ, таких как актин, тропомиозины и легкие цепи миозина (показаны пунктирными овалами на Рис. 1). При этом в образцах колбасы
№ 2 апрель 2012 Всё О МЯСЕ
49
0
ИССЛЕДОВАНИЯ / Методы идентификации
Рис.2. Результаты масс-спектрометрической идентификации фракции № 12 (Легкая цепь миозина 6В, Bos taurus). А - масс-спектр триптических пептидов. Б - результаты определения выявленных пептидов с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint. В -распределение идентифицированных пептидов (выделены красным полужирным шрифтом) по полной аминокислотной последовательности легкой цепи миозина 6В (Bos Taurus). Докторская с помощью идентифи- Важно отметить, что среди кации методами MALDI-TOF указанных белковых фракций с
масс-спектрометрии удалось прямо показать, что некоторые белковые фракции принадлежат определенным мажорным мышечным белкам (Рис.1, Табл. 1).
В качестве примера на Рис. 2 приведены результаты идентификации легкой цепи 6В миозина коровы. Как видно из представленных материалов, выявленные при масс-спектрометрии триптические пептиды покрывают 61% аминокислотной последовательности этого белка, что свидетельствует о высокой достоверности проведенной идентификации.
учетом их электрофоретической подвижности шесть были охарактеризованы как белки свиньи (Sus scrofa), а шесть других как белки коровы (Bos taurus). Такие результаты можно считать вполне ожидаемыми, поскольку согласно ГОСТ Р 52196-2003 в состав вареной колбасы сорта Докторская входят и свинина, и говядина. Параллельно проведенный протеом-ный анализ образцов этого мясного сырья (включая коэлектро-форез белков свинины и говядины) убедительно подтвердил сделанные оценки и позволил про-
демонстрировать явную видоспе-цифичность, как минимум, трех пар белковых фракций (миогло-бины, легкие цепи миозина, бета-енолазы) (Рис. 3). Так, из сравнения фракций, расположенных в прямоугольнике I, следует, что миоглобин свиньи обладает меньшей электрофорети- ческой подвижностью при изоэлектрофоку-сировании, чем миоглобин коровы. Видно, что первый из этих белков не достигает условной фиолетовой пунктирной линии, проведенной через два близко расположенных реперных белка, а второй - пересекает указанную линию. Полученные результаты полностью со-гласуются с расчетными величинами молекулярных масс и pI для миоглобина свиньи и коровы - 16956/6.83 и 16946/6.97, соответственно (эти величины были рассчитаны из полных аминокислотных последовательностей по базе данных UniProt с помощью компьютерной программы Compute pI/MW на сайте Proteomic ExPASy Bioin-formatics Resource Portal).
При сравнительном протеом-ном анализе образцов вареной колбасы Докторская трех фирм-производителей (ДК1, ДК2, ДК3) оказалось, что содержащиеся в них белки эффективно фракционируются и практически сохраняют стандартное распределение (профили) основных компонентов, которое показано на Рис. 1. Однако в разных образцах выявлялась небольшая количественная вариабельность в распределении некоторых белковых фракций. С помощью компьютерной денсито-метрии участков ДЭ, где располагались фракции миоглобинов свиньи и коровы, были получены количественные оценки, позволяющие характеризовать соотношение этих видоспецифичных белков в разных образцах. Результаты этого анализа суммированы на рис. 4.
Таким образом, протеомные технологии открывают путь к использованию анализа миоглоби-нов свиньи и коровы для объективной оценки соотношения свинины и говядины в образцах колбасы Докторская, а также и в других мясных продуктах. Оче-
Методы идентификации / ИССЛЕДОВАНИЯ
iЕР
Ко электрофорез Го вяди на/Св и н и на
»
V
... 1
Видаспвцифнчные и pfif|iRpeHCHbiB Белки
РефЕренйныЕ Senftbi
—► Говядина
Рис. 3. Результаты протеомного изучения белков в образцах мясного сырья, используемого при приготовлении вареной колбасы «Докторская». Пунктирными прямоугольниками выделены участки расположения потенциальных биомаркерных белков (показаны стрелками), а также референсных белков (показаны зелеными овалами): I - миоглобины; II - легкие цепи миозина; III - бета-енолазы.
видно, что аналогичный анализ можно применить и по отношению к другим потенциальным ви-доспецифичным биомаркерам, в частности к изоформам легких цепей миозина, бета-енолазы, а также триозофосфатизомеразы, которые были выявлены в данном исследовании (Рис.1, Табл. 1).
Наряду с количественной ва-
риабельностью указанных белковых фракций при сравнительном протеомном анализе образцов ДК1, ДК2, ДК3 были обнаружены и некоторые различия между ними по наличию или отсутствию отдельных фракций (качественная вариабельность). Среди таких фракций в образцах ДК1 удалось идентифицировать нетипичные
для мышечной ткани белки, которые оказались белками молока (Рис.1, Таблица 1), что не противоречит ГОСТ Р 521196-2003.
Поскольку существует вероятность применения в качестве белковых добавок при производстве мясных продуктов препаратов говяжьего коллагенового гидроли-зата, соевого белка и соевого текс-турата, соответствующие образцы также были проанализированы протеомными технологиями. Полученные результаты представлены на Рис.5.
Как видно из этих данных, на ДЭ препарата «Коллагеновый гид-ролизат» присутствовал целый ряд белковых фракций с молекулярными массами более 50 кДа, которые сравнительно слабо окрашивались кумасси R-250, но эффективно выявлялись при окрашивании азотнокислым серебром (рис. 5 I и II). При этом все окрашенные фракции локализовались в левом верхнем участке ДЭ. Применение окрашивания азотнокислым серебром позволило выявить присутствие указанной добавки во всех трех проанализированных образцах колбасы Докторская, что практически не обнаруживалось при использовании кумасси R-250. На Рис 5 А III в качестве примера показан соответствующий участок ДЭ образца ДК1, окрашенный
Рис.4. Результаты компьютерной денситометрии с помощью пакета программ ImageMaster, 2D Platinum миоглобиновых фракций на ДЭ белков из трех образцов колбасы «Докторская» (ДК1, ДК2. ДК3). А- Автоматическое выявление миоглобиновых фракций, Б Трехмерные модели, В - Количественные соотношения свиного и коровьего миоглобина в трех образцах колбасы «Докторская».
№ 2 апрель 2012 Всё О МЯСЕ
51
0
ИССЛЕДОВАНИЯ/ Методы идентификации
Рис.5. Результаты протеомного изучения белковых добавок, используемых при производстве мясных продуктов.
А. Фрагменты ДЭ, на которых располагаются белковые фракции коллагенового гидроли-зата: I - препарат коллагенового гидролизата, окраска Кумасси голубым R-250; II - препарат коллагенового гидролизата, окраска азотнокислым серебром; III - препарат ДК1, окраска азотнокислым серебром Б - ДЭ препарата соевого белка В - ДЭ препарата соевого текстурата
азотнокислым серебром.
На ДЭ препаратов соевого белка и соевого текстурата при окрашивании кумасси R-250 выявлялось по нескольку десятков белковых фракций, локализовавшихся по всей площади ДЭ, но большинство из них обладали молекулярными массами ниже 50 кДа (Рис. 5 Г и Д). Одну из этих фракций удалось идентифицировать методом MALDI-TOF MS как укороченную изоформу соевого белка глицинина (254029113 по базе данных Protein NCBI с покрытием 47% полной аминокислотной последовательности). В целом из полученных данных следует, что протеомная детекция разнообразных соевых белков в образцах колбасы может быть затруднена из-за того, что многие из них по электрофоретической
подвижности сходны с определёнными мажорными мышечными белками (например, идентифицированный глицинин располагается на том же участке ДЭ, где локализуются изоформы тропомиозина). Соответственно, для определения соевых белков, которые могли бы стать биомаркерами, свидетельствующих о наличии указанной добавки, требуется доработка условий фракционирования, возможно с применением узких диапазонов градиента рН при изоэлектро-фокусировании.
В заключение надо отметить, что полученные результаты показывают эффективность применения протеомных технологий для выявления потенциальных белковых биомаркеров, которые позволят оценивать качество мясной продукции по их белковому со-
ставу с определением видовой принадлежности, имеющихся в продуктах мышечных белков, а также присутствия белковых добавок немышечного происхождения. Однако, очевидно и то, что для практического контроля качества мясных продуктов с использованием выявленных биомаркеров потребуется следующий этап разработок - создание экспресс-методов их детекции, например, на основе иммуноферментных или иммунохроматографических технологий.
Литература
1. Чернуха И.М., Кузнецова Т.Г., Селиванова Е.Б., Марсакова Е.И. Современные подходы к объективной оценке качества мясного сырья и готовой продукции.//Все о мясе. 2010. № 2 С. 19-23.
2. Шишкин С.С. От структурной геномики к функциональной: теоретиче-ские и прикладные аспекты. // Вест. РАМН. 2002, №4, С.11-16.
3. Ohlendieck K. Skeletal muscle proteomics: current approaches, technical challenges and emerging techniques. // Skelet Muscle. 2011 1 (1):6 (Р.1-15).
4. Pioselli B., Paredi G., Mozzarelli A. Pro-teomic analysis of pork meat in the production of cooked ham. Mol. Biosyst. 2011, 7, 2252-2260.
5. Ковалева М.А. , Ковалев Л.И., Торопыгин И.Ю. и др. Протеомный анализ белков скелетной мышцы (m.vastus lateralis) человека, идентификация 89 белковых продуктов генной экспрессии. // Биохимия. 2009, 74, 11, 1524-1538.
Контакты:
Андрей Борисович Лисицын, Ирина Михайловна Чернуха, Наталья Леонидовна Вострикова, тел.: +7(495) 676-99-71 Марина Анатольевна Ковалева, Алексей Викторович Иванов, Леонид Иванович Ковалев, Сергей Сергеевич Шишкин, Елена Владимировна Хряпова, тел.: +7 (495) 952-58-86
