CC BY
58
со
Шарышев А. А.
научный сотрудник лаборатории антигенных детерминант и синтеза пептидов, ФГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития
Шибнев В. А.
ведущий научный сотрудник лаборатории антигенных детерминант и синтеза пептидов, ФГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития
Применение метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С
Шарышев А. А., Шибнев В. А.
Целью исследования являлась разработка метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для определения антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С. Осуществлен твердофазный синтез пептидов, перекрывающих иммунореактивные участки а.о. 7-19, 2034 из ^концевой части нуклеокапсидного белка вируса гепатита С (генотип№), а так же меченых карбоксифлуорес-цеином с Оконца полипептидной цепи их производных. Изучена антигенная активность синтезированных пептидов методом поляризационного флуоресцентного иммуно-анализа (ПФИА) с 64 образцами сывороток крови больных различными формами вирусного гепатита С, в том числе с 39 образцами сывороток крови больных хроническим вирусным гепатитом С. Проведено сравнительное изучение аналитических характеристик метода ПФИА, основанного на применении синтезированных пептидов, а также коммерческой ИФА-тест-системы (БЕСТ анти-ВГС- комплект 4, ЗАО «Вектор Бест»). В результате проведенных исследований было выявлено, что предлагаемый метод обладает высоким уровнем специфичности и чувствительности. Сопоставимость результатов ПФИА и ИФА составила 76%, что свидетельствует о перспективности проведения дальнейших исследований в данной области. Показана принципиальная возможность применения метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа для определения антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в клинических образцах сывороток.
Вирусный гепатит С (ВГ С) является одним из широко распространенных заболеваний печени. Распространенность в мире хронической формы ВГ С варьирует от 0,5 до 2%. В России заболеваемость составляет 56,2 чел. на 100000 населения. У каждого пятого больного ХГ С развивается цирроз, у каждого двадцатого — рак печени. В связи с тем, что вакцины для профилактики гепатита C не существует, в настоящее время является актуальной своевременная диагностика заболевания. Лабораторная диагностика гепатита С основана на выявлении в образцах сывороток или плазмы крови человека антител к антигенам HCV (анти-HCV антител) и проводится с помощью твердофазного им-муноферментного анализа, который имеет ряд временных ограничений. В последнее время предложены экспресс-методы диагностики HCV, наиболее перспективным из которых, на наш взгляд является метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) [1].
Вирусный геном, представленный односпиральной (+) РНК, кодирует полипротеин-предшественник размером около 3000 аминокислотных остатков (а.о.), посттрансляционный процессинг которого приводит к образованию ряда структурных и неструктурных белков [2]. Нуклеокап-сидный белок HCV (HCV-core), ограниченный а.о. 1-192, является одним из наиболее консервативных [2] и имму-ногенных в составе вируса и вызывает появление в крови специфических антител уже на ранних стадиях инфекции [3,4]. Определение антител к нуклеокапсидному белку (aнти-HCV-corе-антител) лежит в основе скрининговых тестов для диагностики инфекции [4], базирующихся на ре-комбинантных и(или) синтетических антигенах [5,6]. Согласно современным данным по исследованию антигенной структуры HCV-соrе-белка, основные иммунореактивные В-эпитопы локализуются в ^концевой части [7,8,9,10].
В настоящей работе коллектив авторов начал разработку и оптиматизацию метода поляризационного флуорес-
Медицинские науки
центного иммуноанализа (ПФИА), основанного на взаимодействии флуоресцентно-меченных, иммунореактивных В-эпитопов со специфическими анти-HCV антителами. Исследование проведено с целью поиска флуоресцентно-меченных пептидных последовательностей, наиболее полно отражающих антигенную структуру нуклеокапсидного белка и как следствие наиболее перспективных для использования в диагностике НС^-инфекции.
Материалы и методы
Серологический материал был представлен образцами крови, направленными для тестирования на наличие маркеров НСУ-инфекции в Научно-исследовательский институт скорой помощи им.Н.В Склифосовского. Подтверждающий тест (БЕСТ анти-ВГС- комплект 4, ЗАО «Вектор Бест») на наличие в сыворотках образцов крови amrc-HCV-core-антител проводили согласно рекомендованному фирмой-производителем протоколу.
Аминокислотные последовательности синтетических пептидов соответствовали нуклеотидной последовательности генома изолята HCV (субтип 1b), определенной в результате анализа кДНК клонов из образцов плазмы крови японских пациентов с хроническим гепатитом [11] (табл.1). Последовательности для синтеза были выбраны на основе ранее полученных результатов и данных литературы [7,8,9,10,11].
Синтез пептидов осуществляли твердофазным методом путем наращивания пептидной цепи с N-конца не тефлоне с радиационно-привитым полистиролом по Boc/Вzl-стратегии. В синтезе были использованы Вос-аминокислоты и их производные («Reanal», Венгрия), имеющие L-конфигурацию. Полноту прохождения реакций на носителе проверяли с помощью нингидринового теста. Синтез проводили в ручном режиме методами активированных эфиров и симметричных ангидридов, используя стандартны протокол проведения синтетического цикла, блокирования не прореагировавших аминогрупп и отщепления пептидов от полимера [12].Присоединение карбок-сифлуоресцеина проводили по карбодиимидной методике. Обессоливание и удаление низкомолекулярных продуктов пептидной природы проводили методом гель-фильтрации на сефадексах G-10, G-15 или G-15 в 10% уксусной кислоте. Пептиды очищали полупрепаративной обращенно-фа-зовой ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Du Pont» (США). Индивидуальность пептидов подтверждали в ходе проведения аналитической ВЭЖХ и данными количественного аминокислотного анализа.
Флуоресцентно меченые пептиды оттестированы им-муноферментным методом, который показал, что введение флуоресцентной метки не влияет на иммуногенные свойства синтезированных пептидов. Иммуноферментный анализ проводили по стандартному протоколу [12].
Методика проведения поляризационного флуоресцентного иммуноанализа
В боросиликатную кювету добавляли 1000 мкл фосфатного буфера (PBS, рН 7,4) с добавлением лаурилсульфата лития в концентрации 0.5% и 0.1г/л бычьего гамма глобулина, содержащего флуоресцентно меченый пептид в концентрации при которой интенсивность флуоресценции раствора составляет 1000 у.е. Сыворотки вносили таким образом чтобы итоговое разведение составляло 1/100 [13].
Всероссийский журнал научных публикаций № 1(11) 2012
Для измерения поляризации флуоресценции использовали TDx- анализатор фирмы «ABBOT».
Границы «серой зоны» и «cut off» рассчитывали отдельно для каждого пептида, прибавляя к среднему арифметическому сигналу в кюветах с 20-ю стандартными отрицательными сыворотками («отрицательными контролями») два стандартных арифметических отклонения, рассчитанных для данной выборки соответственно.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности
синтезированных пептидов
Пептид Аминокислотная последовательность* Район белка, a.o.
1 RPQDVKFPGG 18-27
2 FAM-RPQDVKFPGG 18-27
3 RPQDVKFPGGGQIVGGV 18-34
4 FAM-RPQDVKFPGGGQIVGGV 18-34
Таблица 2. Выявление HCV положительных сывороток синтетическими пептидами в ПФИА тест системе
№ Оптическая плотность в иммуноферментной системе Вектор-Бест спектр Величина mP. Разведение сыворотки 1/100
Анти-Core Анти-NS Пептид №2 Пептид №4
1 3,4 2,2 110 144
2 3,3 3,3 127 172
3 3,5 3,3 90 106
4 3,5 3,3 80 118
5 3,4 3,2 120 130
6 3,3 3,2 80 98
7 3,3 2,7 102 129
8 3,4 3,0 80 99
9 3,3 3,3 109 137
10 3,4 3,4 113 142
11 3,6 3,2 117 142
12 3,4 3,0 130 159
13 3,3 3,3 90 114
14 3,4 3,4 83 113
15 3,3 3,0 79 98
16 3,5 3,5 125 158
17 3,0 3,2 87 95
18 3,3 3,2 76 96
19 3,6 3,3 85 107
20 3,7 3,8 106 134
21 3,6 3,8 124 154
22 3,7 3,8 76 91
23 3,6 3,9 104 130
24 1,0 2,1 113 143
25 3,6 3,7 76 96
26 2,0 0,8 100 126
27 3,5 3,0 115 142
28 2,9 - 86 108
29 3,5 3,5 140 173
30 3,2 3,2 70 80
31 3,5 3,6 110 138
32 3,5 3,6 76 95
33 3,3 3,5 82 103
34 3,4 3,0 128 161
35 3,0 0,7 125 158
36 3,3 3,3 85 113
37 3,5 3,4 113 142
38 3,2 3,2 128 162
Результаты и обсуждение
По совокупности проведенных вирусологических лабораторных исследований у всех 38 пациентов был установлен диагноз вирусного гепатита С.
В табл. 1 представлены аминокислотные последовательности пептидов 1-4. Первичная структура синтезированных пептидов соответствует последовательности изолята HCV-J, относящегося к генотипу 1Ь [11], наиболее распространенному на территории РФ [14]. Известно, что
13
^концевая часть нуклеокапсидного белка наиболее консервативна, и отдельные аминокислотные замены в зависимости от типа или субтипа HCV существенно не влияют на его антигенную активность, что обуславливает универсальность разрабатываемой диагностической тест системы, основанной на выявлении.
Иммунореактивность полученных пептидов была исследована методом прямого поляризационного флуоресцентного иммуноанализа по их взаимодействию с анти-НС^позитивными сыворотками больных гепатитом С.
В табл. 2 представлены сравнительные результаты оптических плотностей в коммерческой ИФА-тест-системы (БЕСТ анти-ВГС- комплект 4, ЗАО «Вектор Бест») и результаты в взаимодействия флуоресцентно меченых пептидов в исследуемых клинических образцах.
Положительными образцами в ПФИА тест системе основанной на пептиде 2 считались те сыворотки, в которых значение мили-поляризации превышало 88 mP, а в ПФИА тест системе основанной на пептиде 4 превышающие 100 mP.
Как видно из таблицы 2 пептид 4 демонстрировал наибольший процент выявления антител в aнти-HCV-corе позитивных сыворотках 76%.
Пептид 2 демонстрировал процент выявления антител в aнти-HCV-corе позитивных сыворотках на уровне 55%.
Большая иммуногенность пептида 4 и больший процент выявления им положительных образцов обусловлена наличием дополнительного В-эпитопа по сравнению с пептидом 2 [12], не смотря на то, что пептид 4 обладал большим не специфическим взаимодействием с 20-ю отрицательными контролями.
Таким образом, в настоящей работе с помощью флуоресцентно меченых синтетических пептидов показана принципиальная возможность применения метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для определения антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в клинических образцах сывороток. Так же показана сопоставимость результатов ПФИА и ИФА около 76%, что свидетельствует о перспективности проведения дальнейших исследований в данной области.
Список использованных источников
1. Westerfeld J.G. Detection trends in high throughput screening. // Anal. Bioanal. Chem. 2002. V. 372. Р. 43-45.
2. Houghton M., Weiner A., Han J. et al. Molecular biology of the hepatitis С viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease // Hepatology. - 1991. - Vol. 14. - P. 381-388.
3. Chiba J., Ohba H., Matsuura Y. et al. Serodiagnosis of hepatitis С virus (HCV) infection with an HCV core protein molecularly expressed by a recombinant baculovoirus // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1991. - Vol. 88. - P. 4641-4645.
4. Hosein B., Fang С. Т., Popovsky M. A. et al. Improved serodiagnosis of hepatitis С virus infection with synthetic peptide antigen from capsid protein // Proc. Natl. Acad. Sci. -1991. - Vol. 88. - P. 3647-3651.
5. Katayama Т., Mazda Т., Kikuchi S. et al. Improved serodiagnosis of non-A, non-B hepatitis by an assay detecting antibody to hepatitis С virus core antigen // Hepatology. - 1992. - Vol. 15. - P. 391-394.
6. Zaaijer H. L., Vrielink H., van Exel-Oehlers P. J. et al. Confirmation of hepatitis С infection: a comparison of five immunoblot assays // Transfusion. - 1994. - Vol. 34. - P. 603607.
7. Ferroni P., Mascolo G., Zaninetti M. et al. Identification of four epitopes in hepatitis С virus core protein // J. Clin. Microbiol. -1993. - Vol. 31. - P. 1586-1591.
8. Goeser Т., Muller H. M., Ye J. et al. Characterization of antigenic determinants in the core antigen of the hepatitis С virus // Virology. - 1994. - Vol. 205. - P. 462-469.
9. Nasoff M. S., ZebedeeS. L., Inchauspe G. et al. Identification of an immunodominant epitope within the capsid protein of hepatitis С virus // Ibid. -1991.-Vol. 88.-P. 5462-5466.
10. Sallberg M., Pumpen P., Zhang Z. X. et al. Locations of antibody binding sites within conserved regions of the hepatitis С virus core protein // J. Med. Virol. - 1994. - Vol. 43. - P. 62-68.
11. Kato N., Hijikata M., Ootsuyama Y. et al. Molecular cloning of the human hepatitis С virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1990. - Vol.
87. - P. 9524-9528.
12. Семилетов Ю. А., Фирсова Т. В., Шибнев В. А. и др. Синтез и антигенная активность пептидов из состава core- и NS3-белков вируса гепатита С // Биоорган. химия.- 1993. - Т. 19. - С. 126-129.
13. 13.Ramirez-Pfeiffer C., Diaz-Aparicio E., Gomez-Flores R. et al. Use of the Brucella melitensis Native Hapten To Diagnose Brucellosis in Goats by a Rapid, Simple, and Specific Fluorescence Polarization Assay// Clin. and Vac. Immun. June -2008- ,p. 911-915.
14. Львов Д. К., Миширо С., Селиванов Н. А. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях северо-западной и центральной частей России // Вопр. вирусол. - 1995. -N6. - С. 251-253.
