CC BY
93
ФАРМАЦИЯ
УДК 615.074
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА 0БРАЩЕНН0-ФА30В0Й ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ТАУРИНА, КАРНОЗИНА И ГЛУТАТИОНА
В статье изложены результаты, полученные в ходе разработки высокоэффективной жидкостной хроматографии-методики разделения смеси и идентификации соединений аминокислотной природы. Приведена подробная методика получения ДНФ-производных исследуемых веществ, условия их хроматографирования. Полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной методики для разделения смеси и идентификации таурина, карнозина и глутатиона.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, таурин, карнозин, глутатион восстановленный, идентификация, разделение.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), интенсивно развиваясь несколько последних десятилетий, зарекомендовала себя в качестве одного из самых универсальных методов разделения и фармакопейного анализа субстанций и лекарственных средств [1].
Метод ВЭЖХ применим для разделения значительно более широкого круга веществ, чем газовая хроматография, поскольку большая часть веществ не обладает летучестью, а многие биологически активные вещества неустойчивы при высоких температурах [2].
Целью настоящей работы явилась разработка ВЭЖХ-методики разделения смеси таурина, карнозина и глутатиона восстановленного.
Из всех вариантов ВЭЖХ, обращенно-фазовый применяется в настоящее время наиболее широко. Его привлекательность определяется методической простотой и универсальностью, во многих случаях - простотой механизма сорбции и предсказуемостью поведения веществ на основании их строения [3].
Объектами исследования послужили стандартные образцы таурина, карнозина и глутатиона восстановленного, являющиеся веществами аминокислотной природы.
Основными проблемами при анализе аминокислот и пептидов являются большие различия в их полярности, так как боковые группы некоторых из них заряжены в широком диапазоне значений рН, а так же низкие коэффициенты поглощения света в УФ-области [4]. Во избежание этих трудностей проводят пред- или послеколоночную дериватизацию, получая производные, пригодные для спектрофотометрического детектирования, более гидрофобные, чем исходные соединения. Однако, послеколоноч-
МАКаликова1 ДА Фадеева1 ААЗинченко2 Е.Т.Юилякова1 0.0. Новиков1
1) Белгородский
государственный
университет
Украинский фармакопейный центр качества лекарственных средств
e-mail: khalikova@bsu.edu.ru
ная дериватизация неудобна тем, что требует дополнительного нестандартного оборудования, вызывающего искажение хроматографических пиков.
Учитывая вышеизложенное, нами выбран оптимальный способ обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентным элюированием и предколоночной дериватизацией компонентов смеси 1-фтор-2,4-динитробензолом (ДНФ).
Пробоподготовка и ход анализа. Получение ДНФ-производных стандартных образцов (СО) компонентов смеси проводили следующим образом.
Около 0,1 г (точная навеска) СО таурина, 0,1 г (точная навеска) СО карнозина и 0,125 г СО глутатиона восстановленного помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 40 мл 0,05 М раствора натрия тетрабората, перемешивали до полного растворения веществ, доводили объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивали. 5,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 25 мл 0,05 М раствора натрия тетрабората, 2,0 мл 10 % раствора 1-фтор-2,4-динитробензола в диоксане, выдерживали в течение 40 мин при температуре 40 °С, затем охлаждали в темном месте до комнатной температуры. Объем полученного раствора доводили до метки 50%-ным метанолом, перемешивали и фильтровали через фторопластовый фильтр с размером пор не более 0,5 мкм.
Смесь ДНФ-производных исследуемых компонентов получали аналогичным способом.
Условия хроматографирования. Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе ЬС - 20 ЛБ, Shimadzu (Япония) методом обращено-фазной ВЭЖХ на колонке КергоБЙ-Риг С18-Л0 150? 4 мм, с зернистостью сорбента 5 мкм в режиме термостатирования при 40°С. Полное время проведения анализа - 30 минут.
Градиентное элюирование осуществляется смешиванием двух элюентов:
- подвижная фаза «А» - 8,5% раствор метанола в фосфатном буферном растворе (доведенная до рН 2,0 кислотой ортофосфорной);
- подвижная фаза «В» - 85% раствор метанола в фосфатном буферном растворе (доведенная до рН 2,0 кислотой ортофосфорной).
Программа градиента представлена на рис. 1.
о <*—г *-»
П 7 Л F. R 1(1 17 N lfi IK Л Ji iR SD
jHi±J[U jra, r.Llll I
Рис. 1. Программа градиента по подвижной фазе «В»
Объем вводимой пробы - 5 мкл, скорость потока подвижной фазы 0,75 мл/мин. УФ-детектирование осуществляли при длине волны 375 нм (вольфрамовая лампа).
Хроматографирование проводили не менее 3 раз, по мере выполнения требований к пригодности хроматографической системы.
Идентификацию веществ проводили путем сравнения времени удерживания пиков, то есть время удерживания пиков ДНФ-производных таурина, карнозина и глутатиона в исследуемой смеси должны совпадать со временем удерживания пиков на хроматограмме ДНФ-производных стандартных образцов таурина, карнозина и глутатиона.
Результаты исследования. В результате эксперимента были получены хро-матограммы 1-фтор-2,4-динитробензола, ДНФ-производных СО карнозина, таурина, глутатиона восстановленного и их смеси (рис. 2).
-1 - 2 -3 -4
14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 min
Рис. 2. Хроматограммы исследуемых образцов. 1 - хроматограмма смеси исследуемых компонентов; 2 - хроматограмма ДНФ-производного карнозина; 3 - хроматограмма ДНФ-производного таурина; 4 - хроматограмма ДНФ-производного глутатиона восстановленного
Для реагента - 1-фтор-2,4-динитробензола - при данных условиях хроматогра-фирования характерно наличие двух пиков со временами удерживания 16,3 и 16,6 минут. На хроматограммах дериватов таурина, карнозина и глутатиона также наблюдаются аналогичные пики избытка реагента.
При дериватизации карнозина образуются два производных со временами удерживания 13,8 мин. и 20,1 мин. Время удерживания ДНФ-производного таурина составило 14,3 мин. ДНФ-производному глутатиона восстановленного соответствует пик со временем удерживания 20,5 мин.
На полученных хроматограммах пики производных СО карнозина, таурина и глутатиона совпадают с таковыми на хроматограмме исследуемой смеси. В связи с чем, можно сделать вывод о пригодности разработанной методики для разделения смеси исследуемых компонентов и их идентификации.
Таким образом, разработанная методика является воспроизводимой и может быть рекомендована для качественного анализа и дальнейшей разработки количественного определения таурина, карнозина и глутатиона при их совместном присутствии в различных лекарственных формах.
Работа выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 гг., Государственный контракт № П217 от 23 апреля 2010 г.
Литература
1. Барам, Г.И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе / Г.И. Барам, Д.В. Рейхарт, Е.Д. Гольдберг, Б.Н. Изотов, М.О. Родинко,
B.А. Хазанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т.135. - №1. -
C. 75-79.
2. Шаповалова, Е. Н. Хроматографические методы анализа: метод, пособие для спец. курса / E.H. Шаповалова, A.B. Пирогов ; под общ. ред. E.H. Шаповаловой. - М.: Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова, 2007. - 109 с.
3. Буланова, А. В. Хроматография в медицине и биологии: учебное пособие / A.B. Буланова, Ю.Л. Полякова; Федер. агенство по образованию. - 2-е изд. - Самара: Изд-во «Самарский университет», 2006. - 116 с.
4. Бойченко, А. П. Алифатические карбоновые кислоты как новые модификаторы для разделения 2,4-динитрофенильных производных аминокислот методом мицеллярной жидкостной хроматографии / А.П. Бойченко, А. Ю. Куликов, Л. П. Логинова // Вестник Харьковского национального университета. Серия: Химия. - 2006. - №731. - Вып. 14(37). - С. 101-111.
APPLICATION OF THE METHOD OF REVERSED-PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY TO SEPARATE MIXTURES AND IDENTIFICATION OF TAURINE, CARNOSINE AND GLUTATHIONE
MAKhaNkova1
DAFadeeva1
AAZinchenko2
E.T.Zhilyakova1
O.O.Novikov1
1)Belgorod State University
2)Ukrainian Center Pharmacopoeian quality of drugs, Kharkov
The article presents the results of HPLC separation method to identify compounds and mixtures of amino acids nature. Provides a detailed procedure for obtaining DNP-derivatives of he substances and the conditions of chromatog-raphy. The results indicate the suitability of the developed method for separating mixtures and identification of taurine, carnosine and glutathione.
Key words: HPLC, taurine, carnosine, glutathione, identification, separation.
e-mail: khalikova@bsu.edu.ru
