Продукция некоторых про- и противовоспалительных цитокинов при стимуляции живыми и инактивированными патогенными лептоспирами на модели цельной крови человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

4. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Вербицкая Н.Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis. Журн. микробиол. 2006, 7: 8-11.

5. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробио-ты кишечника человека. Изд-во СПб ИИЦ ВМА, 2008.

6. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Орлова О.Г. Ультраструктура биопленок при внутривидовом и межвидовым взаимодействии условно патогенных бактерий. Бюллетень Оренбургского научного центра. УрО РАН. 2014, 1: 1-11.

7. Рыбальченко О.В., Гуслева О.Р., Орлова О.Г. Микроэкологическое и электронно-микроскопическое исследование микробиоты кожи пациентов с атопическим дерматитом. Журн. микробиол. 2010, 1: 67-72.

8. Asadi M. R., Torkaman G. Bacterial inhibition by electrical stimulation. Advance sinwound care. Adv. Wound Care. 2014 3(2): 91-97.

9. Costerton J.W, Lewandowski Z., Caldwell D.E. et al. Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 1995, 49: 711-745.

10. Rossiand F., Kylian O. Sterilization and decontamination of surfaces by plasma discharges. in book «Sterilisationfo biomaterials and medical devices». Woodhead Publishing Limited, 2012.

11. Rutberg P.G., Kolikov V.A., Kurochkin V.E. et al. Electric discharge and the prolonged microbial resistance of water. IEEE Transactionson Plasma Science. 2007, 35 (4): 1111-1118.

12. Tendero C., Tixier Ch., Tristant P. et al. Atmospheric pressure plasmas: A review. Spectrochimica Acta Part B. 2006, 61: 2-30.

Поступила 20.05.15

Контактная информация: Рыбальченко Оксана Владимировна, д.б.н.,

199106, Санкт-Петербург, В.О., 21-я линия, 8а (медицинский факультет)

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

О.А.Петрова, Н.А.Стоянова, Н.К.Токаревич, Н.А.Арсентьева, Н.Е.Любимова, А.В.Семенов, Арег А.Тотолян

ПРОДУКЦИЯ НЕКОТОРЫХ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ ЖИВЫМИ И ИНАКТИВИРОВАННЫМИ ПАТОГЕННЫМИ ЛЕПТОСПИРАМИ НА МОДЕЛИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, С.-Петербург

Цель. Изучение способности клинических изолятов лептоспир вызывать продукцию некоторых про- и противовоспалительных цитокинов на модели цельной крови человека. Материалы и методы. Для эксперимента был взят штамм Leptospira interrogans. Содержание цитокинов определяли методом, основанным на xMAP технологии с использованием стандартной панели, состоящей из 9 аналитов: TNF-a, MCP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-Жа, IL-12^70), IFN-y. Результаты. Подобрана оптимальная концентрация L.interro-gans для стимуляции цельной крови человека — 1х106 лептоспир/мл. Впервые на модели цельной крови человека определено, что на ранних сроках инкубации активнее продуцируются IFN-y, IL-12(p70), IL-4 и IL-1Ra; на более поздних (6-часовая инкубация) — IL-8 и TNF-a. Заключение. Показан дифференциальный характер стимуляции продукции цитокинов на модели цельной крови человека живыми и инактивированными лептоспи-рами.

Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 23—28 Ключевые слова: лептоспироз, цитокины

O.A.Petrova, N.A.Stoyanova, N.K.Tokarevich, N.A.Arsentieva, N.E.Lyubimova, A.V.Semenov, Areg A.Totolyan

PRODUCTION OF CERTAIN PRO- AND ANTI-INFLAMMATORY CYTOKINES DURING STIMULATION BY LIVE AND INACTIVATED LEPTOSPIRA PATHOGENS IN THE MODEL OF HUMAN WHOLE BLOOD

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

Aim. Study of the ability of clinical isolates of leptospira to cause production of certain pro-and anti-inflammatory cytokines in the model of human whole blood. Materials and methods. Leptospira interrogans strain was taken for the experiment. Cytokine content was determined by a method based on xMAP technology using a standard panel, composed of 9 analytes: TNF-a, MСP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-Жа, IL-12fc70), IFN-y Results. An optimal concentration of L. interrogans was selected for stimulation of human whole blood — 1x106 leptospirae/ml. For the first time in the model of human whole blood it was determined, that at early stages of incubation IFN-y, IL-12(p70), IL-4 and IL-1Ra are more actively produced; at later stages (6 hour incubation) — IL-8 and TNF-a. Conclusion. A differential pattern of cytokine production stimulation was shown in the model of human whole blood by live and inactivated leptospirae.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 6, P. 23—28

Key words: leptospirosis, cytokines

ВВЕДЕНИЕ

Лептоспирозы — группа природноочаговых, нетрансмиссивных зооантропонозов, сходных, но не идентичных, по патогенезу, эпидемическим и клиническим проявлениям [1, 2]. Возбудителями являются бактерии рода Leptospira, входящие в семейство Leptospiraceae порядка Spirochaetales. В настоящее время идентифицировано более 250 серовариантов патогенных лептоспир [2, 13]. В Российской Федерации лептоспирозы продолжают оставаться в ряду широко распространенных зооантропонозов, что обусловлено наличием практически на всех территориях природных и хозяйственных очагов как в сельской местности, так и в городах [1, 2].

В ряде случаев лептоспироз у человека протекает в легкой форме, сопровождаясь неспецифическими симптомами, такими как лихорадка, боль в мышцах и головная боль, однако у 10 — 15% больных развивается тяжелая форма, которая часто быстро прогрессирует и может привести к летальному исходу [12]. Летальность в случае развития тяжелых форм лептоспироза достигает 20%, а в случае развития легочного геморрагического синдрома превышает 50% [11].

Патогенез лептоспирозов сложен и на данный момент мало изучен. Лептоспиры обладают множеством механизмов, позволяющих им уклоняться от иммунной системы хозяина и вызывать инфекцию [3]. На данный момент не так много известно о врожденной иммунной реакции на лептоспиры [12]. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются основными датчиками вторжения патогенных микроорганизмов [6]. Интересно, что липополисахарид лептоспир отличается от липополисахарида грамот-рицательных бактерий по нескольким биохимическим, физическим и биологическим свойствам [12]. Установлено, что липополисахарид лептоспир взаимодействует с TLR2, а не с TLR4, в отличие от большинства грамотрицательных бактерий [11].

Важную роль в иммунопатогенезе лептоспирозов отводят цитокинам. Предполагается, что тяжесть и исход лептоспирозной инфекции зависит от вида продуцируемых цитокинов и от их концентрации. Работ по исследованию данной темы немного, и часто их данные противоречивы [13 — 15]. Ранее нами было показано, что в сыворотке крови больных лептоспирозом повышен уровень TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8 [5]. В то же время, для изучения продукции цитокинов при лептоспирозной

инфекции, в основном, используются животные модели (крысы, мыши, морские свинки) [Lowanitchapart A., 2009; da Silva J.B., 2012] или отдельно выделенные клетки (PBMC-Peripheral Blood Mononuclear Cells, THP-1) [8, 9], также стимуляция чаще проводится липополисахаридами лептоспир [Diament D. et al., 2002].

Цель работы — изучение способности клинических изолятов лептоспир вызывать продукцию некоторых про- и противовоспалительных цитокинов на модели цельной крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для эксперимента был взят штамм Leptospira interrogans серогруппы Ictero-haemorrhagiae из коллекции лаборатории зооантропонозных инфекций С.-Петербургского НИИЭМ им. Пастера. Возбудитель выделен из крови больного, умершего от лептоспирозной инфекции в 2013 г. Культивирование лептоспир осуществляли на фосфатно-сывороточной среде Терских в соответствии с [4]. Для эксперимента проводили трехкратную отмывку лептоспир от питательной среды культивирования натриево-фосфатным буфером (PBS) с последующей инактивацией части образцов нагреванием до 56°C в течение 30 мин. Подбор концентрации проводили последовательным разведением образцов под контролем микроскопии. Жизнеспособность микроорганизмов определяли с помощью темнопольной микроскопией.

Взятие крови здоровых доноров, не имеющих в анамнезе лептоспирозной инфекции, осуществляли стерильно в вакутейнеры с гепарином.

Стимуляцию живыми и убитыми лептоспирами проводили в течение 24 часов. Через 1, 2, 3, 4, 6, 12 и 24 часа после начала инкубации отбирали супернатанты. Для определения цитокинов в биоматериале использовали анализатор «MagPix» (Millipore, США), основанный на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием стандартной панели из 9 аналитов: TNF-a, MCP-1, IL-8, IL-4, IL-6, IL-10, IL-1Иа, IL-12^70), IFN-y

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ MS Excel, Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В предварительном эксперименте была подобрана концентрация лептоспир, оптимальная для проведения стимуляции цельной крови. Пик стимуляции при 24 час инкубации лептоспир с цельной кровью наиболее выражен при концентрации микроорганизмов lxlO6 лепто-спир/мл, как видно из рис. 1, 2.

В ходе основного эксперимента нами было установлено, что живые лептоспиры являются более сильными индукторами продукции цито-кинов, чем те же лептоспиры, инактивированные нагреванием (для IFN-y р=0,0156; IL-12(p70) p=0,0012; IL-4 р=0,01; IL-8 p=0,026; IL-1Ra p=0,0012). Так, индукция синтеза IFN-y живыми лепто-спирами идет активнее, чем инактивированными лепто-спирами (табл. 1, 2). Пик

Рис. 1 Содержание !Ш-у (1), ^-10 (2), ^-12ф70) (3) в супер-натантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл).

Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — лептоспир/мл.

синтеза данного цитокина приходится на 3 час стимуляции. Аналогичный пик стимуляции, приходящийся на 3 час, выявлен для ^-12(р70) в случае стимуляции инактивирован-ными бактериями. В случае же стимуляции живыми возбудителями лептоспи-роза максимальный уровень ^-12(р70) наблюдается уже ко второму часу инкубации, а затем становится практически неизменным.

Сходная динамика на-

Рис. 2 Содержание TNF-a (1), IL-6 (2), IL-8 (3), MCP-1 (4) в супернатантах после 24-часовой стимуляции различной концентрацией лептоспир (пг/мл).

блюдается и для противовоспалительного цитокина IL-1Ra, который дает пики стимуляции для живых и инактивированных нагреванием лептоспир на второй и третий час инкубации, соответственно. После достижения своего максимального значения в обоих случаях уровень данного цитокина выходит на плато. Сходная картина наблюдается и для IL-4. Также непохожую на остальные цитокины динамику дали IL-8 и TNF-a, которые имеют более поздние, чем другие цитокины, пики стимуляции, приходящиеся на 6 ч. Концентрация МСР-1 в ходе всего эксперимента изменялась незначительно.

Таблица 1. Концентрация IFN-y, IL-4, IL-10, IL-Ша, IL-12^70) (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми)

^''■''•'••^...Питокины IFN-y IL-10 IL-12(p70) IL-1Ri IL-4

Время, ч ^''■''•'••v. убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми

0 119,99

1 259,11 2672,94

2 620,18 2838,86

3 913,27 3319,88

4 404,54 2404,39 6 303,05 2607,37 12 267,09 1780,26 24 282,83 2109,76

<3,2 30,61

<3,2 <3,2 24,02 154,99

1,08 23,53 109,00 784,70

15,49 9,81 209,30 458,07

1,08 10,05 43,41 443,34

<3,2 15,29 39,39 457,68

<3,2 9,81 33,53 292,39

2,71 11,87 36,45 386,60

19,461 <3,2

142,42 817,67 <3,2 53,84

684,55 4632,06 63,49 311,94

1636,10 2361,53 163,74 213,24

386,36 2386,37 62,28 262,52

309,71 2316,66 58,65 285,08

306,09 1649,60 27,84 144,10

302,47 2029,54 24,36 174,22

Таблица 2.Концентрация IL-8, IL-6, TNF-a, MOP-1 (пг/мл) в супернатанте при стимуляции лептоспирами (убитыми и живыми)

^'''''■'\Дитотокины IL-6 IL-8 MCP-1 TNF-a

Время, ч убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми убитыми живыми

0 <3,2 25,031 525,938 8,335

1 64,25 405,22 199,24 1176,33 238,21 397,35 127,26 87,65

2 340,60 1015,36 3417,70 3765,42 599,52 868,69 3273,27 2778,94

3 652,02 755,18 24641,82 21441,26 821,90 696,88 20123,51 5630,11

4 730,99 831,50 23224,82 24234,08 665,51 765,52 26351,48 36252,30

6 705,94 1067,13 36039,54 49623,54 708,98 875,36 26602,24 57044,55

12 844,08 1170,60 19249,61 41469,11 588,55 711,45 19979,13 46245,03

24 1224,11 1582,20 11595,89 16710,47 624,40 854,21 19051,66 12534,37

ОБСУЖДЕН И Е

В ходе основного эксперимента нами были получены данные о высоком уровне TNF-a, IL-10, MCP-1, IL-8, сходные данные были получены нами ранее [5], что может свидетельствовать об адекватности используемой модели.

Определение концентрации лептоспир, необходимой для стимуляции цельной крови, является важным этапом эксперимента. В литературе используются различные концентрации бактерий — от 104 лептоспир/мл (как минимальная концентрация, вызывающая легкую форму инфекции) [9] до 105 — 106 лептоспир/мл и выше (как концентрации, вызывающие тяжелые формы лептоспирозов) [12]. Для каждого серова-рианта возбудителя данная концентрация должна определяться индивидуально.

В результате эксперимента мы наблюдали повышение уровня IL-12(p70) и TNF-a в ответ на введение лептоспир в цельную кровь, аналогичный результат был получен Gaudart N. et al. в 2008 г. при стимуляции дендритных клеток человека. Низкий уровень стимуляции IL-10 свидетельствует о низкой противовоспалительной активности цитокинов при лептоспирозе, что также согласуется с полученными нами данными. Считается, что соотношение IL-10/TNF-a может являться прогностическим для определения тяжести течения заболевания [7, 14, 15].

Полученные данные согласуются с нашими результатами по содержанию некоторых цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозом, где было показано высокое содержание IFN-y, IL-10, MCP-1, IL-8 [5].

Нами подобрана оптимальная концентрация Leptospira interrogans для стимуляции цельной крови человека — 1х106 лептоспир/мл. Впервые на модели цельной крови человека определена почасовая индукция лептоспирами 9 цитокинов: на ранних сроках инкубации активнее продуцируются IFN-y, IL-12(p70), IL-4 и IL-1Ra; на более поздних (6-часовая инкубация) — IL-8 и TNF-a.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы людей и животных: тенденции распространения и проблемы профилактики. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010, 2 (51): 13-16.

2. Ананьина Ю.В. Лептоспирозы в РФ: современные особенности эпидемического проявления природных и техногенных очагов. Вет. патол. 2004, 4: 54-57.

3. Ваганова А.Н. Наружная мембрана патогенных представителей рода Leptospira. Инфекция и иммунитет. 2011, 1 (1): 29-42.

4. Методические указания 3.1.1128-02. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний лептоспирозами. М., МЗ РФ, 2002.

5. Петрова О.А, Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. Содержание некоторых про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных лептоспирозной инфекцией. Журн. микробиол. 2014, 5: 60-64.

6. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., Мир. 2000.

7. Chirathaworn C., Kongpan S. Immune responses to Leptospira infection: roles as biomarkers for disease severity. Braz. J. Infect. Dis. 2014, 18 (1): 77-81.

8. Cinco M., Vecile E., Murgia R. Leptospira interrogans and Leptospira peptidoglycans induce the release of TNF-a from human monocytes. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 138: 211-214.

9. Craig S.B., Collet T.A, Wynwood S.J. Neutrophil count in leptospirosis patients infection with different serovars. Trop. Biomed. 2013, 30 (4): 579-583.

10. De Fost M., Hartskeerl R.A., Groenendijk M.R. et al. Interleukin 12 in part regulates gamma interferon release in human whole blood stimulated with Leptospira interrogans. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10: 332-335.

11. Fraga T.R., Barbosa A.S., Isaac L. Leptospirosis: Aspect of innate immunity, immunopatho-genesis and immune evasion from the complement system. Sc. J. Immun. 2011, 73: 408-419.

12. Goris G.A., Wagenaar F.P., Hartskeerl R.A. Potent innate immune response to pathogenic leptospira in human whole blood. PLoS ONE. 6 (3): е18279.

13. Kyriakidis I., Samara P., Papa A. et al. Serum TNF-alpha, sTNFR1, IL-6, IL-8 and IL-10 levels in Weil's syndrome. Cytokine. 2011, 54: 117-120.

14. Tajiki H., Salomao R. Association of plasma levels of tumor necrosis factor alpha with sever-

ity of disease and mortality among patients with leptospirosis. Clin. Infect. Dis. 1996, 23: 1177-1178.

15. Tajiki H., Salomao R. The ratio of plasma levels of IL-10/TNF-alpha and its relationship to disease severity and survival in patients with leptospirosis. Braz. J. Infect. Dis. 1997, 1: 138141.

Поступила 17.02.15

Контактная информация: Петрова О.А.,

197101, С.-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)232-31-55

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

Е.В.Зуева, Н.А.Стоянова, Н.К.Токаревич, Арег А.Тотолян

MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ LEPTOSPIRA SPP., ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СЕРОДИАГНОСТИКЕ ЛЕПТОСПИРОЗА

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, С.-Петербург

Цель. Создание классификационной модели сероваров Leptospira spp. с помощью программного обеспечения ClinProTools 3.0 и оценка использования MALDI-TOF MS в качестве метода контроля качества референсных штаммов лептоспир. Материалы и методы. В исследовании использовали десять референсных штаммов Leptospira spp. согласно реакции микроскопической агглютинации из коллекции НИИЭМ им. Пастера. Все штаммы культивировали в течение 10 дней в среде Терских при 28°С. Экстракты клеток были получены этанол/муравьино-кислотным методом. Раствор а-циано-4-гидро-ксикоричной кислоты использовали в качестве матрицы. Масс-спектры были получены на Microflex масс-спектрометре (Bruker Daltonics, Германия). Внешняя валидация тест-модели была проведена с помощью новых спектров каждого референс-штамма при их повторном пересеве. Результаты. Значения кросс-валидации и подтверждающей способности оптимальной модели, построенной на генетическом алгоритме, составили 99,14 и 100% соответственно. Эта модель содержала 11 биомаркерных пиков ( m/z 2959, 3447, 3548, 3764, 3895, 5221, 5917, 6173, 6701, 7013, 8364) для классификации сероваров. Результаты внешней валидации показали 100% правильную классификацию в классах сероваров в Sejroe, Ballum, Tarassovi, Copenhageni, Mozdoc, Grippotyphosa и Patoc, что указывает на высокую прогностическую способность модели в этих классах. Однако данные верификационной матрицы показали, что 50% из спектров от сероваров Canicola и Pomona были классифицированы как класс Patoc, что, возможно, связано с перекрестной серологической реактивностью L.biflexa серовара Patoc с патогенными лептоспирами. Заключение. Метод MALDI-TOF масс-спектрометрии в сочетании с построением и использованием классификационной модели может быть полезным инструментом для внутрилаборатор-ного контроля пересева лептоспир.

Журн. микробиол., 2015, № 6, С. 28—36

Ключевые слова: Leptospira spp., масс-спектрометрия, MALDI-TOF MS, ClinProTools E.V.Zyeva, N.A.Stoyanova, N.K.Tokarevich, AregA.Totolyan

MALDI-TOF MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF LEPTOSPIRA SPP. USED IN SERODIAGNOSTICS OF LEPTOSPIROSIS

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia

Aim. Creation of a classification model of Leptospira spp. serovar model using ClinProTools 3.0 software and evaluation of use of MALDI-TOF MS as a method of quality control of reference strains of leptospira. Materials and methods. 10 reference strains of Leptospira spp. were used in the study according to microscopic agglutination reaction from the collection of Pasteur RIEM. All