CC BY
102
34 ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙИ ЭВОЛЮцИя
УДК 575.174.015
© А. в. пикунова1,
Е. в. Мартиросян2, С. д. князев1,
н. н. рыжова2
1 Орловский государственный аграрный университет, Орёл
2 Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, Москва
& RAPD-анализ был использован для изучения вариабельности генома и филогенетических отношений у представителей рода Ribes Ь. оценен межвидовой, внутривидовой и межсортовой полиморфизм 47 образцов. Выявленный полиморфизм позволил различить близкородственные сорта. Идентифицированы фрагменты, специфичные как для отдельных образцов, так и для таксономических групп. Рассчитанные коэффициенты генетических различий и топология дендрограммы поддерживают выделение красных смородин, черных смородин и крыжовника и как таксонов одного уровня. Смородинно-крыжовниковые гибриды показали большее сходство с представителями черной смородины, чем с крыжовниками.
& Ключевые слова: RAPD; филогения; полиморфизм; смородина; крыжовник; Ribes L; молекулярные маркеры.
Поступила в редакцию 04.08.2010 Принята к публикации 30.12.2010
применение rapd-анализа для изучения генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода ribes l.
Род смородина Ribes L. включает в себя более 150 кустарниковых видов, произрастающих главным образом в умеренной зоне северного полушария. Хозяйственное значение имеют смородина черная (Ribes nigrum L.), смородина красная (Ribes rubrum L.) и крыжовник (Ribes uva-crispa L.). При этом смородина черная — ведущая ягодная культура в России (Князев и Огольцова, 2004).
Наиболее разработанными на сегодня являются таксономические классификации рода Ribes, основанные на его морфологических особенностях (Rehder, 1954) и скрещиваемости видов (Кеер, 1962). Ряд систематиков выделяли два рода: Ribes (виды смородины) и Grossularia Hill. (виды крыжовника) (Berger, 1924; Coville and Britton, 1908; Komarov, 1971). Однако, по мнению Р Бреннана (Brennan et al, 2008), К. Наммера и Д. Барнея (Hummer and Barney, 2002), в настоящее время наиболее общепринятой является концепция одного рода Ribes сформулированная еще Э. Янчевским (Janczewski, 1907), и далее развиваемая Синнот (Sinnott, 1985) и др. (Rehder, 1954; Кеер, 1962). Единство рода косвенно подтверждалось получением смородинно-крыжовниковых гибридов. Тем не менее, некоторые современные авторы придерживаются классификаций, выделяющих два рода (Еремин и др., 2004, Самигуллина, 2006). Также окончательно не определено таксономическое положение отдельных видов и групп видов, например, красных смородин. Так, Эдуард Янчевский (Janczewski, 1907), разделяя род Ribes на 6 подродов, наряду с подродом Coreosma (Spach) Janoz. — черная смородина, Grossularia Rich. — крыжовники предложил выделить виды красной смородины в отдельный подрод Ribesia Berl, в то время как Альфред Редер (Rehder, 1954), выделяя 4 подрода, объединяет красную и черную смородины в один подрод Ribesia. Элизабет Кип (Кеер, 1962) на основании данных о скрещиваемости и возможности получения межвидовых гибридов предлагает увеличить число подродов до 9, также выделяя красную смородину в отдельный подрод. М. Веигенд (Weigend, 2007) выделяет семь подродов и допускает возможность рассматривать данные подроды на уровне родов, но считает это излишним в силу общего морфологического единства рода.
Кроме того до настоящего времени в систематике Ribes помимо проблем связанных с делением на подроды, существует ряд неоднозначных взглядов на видовой состав рода. Данные факты свидетельствуют о том, что таксономия и филогения рода Ribes окончательно не определены.
В настоящее время представители рода Ribes исследуются довольно интенсивно, в том числе и с использованием молекулярных маркеров. При помощи различных методов молекулярного анализа полиморфизма ядерной и хлоропластной ДНК, таких как полиморфизм рестрикционных сайтов двух регионов хлоропласт-ной (ХП) ДНК (Messinger еt al., 1999), psbA-trnH спейсера ХП ДНКи анализа нук-леотидного полиморфизма внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров (ITS и ETS) рибосомного оперона ядерной ДНК (Schultheis and Donoghue, 2004), анализа нуклеотидного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров ядерной ДНК (Senters and Soltis, 2003) было установлено, что все исследованные образцы видов смородин и крыжовника объединяются вместе, что свидетельствует о спорности родового статуса Grossularia и возможности включения его в состав рода Ribes в ранге подрода. Отдельный интерес представляет определение уровня внутривидового полиморфизма у R. nigrum, являющейся ведущей ягодной культурой рода, а также межвидового полиморфизма видов, потенциально важных для селекции новых сортов смородины. Согласно RAPD-анализу, геномная вариабель-
ность 21 образца черной смородины европейской селекции оказалась гораздо ниже, чем предполагалось по результатам анализа родословных (Lanham et al., 1995). В то время как полиморфизм видов, используемых в селекционных программах, по данным RAPD- и ISSR-анализов был достаточно высок (Lanham et al., 2000).
В настоящей работе молекулярный метод RAPD-ана-лиза был впервые использован для анализа образцов коллекции рода Ribes генбанка ВНИИСПК (г. Орел). Целью исследования являлось изучение межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетических отношений у культивируемых видов (черная смородина, красная смородина, крыжовник) и видов, составляющих вторичный генетический пул культурных видов, а также уточнения существующих таксономических категорий представителей рода.
Для этого были выделены следующие задачи: 1) оценка геномного разнообразия представителей рода Ribes, наиболее часто используемых в селекции современных сортов; 2) получение молекулярных данных о сходстве геномов гибридных и родительских форм смородины и крыжовника; определение их филогенетического родства; 3) оценка геномного разнообразия сортов отечественной селекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал
Для молекулярного анализа были подобраны 47 образцов из коллекции ВНИИСПК подродов Grossularia (крыжовники) и Ribesia (смородина) рода Ribes, последний из которых был представлен четырьмя секциями (Eucoreosma Jancz., Colobotrya Spach, Symphocalyx Berl., Ribesia Berl., emend Jancz.), включая дикорастущие формы и сорта, имеющие разное происхождение (Дальний Восток, Америка, Европа) (табл.1).
Вид R. nigrum, являющийся основой современных сортов черной смородины, был представлен в анализе 9 образцами 3 подвидов. Также в анализ были включены такие родственные R. nigrum виды из секции Eucoreosma (черной смородины), как R. ussuriense Jancz. (С. уссурийская), R. dikushaFisch. ex Turcz. (С. дикуша), R. hudzonianum Rich. (С. гудзонская), R. bracteosumDougl. (С. прицветниковая), R. pauciflorum Turcz. ex Pojark. (С. малоцветковая) и R. procumbens Pall. (С. моховая), которые также присутствовали в составе гибридных форм и сортов смородины. Данные виды являются донорами устойчивости к различным фитопатогенам и используются для улучшения современных сортов смородины черной. Кроме того, в работу были включены 4 комплексных гибрида (В1613/17, Кипиана, Гамма и Грация), в родословной которых присутствовали виды Ribes, относимые Редером к трем различным секциям: Eugrossularia Engl., Eucoreosma и Colobotrya.
Секция Ribesia (смородина красная) была представлена в анализе шестью видами: R. rubrum (С. красная), R. sativum Syme (С. обыкновенная), R. warszewiczii Jancz. (С. Варшевича), R. palczewskii (Jancz.) Pojark.
(С. Пальчевского), R. petraeum Wulf. var. atropurpureum (С. Темно-пурпуровая), R. multiflorumKit. (С. Многоцветковая), а также двумя гибридными формами (970-18-41 и 1002-17-110). Кроме того, в работу были взяты представители секции Colobotrya — R. sanguineum Purch. (С кроваво-красная), секции Symphocalyx — R. aureum Purch. (С. золотистая) и секции Eugrossularia — Ribes uva-crispa (=R. grossularia L., крыжовник), а также смо-родинно-крыжовниковые гибриды (Йошта и 203029-61).
Некоторые сорта (Оджебин, Виктория и др.) были созданы путем отбора из диких популяций определенных видов и поэтому в данной работе рассматриваются как представители этих видов.
В качестве существенно отличающегося генотипа — внешней группы нами выбран Philadelphus pallidus Hayek., семейство гортензиевые (Hydrangeaceae). Как отмечает А. Г. Еленевский (2001), ранее семейства крыжовниковые (Grossulariaceae) и гортензиевые рассматривались в составе семейства камнеломковые (Saxifragaceae). В таксономической системе классификации цветковых растений Кронквиста (Cronquist, 1988) семейство гортензиевые, так же как и крыжовниковые, отнесено к порядку розоцветные (Rosales).
Экстракция ДНК
Выделение растительной ДНК производили из молодых листьев по методике для растительного материала с высоким содержанием полифенольных соединений, предложенной Д. Пучооа (Puchooa, 2004).
pCR-анализ
Для PCR-анализа были использованы праймеры серий OPA, OPD, OPE, OPH, OPK, OPN («Operon Technologies», США). Реакцию амплификации проводили в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP; 0,5 мкМ праймера; 0,3 единицы Taq полимеразы, 1x буфер из соответствующего набора («Диа-лат ЛТД», Москва), и 100 нг геномной ДНК, в термоцик-лере GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США) в режиме: денатурация — 30 с при 94 °С; отжиг праймера — 45 с при 37 °С; синтез ДНК — 1 мин при 72 °С с числом циклов — 36 и предварительной денатурацией — 5 мин (94 °С). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле (High resolution, «Sigma») в 1хТВЕ буфере, с последующим окрашиванием бромистым этидием. При разделении фрагментов на геле использовали GeneRulerTM 100bp DNK Ladder Plus (Fermentas, Литва) маркер молекулярных масс.
Статистический анализ
В статистический анализ были включены только четкие фрагменты размером от 300 до 2000 п. н. Величины геномного полиморфизма рассчитывались как процент полиморфных фрагментов от общего числа фрагментов в отдельной таксономической группе.
36
ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ
Таблица 1
Взятые в анализ образцы рода И1Ье8, их таксономическая принадлежность (основана на классификации Редера (Rehder, 1954)
№ в анализе Название образца Вид/ разновидность Подрод Секция Виды и формы, присутствующие в родословной Оригинатор
1 2 3 4 5 6 7
2 258 R. grossularia L. Grossularia Rich. Eugrossularia Engl. ВНИИСПК, Орел
3 250
4 Гроссуляр R. grossularia L.
5 13-15-3
6 Йошта Гибрид Ribes х nidigro-laria Rud. Bauer & A. Bauer Grossularia Rich. x Ribe-sia Berl. Eugrossularia Engl. х Eucoreo-sma Jancz. R. grossularia L. R. divaricatum Dougl. ФРГ
7 203029-61 R. nigrum L. Россия
8 В1613/17 Комплексный гибрид, включает: Великобритания (Ист-Молингский институт)
Grossularia Rich. Eugrossularia Engl. R. oxycanthoides L.
Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L.
R. bracteosum Dougl.
Colobotrya Spach R. glutinosum Benth.
9 29 35 Кипиана Гамма Грация Комплексный гибрид, включает: ВНИИСПК, Орел
Grossularia Rich. Eugrossularia Engl. R. oxycanthoides L.
Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. sibiricum W Wolf R. nigrum L. var. scandi-navicum R. nigrum L. var. europaeum Jancz.
R. dikusha Fisch.
Colobotrya Spach R. glutinosum Benth.
10 Бурая сладкая R. nigrum L. var. sibiricum W Wolf Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. СССР, Бачкар
11 Памяти Правику R. nigrum L. var. sibiricum W Wolf R. nigrum L. var. europaeum Jancz. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. СССР, Украина
12 Ртищевская R. nigrum L. var. europaeum Jancz. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. СССР, Саратов
16 Веллингтон-30 Великобритания
13 Отелло R. nigrum L. var. europaeum Jancz. X ?* Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. Чехословакия, Бойнице
14 Северянка СССР, Киров
15 Силго ФРГ, Кельн
17 Бен Сарек R. nigrum L. var. europaeum Jancz. R. nigrum L. var. scandinavicum Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. Великобритания, Шотландия
Таблица 1 (продолжение) взятые в анализ образцы рода И1Ье8, их таксономическая принадлежность (основана на классификации редера (Rehder, 1954)
№ в анализе Название образца Вид/ разновидность Подрод Секция Виды и формы, присутствующие в родословной Оригинатор
18 Бен Ломонд гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. euro- paeum Jancz. R. nigrum L. var. scandinavicum Великобритания, Шотландия
R. ussuriense Jancz.
19 Оджебин R. nigrum L. var. scandinavicum Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. Северная Швеция
20 Титания гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. sibiricum W. Wolf R. nigrum L. var. scandinavicum R. nigrum L. var. europaeum Jancz. Швеция
R. ussuriense Jancz.
21 Сластена гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. sibiricum W. Wolf R. nigrum L. var. scandinavicum R. nigrum L. var. europaeum Jancz. R. dikusha Fisch. ВНИИСПК, Орел
22 Памятная Украина
25 Ажурная ВНИИСПК, Орел
24 Орловская серенада ВНИИСПК, Орел
27 Ладушка ВНИИСПК, Орел
28 Очарование ВНИИСПК, Орел
30 Черная вуаль ВНИИСПК, Орел
31 Блакестон ВНИИСПК, Орел
32 Монисто ВНИИСПК, Орел
33 Искушение ВНИИСПК, Орел
26 Дачница ВНИИСПК, Орел
23 DikXHud 38 гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. hudzonianum Rich.
R. dikusha Fisch.
34 Чудное мгновение гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. sibiricum W. Wolf R. nigrum L. var. scandinavicum R. nigrum L. var. europaeum Jancz. ВНИИСПК, Орел
R. dikusha Fisch.
R. pauciflorum Turcz. ex Pojark.
36 Уссури R. ussuriense Jancz. Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. Дальневоточная станция ВИР
Таблица 1 (окончание)
взятые в анализ образцы рода И1Ье8, их таксономическая принадлежность (основана на классификации редера (Rehder, 1954)
№ в анализе Название образца Вид/ разновидность Подрод Секция Виды и формы, присутствующие в родословной Оригинатор
37 3864-46-62 гибрид Ribesia Berl. Eucoreosma Jancz. R. nigrum L. var. sibiricum W Wolf R. nigrum L. var. euro-paeum Jancz. R. procumbens Pall. ВНИИСПК
38 Кроваво-красная R. sanguineum Pursh. Ribesia Berl. Colobotrya Spach Дикая форма
39 Приморская форма R. multiflorum Kit. или R. mandshuricum (Maxim. ) Kom. ** Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Дикая форма
40 1002-17-1 10 гибрид Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. R. multiflorum Kit. R. sativum Syme var. macrocarpum Jancz. R. petraeum Wulf. var. at-ropurpureum (C. A. May. ) ВНИИСПК, Орел
41 Смородина Темно-пурпуровая R. petraeum Wulf. var. atropurpure-um (C. A. May. ) Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Дикая форма
42 970-18-41 Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. R. sativum Syme R. rubrum L. R. petraeum Wulf. var. at-ropurpureum (C. A. May. ) ВНИИСПК, Орел
43 Виктория R. rubrum L. Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Европа
44 Голландская белая R. sativum Syme Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Европа
45 Файя плодородная R. sativum Syme var. macrocarpum Jancz. Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Американское происхождение
46 Красная Виксне R. warszewiczii Jancz. Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz. Прибалтика
47 Скороспелая R. palczewskii (Jancz. ) Pojark. Ribesia Berl. Ribesia Berl. , emend. Jancz.
48 Ляйсан R. aureum Pursh. Ribesia Berl. Symphocalyx Berl.
* — родословную некоторых сортов невозможно установить точно, данные утеряны; ** — дикая форма, к какому именно виду принадлежит, не установлено.
Статистическую обработку данных, расчет генетических расстояний (GD) с использованием коэффициента различий и кластерный UPGMA анализ проводили с использованием программ STATISTICA-6.0 и TREECON (Van de Peer and de Wachter, 1994)/ PAUP 4.0b.
Близость между образцами по данным родословных подсчитывалась, как описано в работе П. Ланхема и др. (Lanham et а1.,1995). Условно принималось, что генотипы родителей определенного образца составляют по 50 % его генотипа, соответственно генотипы предков родителей — по 25 % и т. д. Наименьшее процентное
Таблица 2
Образец специфичные RAPD-фрагменты
№ в анализе Название образца Специфичные фрагменты
Кол-во Название праймера и размер фрагмента
36 R. ussuriense Jancz. 1 0PN14-740
37 R. nigrum L. / R. procumbens Pall. 4 0PN8-510,0PN 14-550,0PN14-750, 0PD6-590
38 R. sanguineum Pursh. 5 0PE2-1000,0PE2-1450,0PN14-1320,0PE3-670, 0PD3-1150
39 R. multiflorum Kit. или R. mandshuricum (Maxim.) Kom. 5 0PE2-700,0PN19-530,0PN19-710,0PE3-1350,0PD6-640
4 R. grossularia L. (сорт Гроссуляр) 1 0PD3-1170
45 R. sativum Syme var. macrocarpum Jancz. 1 0PN8-500
11 R. nigrum L. var. sibiricum W Wolf / R. nigrum L. var. europaeum Jancz. 1 OPD3-6
48 R. aureum Pursh. 4 0PN8-600,0PE1-790,0PE2-530,0PN14-720
23 R. dikusha Fisch. / R. hudzonianum Rich. 3 0PE5-430,0PD6-600,0PD6-810
42 R. sativum Syme / R. rubrum L. / R. petraeum Wulf. var. atropurpureum (C. A. May.) 1 0PD6-650
содержание общих генотипов, присутствующих в родословных обоих образцов, суммировалось.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование генетического полиморфизма образцов рода Ribes L.
В результате предварительной работы на ограниченной выборке образцов было протестировано 18 олигонуклео-тидных RAPD-праймеров. Из них было отобрано 9 (OPD6, OPD3, OPN14, OPN8, OPN19, OPE1, OPE3, OPE5, OPE2) наиболее информативных, позволивших получить высоко полиморфные (97—100 %) спектры ДНК-фрагментов геномов смородин и крыжовника. В работе П. Ланхема и др. (Lanham et al., 1995) при анализе генома образцов черной смородины только 26 % амплифицированных фрагментов были полиморфны, что, видимо, можно объяснить тем, что авторы не проводили предварительного отбора праймеров при проведении RAPD-маркирования.
Использование 9 отобранных праймеров для молекулярного RAPD-анализа 47 образцов рода Ribes позволило детектировать 274 фрагмента размером от 330 до 2000 п. н., из которых 270 были полиморфными. Число фрагментов варьировалось от 22 (OPD6) до 40 (OPN14) и в среднем в пересчете на праймер составило 30. В результате каждый образец был охарактеризован уникальным набором RAPD-фрагментов. При этом были идентифицированы фрагменты, специфичные как для отдельных образцов, так и для представителей определенных таксонов. Выявлено от 1 до 5 генотипспецифичных фрагментов (табл. 2). Один генотипспецифичный фрагмент обнаружен у сортов Гроссуляр — R. grossularia, Файя Плодородная — R. sativum Syme var. macrocarpum Jancz., Памяти Прави-ку — R. nigrum L. var. Sibiricum W Wolf. x R. nigrum L.
var. europaeum Jancz. и др., наибольшее количество специфичных фрагментов (5) у смородины кроваво-красной — R. sanguineum и Приморской формы — предположительно R. multiflorum Kit. или R. mandshuricum).
Данные проведенного RAPD-анализа были использованы для оценки межсортовой, внутривидовой, межвидовой, межсекционной и межподродовой вариабельности ядерного генома и сходства геномов различных таксонов рода Ribes (табл. 3). В результате было установлено, что у исследованных образцов рода Ribes диапазон генетических различий варьировался в пределах от 0,01 (между двумя сортами черной смородины, представителями европейского подвида — Северянка и Отелло) до 0,23 (между R. aureum секции Symphocalyx и R. sanguineum секции Colobotrya).
В целом диапазон генетических различий 27 сортов и гибридов черной смородины секции Eucoreosma, включая образцы, в родословных которых присутствовали другие виды секции Eucoreosma (R. brateosum, R. pauciflorum. R. dikusha, R. ussuriense и др.), секции Colobotrya (R. glutinosum Benth.), подрода Grossularia (R. oxycanthoides L.) составил 0,01—0,07 и был ниже, чем у пяти образцов красной и белой смородин секции Ribesia — 0,04—0,09, в родословных которых присутствовали только виды секции Ribesia R. rubrum, R. sativum, R. warszewiczii, R. palczewskii. Выявленные особенности, по всей видимости, могут быть связаны с тем, что в селекции сортов черной смородины преимущественно используются подвиды R. nigrum (С. черная), в то время как в селекции красной и белой смородин в равной мере задействованы 3 вида R. rubrum (С. красная), R. sativum (С. обыкновенная), R. petraeum (С. скалистая) (Brennan, 2008).
Генетические различия для представителей Eucoreosma (черная смородина) и селекционных форм на основе R. nigrum составили 0,01—0,08; для представителей
Таблица 3
показатели генетических расстояний представителей рода Ribes L., рассчитанные на основе RAPD данных
Группа образцов Вариабельность внутри группы Среднее значение Стандартная ошибка
Межподродовые расстояния
Grossularia Rich. и Ribesia Berl. секция Ribesia Berl., emend Jancz. 0,13-0,19 0,16 0,0024
Grossularia Rich. и Ribesia Berl. секция Eucoreosma Jancz. 0,12-0,17 0,14 0,0011
Colobotrya Spach — Grossularia Rich. 0,15-0,18 0,17 0,0069
Symphocalyx Berl. — Grossularia Rich. 0,19-0,21 0,2 0,0036
Межсекционные расстояния
секция Eucoreosma Jancz и секция Ribesia Berl, emend janc 0,14-0,21 0,16 0,0006
Colobotrya Spach — Ribesia Berl. 0,14-0,23 0,17 0,0078
Colobotrya Spach — Eucoreosma Jancz. 0,12-0,16 0,14 0,0020
Symphocalyx Berl. — Ribesia Berl. 0,15-0,18 0,16 0,0032
Symphocalyx Berl. — Eucoreosma Jancz. 0,17-0,22 0,19 0,0022
Symphocalyx Berl. — Colobotrya Spach 0,22
Межвидовые (виды принадлежат одной секции)
R. nigrum, R. ussuriense (секция Eucoreosma Jancz ) 0,04-0,05 0, 05 0,0009
Приморская форма, R.petreum var. atropurpureum, R.rubrum, R. sativum, R.warszewiczii, R. palczewskii (секция Ribesia Berl emend jancz) 0,05-0,13 0,08 0,006
внутрисекционные
секция Eucoreosma Jancz 0,01-0,08 0,04 0,0006
секция Ribesia Berl., emend Jancz. 0,04-0,13 0,07 0,0038
секция Eugrossularia Engl. 0,03-0,05 0,04 0,0024
внутривидовые
R. nigrum (10-17,19) 0,02-0,05 0,03 0,0012
Межсортовые
Сорта чёрной смородины (27 образцов, 8—22, 24—35) 0,01-0,07 0,04 0,0004
Сорта красной смородины (5 образцов, 43—47) 0,04-0,09 0,06 0,005
Смородинно-крыжовниковые гибриды
Grossularia Rich. и см.-кр. гибриды 0,08-0,11 0,1 0,003
секция Eucoreosma Jancz. и см.-кр. гибриды 0,05-0,09 0,07 0,001
Ribesia (красная смородина) — 0,04 — 0,13. Сравнительно низкое генетическое различие было детектировано для образцов крыжовника (подрод Grossularia) 0,03—0,05, что, однако, может быть связано с малой представленностью этого подрода в анализе (4 образца).
Интересно отметить, что гибриды Йошта и 20302961, полученные от скрещивания видов, относящихся к разным подродам R. grossularia (подрод Grossularia) и R. nigrum (подрод Ribesia), показали сравнительно большее сходство с представителями секции черной смородины, подрод Ribesia (0,05—0,09), чем с представителями крыжовников, подрод Grossularia (0,08—0,11).
Наибольшие генетические различия обнаружены между представителями секции Ribesia и секции Eucoreosma (0,14—0,21); представителем секции Symphocalyx R. aureum (золотистая смородина) и представителями секции Eucoreosma (черной смородины) (0,17—0,22); представителем секции Symphocalyx R. aureum (золотистая сморо-
дина) и представителем секции Colobotrya R. sanguineum (кроваво-красная смородина) (0,23); представителем секции Colobotrya ^ sanguineum (кроваво-красная смородина) и представителями секции Ribesia (красная смородина) (0,14—0,23), в то время как различия между представителями подродов Grossularia и Ribesia были на том же уровне или даже меньше, например, между представителями подрода Grossularia (крыжовник) и представителями подрода Ribesia секции Eucoreosma (черная смородина) (0,12— 0,17); представителями подрода Grossularia (крыжовник) и представителем подрода Ribesia секции Colobotrya — ^ sanguineum (кроваво-красная смородина) (0,15—0,18).
Таким образом, согласно данным RAPD-анализа, в целом значения генетических различий между представителями разных секций подрода смородин (0,12—0,23) даже несколько превышали различия между представителями разных подродов (подрод смородин Ribesia и подрод крыжовников Grossularia) (0,12—0,21). Этот факт
поддерживает выделение вышеперечисленных секций в отдельные подроды. Это наиболее полно отражено в классификации Элизабет Кип (Кеер, 1962), выделяющей 9 подродов, включая подроды Grossularia, Symphocalyx, ЩЬе^ш, Со1оЬоЩа, за исключением объединения секции Eucoreosma и секции Со1оЬоЩш в подрод Со1оЬоЩш.
Выявленное несколько большее родство исследованных представителей черной смородины (подрод Ribesiш, секция Eucoreosma) и крыжовника (подрод Grossularia), с одной стороны, может быть связано с присутствием крыжовников в родословных отдельных сортов черной смородины. С другой стороны, сама возможность гибридизации и существования гибридных форм между представителями секции Eucoreosma подрода Ribesia и представителями подрода Grossularia, вероятно, говорит о сравнительно большем родстве черной смородины и крыжовника и несоответствии таксономического разделения рода Ribes на подроды Grossularia (крыжовник) и Ribesia (смородина).
Кроме того, заметное отличие образцов кроваво-красной смородины R. sanguineum (секция Со1оЬо1гуш) и золотистой смородины R. aureum (секция Symphocalyx) от представителей других секций данного подрода Ribesia также говорит в пользу необходимости пересмотра их таксономической принадлежности.
Интересно также отметить, что R. sanguineum (смородина кроваво-красная, секция СоОЬоЩш, подрод Ribesia) имеет сходство (0,14) с образцами черной смородины (секция Eucoeosma, подрод Ribesia) и крыжовника (0,17) (подрод Grossulшria). Выявленное большее сходство геномов, относящихся к разным секциям и подродам, действительно имеет под собой определенные основания. Так, например, известно, что R. sanguineum var. glutinosum (= R. glutinosum БепШ.) может давать гибридные формы с видами секции черной смородины и присутствует в родословных ряда исследованных сортов и гибридов (Князев и Огольцова, 2004).
В целом, согласно коэффициентам генетических различий, среди исследованных представителей 4 секций рода Ribes, можно выделить три неформальные группы по степени сходства геномов: 1) представители секций Eucoreosma и Colobotrya подрода Ribesia и представители подрода Grossularia, 2) представители секции Ribesia, 3) представитель секции Symphocalyx.
Исследование таксономических и филогенетических отношений анализируемых представителей рода Ribes
На основании полученных RAPD-спектров методом кластерного анализа (UPGMA) была построена дендро-грамма, наглядно отражающая степень различий исследованных образцов (рис. 1).
Все исследованные образцы рода с 93 % бутстреп-под-держкой объединяются в один общий кластер, а образец внешней группы занимает базальное положение на дендро-грамме. Объединение всех исследованных образцов рода Ribes наблюдалось и в других работах по молекулярной
филогении (Messinger et al.,1999; Senters and Soltis; 2003; Schultheis and Donoghue, 2004), в которых оценивался полиморфизм как ядерной, так и хлоропластной ДНК.
Исследованные представители рода Ribes образуют три основные группы (рис. 1).
Первая группа, главным образом, включает в себя представителей секции Eucoreosma подрода Ribesia (смородина черная), а также смородинно-крыжовнико-вые гибриды. Вторая группа представлена крыжовниками R. grossularia (подрод Grossularia), и третья — сортами и гибридными формами красной смородины, секция Ribesia подрода Ribesia. Отдельные ветви формируют представитель секции Colobotrya подрода Ribesia — образец R. sanguineum (смородина кроваво-красная) и представитель секции Symphocalyx подрода Ribesia — образец R. aureum (смородина золотистая).
В первой группе основной кластер образуют формы черной смородины, генетической основой которых является вид R. nigrum. Несколько обособленно от него группируются гибридная форма R. nigrum х R. procumbens, представитель вида R. ussurienses и смородинно-кры-жовниковые гибриды.
На дендрограмме к кластеру черных смородин с высокими значениями индекса бутстрепа (ИБ 100 %) примыкают смородинно-крыжовниковые гибриды (Йошта и 2030-29-61), что, вероятно, свидетельствует о преобладании у них генома черной смородины. По данным П. Ланхема и др. (Lanhum et al., 1995) группа смородин-но-крыжовниковых гибридов также размещается внутри группы сортов черной смородины.
Отдельную ветвь в этой группе формирует гибридная форма R. dikusha х R. hudsonianum. Полученные результаты подтверждают данные П. Ланхема и др. (Lanham et al., 2000) по RAPD- и ISSR-маркированию, согласно которым образцы секции Eucoreosma — R. dikusha, R. nigrum и R. ussurienses — так же объединяются в одну группу. Аналогичным образом образцы этих видов кластеризуются вместе на основании данных полиморфизма ITS ядерной ДНК и рестрикционных сайтов хлоропластной ДНК (Messinger et al., 1999; Senters and Soltis, 2003).
Как было сказано выше, основной кластер первой группы представлен сортами и гибридными формами смородины черной R. nigrum. Наиболее многочисленную подгруппу черных смородин образуют комплексные современные сорта, полученные в результате скрещивания подвидов смородины черной и других видов, а также собственно образцы подвидов, представленные сортами, полученными в результате отбора из диких популяций или селекционной работы, c образцами подвидов R. nigrum: R. nigrum var. europaeum (сорта Ртищевская, Веллингтон-30, Отелло, Северянка, Силго), R. nigrum var. sibiricum (сорт Бурая сладкая) и R. nigrum var. scandinavicum (сорт Оджебин).
Было интересно проследить корреляцию между кластеризацией по данным анализа полиморфизма генома и данным родословных анализируемых образцов черной
42
ГЕНЕТИКА ПОПУЛяЦИй И ЭВОЛЮЦИя
0.7
ч-
0.6 —I-
0.S —
0.4 —I-
0.3 —(-
0.1 —I-
57
73
93
100
96
79 г
99
6-
1-е
Hi
4_Я.иуа-спзра
5_Л.та-спзра (13-15-3)
2_Н.ита-сп$ра(258)
3_ К.ша-сг1зра(250)
6_1^.и>а-спзрах1ч.т°гит(Иошта)
7_11.ша-спзрахН^гит(20-30-29-61)
13_Я.т^гитх?(Отелло)
14_Л.т£:гитх?(Северянка)
29_комплексный гнорнд (Гамма)
35_комплекснын гнорнд (Грация)
32_11.1^гит/КЛ1кизЬа(Моннсто)
8_комплексный гнбрнд(В1б13/17)
9_комплекснын г нбрнд(Кнпнана)
24_Я.п1§гиш/К.(11кизЬа(Орловская серенада)
15_Я.1^гипи?(Снлго)
27_R.nigrum/R.dikusha(Лaдyшкa)
28_К.ш§гит/К.(ИкизЬа(Очарование)
31_К.п1§гит/К.(Ики5Ьа(&'1акестон)
33_К.ш°гиш К.<Нкиз11а(11ск"ушение)
25_К.п^гит/К^кизЬа(Ажурная)
21_К.ш<;гиш'Тч^киз!1а(Сластёна)
22_К.мритЛ^ДЦсп5Ь1(ГТ1мятиая)
ll_R.nigrum(Пaмяти Правику)
lб_R.шgrum(Beллннrroн-30)
34_R.nigrum/R.dikusha/R.pauciПorum(Чyднoe мгновение)
2б_К.т°гит/К^кизЬа(Дачннца)
30_Черная вуаль
10_К.т°гит(Бурая сладкая)
20_R.nigrum/R.ussuriense(Tитaння)
12_К..1^гиш(Ртишевская)
17_R.nigrum(Бeн Сарек)
18_К.т§гиш/К.иззипепзе(Бен Ломонд)
19_Ы.п1^гит(Одже6нн)
36_Л-иззипепзе(>"ссурн)
37_R.nigruIn/R.procuшbens(38б4-46-б2)
23_К. hudzonianum.vR.diku з Ьа(01кХНиб 38)
38_R.sanguineum(Kpoвaвo красная)
39_К.ши1пАогит(11рнморская форма)
42_К.заНуитЛ1.гиЬгитУК.реГгеит(970-18-41)
43_К.гиЬгит(Внкторня)
44_К,зап\ иш(Голландская белая)
45_Ы.заП1иш(Фаня Плодородная)
47_Л.ра1сгетузкп(Скороспелая)
41_Л.ре1геит(Тёмно пурпуровая)
40_К.ти1йПоп1т/1^за^Ушп/11.ре1геит(1002-17-110)
4б_Клуагзге\псги(Красная внксне)
48_К.аигеиш(Ляйсан)
1_ои1ёгоир
рис. 1. Дендрограмма сходства 47 образцов рода ШЪгз, построенная на основании ЯДРО данных
смородины. На полученной дендрограмме с высокой бут-стреп-поддержкой (72 %) объединяются сорта, имеющие в родословной представителя скандинавского подвида смородины черной (сорт Оджебин 100 % по родословной R. nigrum var. scandinavicum, Бен Ломонд 50 % скандинавского подвида смородины черной, Бен Сарек — 25 % скандинавского подвида смородины черной в родословной). Однако сорт Титания, в родословной которого R. nigrum var. scandinavicum составляет 25 %, в этот кластер не входит, что, вероятно, связано с присутствием в ее родословной также сибирского подвида (25 %). В работе П. Ланхема и др. (Lanhum et al., 1995) сорта Бен Ломонд и Бен Сарек группируются отдельно от сорта Оджебин.
Среди сортов (Северянка, Отелло, Ртищевская, Сил-го, Веллингтон-30), имеющих в родословной представителя подвида R. nigrum var. europaeum со сравнительно
высокими значениями бутстреп-поддержки, объединяются только сорта Отелло и Северянка (65 %).
Необходимо отметить, что данные кластерного анализа не всегда отражают данные родословных. Так, сорта Гамма, Грация и Кипиана получены из одной гибридной семьи (100 % родства по родословным). Но по данным дендрограммы вместе кластеризуются только сорта Гамма и Грация. В работе П. Ланхема и др. (Lanham et а1., 1995) также отмечается, что группировка сортов черной смородины, основанная на данных родословных, отличается от таковой, основанной на ЯАРО-данных. Авторы указывают несколько причин данных различий: некоторые сорта имеют неизвестное или неточное происхождение, ряд сортов получен от открытого опыления, следовательно, отец неизвестен, некоторые сорта получены в результате отбора из диких популяций.
Второй и наиболее близкий к представителям черной смородины (секция Eucoreosma подрод Ribesia) кластер образуют образцы крыжовника вида R. grossularia, относящегося к подроду Grossularia.
Также к «черносмородинно-крыжовниковому» кластеру примыкает отдельная ветвь, образованная образцом вида R. sanguineum смородины кроваво-красной секции Colobotrya подрода Ribesia. В работе Л. Шул-тис и М. Донохью (Schultheis and Donoghue, 2004) R. sanguineum также группируется с подродом Grossularia на дендрограммах, построенных по данным вариабельности последовательностей ITS, ETS, psbA-trnH и рес-трикционных сайтов хлоропластной ДНК.
Третью группу на дендрограмме образуют представители секции Ribesia (ИБ 96 %), которая подразделяется на ряд отдельных подкластеров. Наиболее крупный под-кластер образуют образцы видов R. sativum (сорт Файя Плодородная, Голландская белая), R. palczewskii (сорт Скороспелая), R. petreum (дикая форма смородины темно-пурпуровой), R. warszewiczii (сорт Красная Виксне), и гибридная форма 1002-17-110, имеющая в родословной генетический материал от R. multiflorum, R. sativum, R. petreum. С этим подкластером объединяется два образца (ИБ 79 %), имеющие в составе своего генома генетический материал вида R. rubrum (сорт Виктория, отобранный из популяции R. rubrum) и гибридную форму 970-18-41.
Базальную ветвь в третьей группе формирует приморская форма, являющаяся предположительно образцом вида R. multiflorum или вида R .mandshuricum.
Несмотря на то что по классификации GRIN (http://www. ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?31860) R. sativum и R. rubrum являются синонимами, согласно полученным нами данным, представители R. sativum отделяются от R. rubrum и проявляют большее сходство с представителями таких видов, как R .palczewskii, R. petreum, R. warszewiczii.
По данным полиморфизма ITS рДНК-секция Ribesia также не монофилетична (Senters and Soltis, 2003). Половина включенных в анализ видов секции Ribesia (R. mandshuricum, R. petraeum, R. triste) образуют отдельную группу, в то время как оставшиеся виды (включая R. rubrum) кластеризуются с образцами, представленными преимущественно видами подрода Berisia (Senters and Soltis, 2003).
По данным проведенного RAPD-анализа наиболее обособленным от анализируемых видов Ribes является вид R. aureum (смородина золотистая, сорт Ляйсан), формирующий на дендрограмме отдельную ветвь. Аналогичным образом представители секции Symphocalyx (R. aureum и R. odoratum) присоединяются ко всем остальным исследованным образцам рода на самом дальнем расстоянии на дендрограммах, построенных по данным полиморфизма хлоропластного спейсера psbA-trnH и ETS рибосомаль-ного оперона (Schultheis and Donoghue, 2004).
Таким образом, был проведен молекулярный RAPD-анализ рода Ribes, включающего в себя представителей смородины черной, смородины красной, золотистой и кро-
ваво-красной, крыжовника, а также сорта и гибридные формы отечественной селекции. Метод RAPD-анализа выявил достаточно высокий уровень полиморфизма генома и позволил идентифицировать близкородственные сорта — представителей одной сестринской линии (сорта Кипиана, Гамма, Грация). Выявлено несколько большее родство исследованных представителей крыжовника (Eugrossularia) и черной смородины (Eucoreosma), а межподродовые чер-носмородинно-крыжовниковые гибриды Йошта и 20302961 показали сравнительно большее сходство с представителями секции черной смородины, чем с представителями секции крыжовника. В целом значения генетических различий между представителями разных подродов (подрод смородин Ribesia и подрод крыжовников Grossularia) (0,12—
0.21. не превышали различия между представителями разных секций подрода смородин (0,12—0,23). Полученные нами результаты говорят о том, что таксоны крыжовника, черной смородины и красной смородины являются таксонами одного уровня, что свидетельствуют в пользу классификаций, выделяющих их в отдельные подроды.
Авторы благодарят Голяеву О. Д. (к. б. н., селекционер красной смородины, ВНИИСПК, Орел) и Кураше-ва О. В. (к. б. н., селекционер крыжовника, ВНИИСПК, Орел) за предоставление растительного материала.
Литература
1. Еленевский А. Г. и др. 2001. Ботаника высших, или наземных растений: Учеб. для студ. высш. пед. учеб. заведений / А. Г. Еленевский, М. П. Соловьева, В. Н. Тихомиров. М.: Издательский центр «Академия», 432 с.
2. Еремин Г. В., Исачкин А. В, Казаков И. В. и др., 2004. Общая селекция и сортоведение плодовых и ягодных культур. М.: Мир, 422 с.
3. Князев С. Д., Огольцова Т. П., 2004. Селекция смородины черной на современном этапе. Орел: Изд-во Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, 238 с.
4. Самигуллина Н. С., 2006. Практикум по селекции и сортоведению плодовых и ягодных культур: Учебное издание. Мичуринск: Издательство Мичуринского государственного университета, 197 с.
5. Berger A., 1924. A taxonomic review of currants and gooseberries // NewYork Agric. Exp. Sta. Techn. Bull. Vol. 109. C. 1-118.
6. BrennanR, JorgensenL., Hackett C. et al., 2008. The development of a genetic linkage map of blackcurrant (Ribes nigrum L.) and the identification of regions associated with key fruit quality and agronomic traits // Euphytica. Vol. 161. P 19-34.
7. Brennan R. M., 2008. Currants and Gooseberries // Temperate Fruit Crop Breeding / Ed. Hancock J. F., Springer Science+Business Media. P. 177-196.
8. Coville F. V., Britton N. L., 1908. Grossulariaceae // North American Flora. Vol. 22. P. 193-225.
9. Cronquist A., 1988. The Evolution and Classification of Flowering Plants. — New York.: The New York Botanical Garden, 555 p.
10.Hummer K. E, Barney D. 2002. Currants: Comprehensive Crop Report //HortTechnology. Vol. 12. N 3. P. 377-387.
11.Janczewski E, 1907. Monograph of the currants Ribes L. // Mem. Soc. Phys. Hist. Nat. Geneve. Vol. 35. P. 199-517.
12. Keep E, 1962. Interspecific hybridization in Ribes // Genetica. Vol. 33. P. 1-23.
13.Komarov V. L, 1971. Flora of the (former) USSR. Vol. IX p. 175-208. In: Ribesioideae Engl. (Translated from the Russian by the Israel Program for Scientific Translation, Jerusalem). Keter, London.
14. Lanham P., BrennanR, Hackett C. et al., 1995. RAPD fingerprinting of blackcurrant (Ribes nigrum L.) cultivar. // Theor Appl genet. Vol. 90. P. 166-172.
15. Lanham P., Korycinska A. and Brennan R. 2000. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L. revealed by RAPD and ISSR markers // Journal of horticultural Science & Biotechnology. Vol. 75. N 4. P. 371-375.
16. Messinger W., Liston A., and Hummer K, 1999. Ribes phylogeny as indicated by restriction-site polymorphisms of PCR-amplified chloroplast DNA // Plant Systematics and Evolution. Vol. 217. P 185-195.
17. Peer Van de Y., Wachter R. D., 1994. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. Vol. 10. P. 569570.
18. Puchooa D, 2004. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchin-ensis Sonn) // African Jornal of Biotechnology. April. Vol. 3. N 4. P. 253-255.
1Ш Информация об авторах
Пикунова Анна Викторовна — младший научный сотрудник. Орловский государственный аграрный университет. 302040, г. Орел, ул. Красноармейская, д. 17. E-mail: pikuanna84@mail.ru.
Мартиросян Елена Владимировна — к. б. н., научный сотрудник. Центра «Биоинженерия» РАН.
117312, Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 1. E-mail: marty-elena@yandex.ru.
Князев Сергей Дмитриевич — доктор с.-х. наук, профессор кафедры растениеводства, Орловский государственный аграрный университет, ведущий научный сотрудник отдела ягодных культур ГНУ ВНИИСПК, Орел. Krasnoarmejsky st.,17, Orel, 302040. E-mail: ksd_61@mail.ru.
Рыжова Наталья Николаевна — кандидат биологических наук, научный сотрудник Центра «Биоинженерия» РАН. 117312, Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 1. E-mail: rynatalia@yandex.ru.
19. Rehder A., 1954. Manual of cultivated trees and shrubs. — Toronto.: MacMillan and Co. 999 pp.
20. Schultheis L. M., Donoghue M. J., 2004. Molecular phylogeny and biogeography of Ribes (Grossularia) with an emphasis of gooseberry (subg. Grossularia)// Systematic Botany. Vol. 29. N. 1. Р. 77-96.
21. Senters A. E. and Soltis D. E, 2003. Phylogenetic relationships in Ribes (Grossulariaceae) inferred from ITS sequence data // TAXON. Vol. 52. P 51-66.
22. Sinnott Q. P., 1985. A revision of Ribes L. subg. Grossularia (Mill.) per. Sect. Grossularia (Mill.) Nutt. (Grossulariaceae) in North America // Rhodora. Vol. 87. P. 189-286.
23. WeigendM., 2007. Flowering plants. Eudiocots. The Families and Genera of Vascular Plants. Vol. 9, P 168-176.
MOLECULAR ANALYSIS OF GENETIC POLYMORPHISM AND PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS IN RIBES L.
A. V. Pikunova, E. V. Martirosyan, S. D. Knyazev, N. N. Ryzhova
SUMMARY: The RAPD analysis have been used to study genome polymorphism and phylogenetic relationships in genus Ribes L. Levels of interspecific, intraspecific and intercultivars genome diversity have been evaluated. Revealed polymorphism allows the recognition of closely related cultivars. Genotype-specific RAPD fragments and also group-specific fragments have been identified. Hybrids between blackcurrant and gooseberry have shown more similarity with blackcurrant. Calculated similarity coefficients and dendrogram topology support the genus classifications that recognize equal independent taxonomic level of blackcurrant, redcurrant and gooseberry with genus Ribes L.
^ KEY WORDS: RAPD analysis; phylogeny; polymorphism; currant; gooseberry; Ribes L; molecular markers.
Pikunova A. V. — junior scientific assistant. Orel State Agrarian University (OSAU). Krasnoarmejsky st.,17, Orel, 302040. E-mail: pikuanna84@mail.ru.
Martirosyan E. V. — PhD, scientific assistant. Centre "Bioengineering".
60 let Octyabrya av. 7/1, Moscow, Russia, 117312. E-mail: marty-elena@yandex.ru.
Knyazev S. D. — PhD, professor of chair of plant breeding. Orel State Agrarian University (OSAU). Krasnoarmejsky st., 17, Orel, 302040. E-mail: ksd_61@mail.ru.
Ryzhova N. N. — PhD, scientific assistant. Centre "Bioengineering".
60 let Octyabrya av. 7/1, Moscow, Russia, 117312. E-mail: rynatalia@yandex.ru.
