CC BY
110
М.В. Кузнецова,
кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
Г л
Т.И. Карпунина,
доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии, Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера
Представлен опыт использования молекулярно-генетических методов в лабораторной диагностике и мониторинге инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa. Показана актуальность исследований по вопросам идентификации/детекции штаммов синегнойной палочки, выявления механизмов антибиотикоустойчивости, типиро-вания госпитальных изолятов с целью определения их родства и источника происхождения.
К особенностям современного этапа развития инфекций относится увеличение в их структуре числа заболеваний, вызываемых представителями многочисленных групп условно патогенных бактерий. При этом спектр возможных возбудителей гнойно-септических инфекций (ГСИ) постоянно пополняется за счет микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры, либо свободно живущих таксонов [1]. Лабораторная диагностика при расшифровке оппортунистической инфекции имеет свои особенности, требуя ответа на вопрос: является ли изолируемый микроорганизм причинным фактором либо имеет место транзиторное бактерионосительство. Решение эпидемиологических задач невозможно без определения родства штаммов, циркулирующих в стационаре, доказательства их принадлежности к госпитальному (рис. 1). Учитывая такую тенденцию, необходимо наряду с традиционными разрабатывать новые подходы к бактериоло-
гической диагностике. «Классические» методы идентификации и типирования возбудителей ГСИ базируются на изучении фенотипических характеристик изолируемых культур. Так как геном бактерий представляет собой наиболее фундаментальный «элемент идентичности» клеток, в последние годы наблюдается тенденция к более широкому привлечению молекулярно-генетических методов для идентификации клинических изоля-тов, определения их факторов патогенно-сти и выявления детерминант антибиоти-корезистентности [3]. Генетические подходы c успехом используются и в эпидемиологическом анализе при определении источника и степени родства изучаемых штаммов [12].
Pseudomonas aeruginosa - один из самых распространенных возбудителей внутрибольничных инфекций, создающий серьезные проблемы в стационарной медицинской практике, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии
<^
идентификация возбудителей
4
выявление
детерминант резистентности
определение родства штаммов
определение факторов патогенности
Рис. 1. Основные направления лабораторной диагностики госпитальных инфекций
(ОРИТ) [4]. Синегнойная палочка является возбудителем поздних вентиляционных пневмоний, инфекций мочевых путей, ка-тетер-ассоциированных ангиогенных инфекций, бактериемии, раневых инфекций, инфекций глаз, ожоговых ран [11]. Доля Р. aeruginosa в структуре возбудителей нозокомиальных инфекций у взрослых составляет в среднем 11-13,8 %. По данным 2004 г. United States Cystic Fibrosis Foundation Patients Registry, P. aeruginosae составляют 57,3 % всех респираторных культур, выделенных от пациентов с фиброзом легких в случае хронических и пер-систирующих инфекций. Данный возбудитель играет ведущую роль в этиологии септицемии при первичных иммунодефи-цитах, а также в 20 % случаев является причиной бактериемии у пациентов с лейкемией [6].
Наш интерес к изучению синегнойной инфекции обусловлен не только ее широким распространением, но и увеличением в последние годы доли P. aeruginosa в спектре возбудителей внутрибольничных осложнений в стационарах различного
профиля. Анализ сводных статистических данных бактериологической службы г. Перми в 2006-2010 гг. позволил установить среднемноголетний уровень ин-фицированности P. aeruginosa: 15,2±0,4 на 1000 обследованных. Наблюдается тенденция к увеличению инфицированно-сти P. aeruginosa. Вместе с тем частота обнаружения данного возбудителя в бактериологических лабораториях колебалась в широких пределах (таблица). Причины таких значительных колебаний не могут исчерпываться лишь профилем стационара и структурой исследуемого клинического материала.
Идентификация P. aeruginosa в практических бактериологических лабораториях осуществляется культуральным методом (приказ МЗ РФ № 535 от 22.04.85). Нами был проведен сравнительный анализ результатов традиционных бактериологических и молекулярно-генетических методов для идентификации P. aerugi-nosa. Первичная идентификация проведена в бактериологических лабораториях ЛПУ. Реидентификацию осуществляли с
Результативность обнаружения P. aeruginosa в бактериологических лабораториях
в 2006-2010 гг. (количество штаммов на 1000 обследованных)*
Лаборатория 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.
ЛПУ № 1 17,1±3,3 18,3±3,7 31,9±5,312 33,7±5,41 0
ЛПУ № 2 20,3±2,6 13,5±2,11 12,3±2,11 16,4±1,812 14,7±2,21
ЛПУ № 3 10,7±1,5 13,0±1,31 30,2±2,312 10,3±1,52 12,6±1,7
ЛПУ № 4 23,2±2,3 25,9±2,6 26,0±2,5 30,7±3,012 23,6±3,02
ЛПУ № 5 55,0±4,3 37,5±3,81 0 48,3±3,31 26,7±1,812
ЛПУ № 6 8,5±1,1 4,7±0,71 4,9±0,71 4,1 ±0,61 9,2±0,92
ЛПУ № 7 11,6±1,4 7,0±1,01 7,5±1,01 7,1 ±1,01 0
ЛПУ № 8 9,3±4,2 6,3±2,5 6,5±2,3 6,7±2,4 -
ЛПУ № 9 18,9±1,9 15,4±1,51 19,0±1,82 13,5±1,612 -
Примечание: *данные предоставлены главным бактериологом г. Перми Н.С. Авдеевой; 1 - различия достоверны при сравнении с 2006 г.; 2 - различия достоверны при сравнении с предыдущим годом.
помощью «НефермТеста24» (Lachema, Чехия). Для генетической детекции применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с родо- и видоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК Pseudomonas spp. (фрагмент 969 п.н.) и P. aeruginosa (фрагмент 956 п.н.) [10] и секвениро-вание. В результате генетической идентификации синегнойной палочки было установлено, что 95 % (151) штаммов соответствуют виду, определенному в первичных бактериологических лабораториях. По результатам ПЦР-анализа 3,1 % (5) культур являются псевдомонадами, но не P. aeruginosa, и только 3 (1,9 %) - не принадлежали к роду Pseudomonas (рис. 2). Высокий процент совпадений указывает на адекватность культурального метода при идентификации P. aeruginosa.
Однако к настоящему времени накапливаются сведения о недостаточной информативности бактериологической диагностики синегнойной инфекции, что исследователи связывают с биологическими особенностями возбудителя. Это, в первую очередь, наблюдается в случаях, когда изоляты теряют способность к пиг-ментообразованию, продукции экзополи-сахарида и рамнолипида [9]. Идентификацию затрудняет и присутствие в материале других неферментирующих грамотри-цательных бактерий, в том числе рода Pseudomonas. Особенно часто «недодиаг-ностика» снижает эффективность эпидемиологического контроля при мониторинге госпитальных штаммов за счет малой концентрации микроорганизмов в исследуемом материале, формирования ими
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Рис. 2. Пример электрофореграммы продуктов амплификации генов 16SрРНК с родоспецифичными (верх) и видоспецифичными праймерами (низ): 1, 18 - маркер молекулярных масс 1кЬБЫА Ladder; 2-17 - изоляты P. aeruginosa
биопленок или покоящихся форм, не выявляемых бактериологическим методом. При проведении контроля обсемененно-сти объектов внешней среды грамотрица-тельными неферментирующими бактериями в общем отделении одного из инфекционных стационаров прямые высевы на селективные среды не дали положительного результата. С помощью молеку-лярно-генетического анализа установлено, что в одной из проб, взятой в отделении, присутствуют бактерии рода Pseudomonas. В ряде случаев решающее значение может иметь и продолжительность проведения анализа. Так, при проведении контроля микробной обсемененности окружающей среды в хирургическом отделении другой больницы методом ПЦР был получен положительный результат в течение одного рабочего дня. Бактериологическое исследование подтвердило наличие в пробе бактерий P. aeruginosa, однако на это потребовалось 3 дня.
ся препаратами выбора в терапии тяжелых инфекций, вызванных P. aeruginosa [4]. Наиболее распространенными механизмами резистентности к карбапенемам у P. aeruginosa являются: мутации и, как следствие, снижение поступления антибиотика в бактериальную клетку, активное выведение антибиотика из клетки и ферментная инактивация. Последний механизм может реализовываться с помощью бета-лактамаз различных молекулярных классов: ферментами класса А (GES, KPC), D (OXA-50) и металло-бета-лактамазами класса В (VIM, IMP и др.) [7, 8]. Для P. aeruginosa описано пять основных групп металло-бета-лактамаз. Все они содержат по два атома цинка и различаются аминокислотными последовательностями. Гены, кодирующие большую часть этих ферментов, в составе генных кассет включены в различные мобильные элементы, в основном интегроны 1-го класса (рис. 3).
Рис. 3. Классификация бета-лактамаз (М.В. Эйдельштейн, 2001)
Выявление лекарственной устойчивости. Среди большого круга проблем, связанных с резистентностью госпитальных штаммов P. aeruginosa к широкому спектру антибактериальных препаратов, наиболее значимой является их устойчивость ко многим бета-лактамным антибиотикам (БЛА). Особую опасность представляет резистентность синегнойной палочки к карбапенемам - меропенему и имипенему, которые наряду с другими «антисинегнойными» средствами являют-
В результате изучения устойчивости к карбапенемам 178 штаммов P. аeruginosa, изолированных в разных стационарах, выявлено, что подавляющее большинство резистентных культур выделено из ОРИТ хирургических стационаров. В учреждении родовспоможения и детских стационарах циркулируют преимущественно чувствительные изоляты. Доля меропене-моустойчивых штаммов синегнойной палочки в целом составила 42,5 %, имипе-немоустойчивых - превысила половину.
К обоим антибиотикам нечувствительны 35,4 % P. аeruginosae [2].
Проведен скрининг генов металло-бе-та-лактамаз и оксациллиназ методом ПЦР. Анализ генов и поиск гомологичных последовательностей осуществляли, используя программы BLAST и базы данных GenBank. Продуценты металло-бета-лактамаз составили 19,1 % от всех и 30,3 % от карбапенемоустойчивых культур. Установлено, что в геноме данных штаммов присутствуют гены b/aVIM-2. Сравнительный анализ определенных аминокислотных последовательностей бета-лактамаз изученных штаммов позволил определить их в группу VIM-2-по-добных ферментов (рис. 4). Необходимо отметить, что из 42 штаммов, изолированных от пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) хирургических стационаров, 16 (38 % !)
Рис. 4. Древо сходства нуклеотидных последовательностей полных генов металло-бета-лактамаз (группа VIM) бактерий рода Pseudomonas, построенное методом UPGMA: жирным шрифтом выделены анализируемые нозокомиальные штаммы P. aeruginosa.
В скобках указаны номера последовательностей, депонированных в GenBank, или обозначение штамма
продуцировали VIM-2 металло-бета-лак-тамазы. В то же время в детских и родовспомогательных учреждениях не было выявлено ни одного подобного штамма.
Специфичная амплификация с прай-мерами к гену b/aOXA_50 (фрагмент 869 п.н.) обнаружена только у 12 (13,2 %) штаммов P. aeruginosa, изолированных из хирургических стационаров «взрослой» клиники, тогда как в детских ЛПУ, включая и родильные стационары, - у 27 (31 %) изолятов. Сравнение нуклеотидных последовательностей изучаемых генов у ряда штаммов выявило, что 5 изо-лятов имеют последовательность b/aOXA.50c и один - b/aOXA-0g. Большая часть штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в детской клинике, имеет последовательности, на 100 % идентичные гену b/apoxB (b/aOXA-50_iike) P. aeruginosa MF 6.
Таким образом, использование моле-кулярно-генетичеких методов исследования в изучении механизмов устойчивости штаммов P. aeruginosa к карбапенемам выявило, что в ОРИТ хирургических стационаров циркулируют преимущественно продуценты VIM-2-подобных ферментов, в детских - продуценты оксациллиназ. Эти данные имеют большое практическое значение в связи с тем, что локализация генов металло-бета-лактамаз на мобильных носителях приводит к быстрому распространению последних среди клинически значимых микроорганизмов и можно ожидать роста устойчивости к карбапене-мам госпитальной синегнойной палочки в ОРИТ «взрослых» ЛПУ. Более благоприятная ситуация отмечена в детских и родовспомогательных лечебных учреждениях.
Генотипирование возбудителей ГСИ. В настоящее время молекулярно-ге-нетические методы широко используются для подвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, что особенно ценно при проведении эпидемиологических исследований [5]. Один из первых и наиболее общий подход основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Чаще всего используется один
коротким праимер с произвольном, случайной последовательностью. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD-ПЦр (Random Amplified Polymo-phic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) [12, 13].
Первые попытки использовать вышеописанные технологии генотипирования были предприняты нами в 2006 г. в кли-нико-эпидемиологическом анализе госпитального сепсиса, ассоциированного с P. aeruginosa, в инфекционном стационаре. Для подтверждения нозокомиальной природы изолированных бактериальных культур был применен метод RAPD-ПЦР. Путем сопоставления электрофоретиче-ских профилей установлено, что RAPD-спектры изученных образцов были идентичны.
Позднее провели углубленные динамические исследования культур P. aeruginosa с целью изучения распространения носительства синегнойной палочки в одном из акушерских стационаров и двух детских больницах. Было изучено 114 культур P. aeruginosa, изолированных от детей, и 12 культур с объектов больничной среды. Важной клинической и эпидемиологической задачей явилось определение генотипа различных штаммов синегнойной палочки. В результате генотипирования штаммов P. aeruginosa выделено три геномоварианта (рис. 5). Штаммы оценены как близкородственные и, скорее всего, являлись результатом персистирования «модального» штамма в акушерском стационаре с дока-
занным распространением в детские больницы.
На основании результатов анализа эпидемиологических данных, фено- и генетического типирования культур P. aeruginosa был разработан необходимый комплекс противоэпидемических мероприятий. К настоящему времени создана база данных «генетических паспортов» штаммов P. aeruginosa, выделенных в лечебно-профилактических учреждениях г. Перми, которая постоянно пополняется.
Таким образом, опыт сотрудничества специалистов кафедры микробиологии и вирусологии ПГМА, лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН и врачей-бактериологов, в том числе из созданной в 2009 г. референс-лаборатории, позволяет констатировать, что молеку-лярно-генетические методы не могут заменить методы «классической бактериологии», которые совершенно правомерно и успешно используются в рутинной лабораторной практике. Вместе с тем очевидны преимущества ПЦР диагностики на этапе скрининга, при решении вопросов эпидемиологической направленности, в сложных, зачастую «арбитражных» ситуациях внутрибольничного инфицирования. Все это подтверждает целесообразность и эффективность комплексного подхода с привлечением как традиционных бактериологических, так и молеку-лярно-генетических методов в решении задач диагностики внутрибольничных инфекций и проведении мониторинга возбудителей ГСИ.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 М
Рис. 5. Пример электрофоретического анализа продуктов RAPD-ПЦР с использованием праймера М13; 1-17 - изоляты, выделенные от новорожденных, М-маркер молекулярных
масс 1кЪ DNA Ladder
Библиографический список:
1. Зуева Л.П., Яфаев Р.Х. Эпидемиология. - СПб: изд-во «Фолиант», 2005. - 752 с.
2. Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Егорова Д.О., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2010. - Т. 12. - № 3. - С. 246-251.
3. Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2000. - Т. 2. - № 3. -С. 9-100.
4. Решедько Г.К., Рябкова Е.Л., Фаращук А.Н., Страчунский Л.С. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2006. - 8 (3). - С. 243-59.
5. Шагинян И.А. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2000. - Т. 2. - № 3. - С. 82-95.
6. Bergen G.A., She/hamer J.H. // Infect. Dis. Clin. North. Am. - 1996. - Vol. 10. - P. 297-326.
7. Bush K., Jacoby G.A. // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2010. - Vol. 54. - P. 969-976.
8. Ha// L.M.C., Livermore D.M., Gur D. et a/. // Antimicrob. Agents. Chemother. - 1993. - Vol. 37. - P. 1637-1644.
9. Lyczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B. // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15. - P. 194-222.
10. Spi/ker T, Coenye T, Vandamme P., LiPuma J.J. // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - Р. 2074-2079.
11. Van De/den C., Igewski B. // Emerg. Infect. Dis. - 1998. - Vol. 4. - P. 551-560.
12. We/sh J., McC/e//andM. // Nucleic. Acids. Res. - 1990. - Vol. 18(24). - P. 7213-7218.
13. Wi//iams I., Kube/ik A.R., Livak K.I et a/. // Nucleic. Acids. Res. - 1990. - Vol. 18(22). - P. 6531-6535.
