CC BY
111
31/2002
Вестник Ставропольского государственного университета
ХититаиЕ шин
ПРИМЕНЕНИЕ ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ
С.Ф. Андрусенко
DISK-ELECTROPHORESIS APPLICATION IN POLYACRYLAMIDE GEL FOR LACTIC ALBUMEN STUDY
Andrusenko S
The paper views the data on electrophoretic fractionating of lactic albumen. As the result of electrophoretic mobility research certain albumen fractions of goat milk were identified; of total mass of lactic serum and goat milk casein albumen fractions is determined; the possibility to determine the " authenticity" of goat milk using electrophoretic methods is established.
В статье изложен материал по элентрофоретичесному фракционированию молочных белнов. В результате исследований элентрофоретичесной подвижности идентифицированы/ отдельные белновые франции молона ноз; определена массовая доля белновых франций молочной сыворот-ни и назеинов молона ноз; установлена возможность определения на «подлинность» нозьего молона с использованием методов элентрофореза.
УДК 637.04
Решение социальных проблем, сохранение и укрепление здоровья населения РФ на основе применения экологически и биологически безопасных продуктов, развитие и внедрение конкурентоспособных наукоемких техники и технологий возможно только при наличии современной и объективной информации. Ранее проводились исследования химического состава козьего молока (Петрова М.А. 1952; Баранова М.Г., 1998; Конь И.3. 2000 и др.), однако нет данных о фракционном составе.
В мировой практике четко прослеживается тенденция замены коровьего молока на козье при производстве продуктов детского и лечебного питания. В Российской Федерации промышленная переработка козьего молока практически отсутствует, что объясняется отсутствием необходимой научной информации для переработчиков.
Таким образом, обобщение разрозненной информации по биохимии и биотехнологии козьего молока является необходимым в современных условиях, что позволит расширить использование его биологически активных компонентов в пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства.
К сожалению, не всегда есть возможность кормить ребенка материнским молоком. В результате замены женского молока коровьим нередко у детей возникает аллергия. Примерно 7,5% всех рожденных детей имеют повышенную аллергическую чувствительность к коровьему молоку [15, 19],
Андрусенко С.'
«Применение диск-электрофореза в полиакриламидном геле...»
известную как аллергия коровьего молока (АКМ). Для некоторых взрослых людей также характерна непереносимость коровьего молока, но из них 99 % нормально переносят козье молоко, между тем как на замену коровьего молока соевым белком 20 % детей испытывают непереносимость соевых белков [17].
В результате, возрастает интерес к альтернативным источникам молока, что увеличивает процент потребности козьего молока и изделий из него [1].
Аллергия связана со скоростью и эффективностью процесса переваривания и поглощения протеинов. Размер белков козьего молока меньше, чем коровьего, что приводит к более быстрому и полному распаду белков под действием пищеварительных ферментов человека [13]. В процессе переваривания казеин козьего молока формирует менее жесткий и более мягкий сгусток, чем казеин коровьего молока, таким образом возрастает доступность действия протеоли-тических ферментов [16]. Аллергия к казеину коровьего молока составляет 51 %, к р-лактоглобулину до 80 %, к иммуноглобулинам 27 %, к а-лактальбумину - 21 %, к сывороточному альбумину -18 % [21].
Сравнительный состав содержания казеиновых белков в различных видах молока приведен в таблице [4, 5, 6, 10, 11, 18].
Содержание белков в молоке различных видов
Таблица
Основное различие между белками козьего и коровьего молока - в содержании
фракции казеина а81, присутствующей в коровьем молоке в гораздо большем количестве, чем в козьем [12]. Это положение является определяющим в процессе коагуляции молока. Качество творога из козьего и коровьего молока различно по размеру хлопьев после ферментативного свертывания. В коровьем молоке 515-200 е (в среднем 570 е) [14], в козьем 510-570 е (в среднем 536 е) [22]. При этом электрофоретическим анализом белков женского молока удается выделить 5 фракций, белков коровьего молока -3, реже - 4 фракции [20]. Методом свободного электрофореза показано, что белки сыворотки молока различных видов животных имеют свои отличительные особенности. Соотношение белковых фракций, в том числе и у коз в течение лактации, является не постоянным.
Ступницкий Р.М., Ильиченко М.Д. (1967) методом электрофореза выявили некоторые различия в белках коровьего и козьего молока. После исследований р-лактоглобулина от отдельных животных методом зонального электрофореза в верона-ловом буфере стало очевидным наличие генетического полиморфизма этой фракции белка у коз. Методом зонного электрофореза на бумаге и в крахмальном геле не удалось обнаружить генетического полиморфизма козьего Р-лактоглобулина, который представляет малоподвижную фракцию по направлению к аноду. Эти авторы не обсуждали вопроса о соотношении белковых фракций и не приводят данных по электрохимической подвижности отдельных белков сыворотки молока. По вопросу электрофорети-ческого фракционирования казеинов козьего молока данные отсутствуют.
Проведение электрофоретического анализа проводилось по следующей схеме В.В. Зарубина, апробированной автором в НОЦ «Технологии живых систем» СГУ.
На первой стадии проводили фракционирование обезжиренного козьего молока (кислотный и нативный казеин козьего молока; кислотная и нативная сыворотка козьего молока; альбумины, глобулины и протеозо-пептозы козьего молока и женское
Компонент Молоко
женское козье коровье
Белок(%) 1,32 3,8 3,21
Казеина, % к общему белку 33 75 85
I Казеин (%) 0,46 2,84 2,52
а1-казеин (%) 0,04 0,4 1,37
а2-казеин (%) - 1,3 0,26
Р-казеин (%) 0,3 2,3 0,93
к-казеин (%) 0,12 0,14 0,37
у-казеин (%) - - 0,12
31/2002 ЯШ
Вестник Cтавропольского государственного университета
]-j-Я-! ■ IV I
Рис. 1. Электрофореграмма с денсито-граммой белков казеина козьего молока
молоко). Для экстракции спиртораствори-мых примесей полученные осадки фракций растирали стеклянной палочкой в 96° этиловом спирте, равном количеству пробы, взятой для исследования [3].
За основу нами была взята система полиакриламидного геля (ПААГ), предложенная Г. Маурером (1971). Концентрирующий гель содержал в конечных концентрациях 2,5% акриламида (А) и 0,6% ^Ш-метилен-бисакриламида (МБА), приготовленных на 0,125М трис-НС1 буфере (рН 6,7). Время полимеризации геля при использовании N,N,N^N1 - тетраметилэтилендиа-мина (ТЕМЕД) и персульфата аммония (ПСА) составляло 12-15 минут. Разделяющий гель содержал в конечных концентрациях 7,5 % акриламида и 0,2 % МБА, приготовленных на 0,375М трис-НС1 буфере (рН 8,9). Полимеризацию проводили также с использованием ТЕМЕД и ПСА в течение 4045 минут. В качестве электродного буфера использовали раствор, содержащий 0,025М трис и 0,192М глицин (рН 8,3).
Исследуемый раствор белка смешивали с равным объемом раствора, содержащего 0,002 % бромфенолового синего (свиде-
тель процесса) и 70,0 % сахарозы, приготовленных на 0Д25М трис-HCl буфере (рН 6,7), после чего образцы наносили на колонки с гелем, исходя из расчета 0,1 мг (100мкг) белка на одну трубку.
Электрофорез проводили с использованием источника тока фирмы «Pharmacia» (Швеция) в режиме стабилизации тока из расчета 3 ма на одну колонку с ПААГ в течение 30 минут и далее из расчета 6 ма на колонку вплоть до окончания процесса (в сумме - 2 часа 50 минут). После окончания фракционирования колонки с белковыми фракциями погружали на 12-14 часов в раствор 50 % ТХУ, после чего окрашивали белок в течение 1 часа при 37°C в 0,1 % растворе кумасси бриллиантового голубого R-250, приготовленного на 50 % ТХУ. Отмывание не связавшегося с белком красителя проводили 10 % уксусной кислотой в течение 7-10 суток.
Все реактивы были дополнительно очищены перекристаллизацией или перегонкой [8].
Анализ протеинограмм изучаемых образцов проводили по относительной элек-трофоретической подвижности белковых фракций, определяемой по формуле
где Rf - относительная электрофоретиче-
ская подвижность фракции;
Ln - длина пути, пройденного фракцией п в мм;
L - длина пути, пройденного индикатором (свидетелем) в мм.
Количественный анализ протеинограмм изучаемых препаратов проводили с помощью сканирования электрофореграмм на лазерном компьютерном денситометре (Lazer Computer Densitometer, модель 2202, ЛКБ, Швеция).
В результате исследований белков обнаружено, что электрофоретическая картина белков молока коз в полиакриламидном геле отличается от коровьего молока. В частности, это относится к Р-лактоглобулиновой и а-лактальбуминовой фракциям. На рисунках 1 и 2 представлены электрофореграммы с
Андрусенко С
«Применение диск-электрофореза в полиакриламидном геле...»
денситограммами казеина и сывороточных белков козьего молока.
Пик 1, считая от катода, был определен нами в обоих электрофореграммах как низкомолекулярный пептид, обнаруженный и в женском молоке в соотношении 18,39 % и 19,52 % соответственно. Данная фракция предположительно идентифицирована как лизоцим. Таким образом, можно объяснить ранозаживляющий эффект козьего молока наличием именно этой фракции.
Пики 3, 5, 6, 7, и 9, считая от катода, на электрофореграмме казеина козьего молока были идентифицирована как к - казеин, в - казеин, у - казеин , а2 - казеин, а1-казеин соответственно. Пики 2, 4 и 8 предположительно относятся к не идентифицированным промежуточным фракциям. Распределение фракций казеина козьего молока было следующим (в %): а1- казеин - 12,7 ±0,9; а2 - казеин - 42,4 ±1,3; в - казеин -38,5±1,1; у - казеин - 3,4±0,2; к - казеин -6,8±0,8.
Пики 2, 3, 4, 5, 6 и 7, считая от катода, на электрофореграмме сывороточных белков козьего молока были идентифицированы
1-П-г
Рис. 2. Электрофореграмма с денсито-граммой сывороточных белков козьего молока
как сывороточный альбумин, а-лактальбумин, ß-лактоглобулин, псевдоглобулин и эвглобулин соответственно. Большая часть всех сывороточных белков молока по электроподвижности относится к а-лактальбуминовой фракции. Соотношение белковых фракций сыворотки молока коз составляет (в %): сывороточный альбумин
— 6,6 ±0,4; а-лактоглобулин - 18,3±0,8; ß-лактоглобумин 53,2±1,5 и иммунные глобулины - 14,8±0,3. Основным сывороточным белком коровьего молока является ß-лактоглобулин, а козьего а-лактоальбумин.
Таким образом, была установлена электрофоретическая подвижность белков козьего молока; определено процентное соотношение белковых фракций сыворотки молока и казеина; обнаружены ранее не идентифицированные фракции; установлена возможность определять подлинность козьего молока путем проведения электрофореза по методу В.В. Зарубина.
Анализ литературных источников и данные собственных исследований по биохимическому составу козьего молока подтвердили его большую близость к женскому молоку в сравнении с коровьим, что дает основание к более широкому использованию козьего молока в продуктах детского питания. В НОЦ «Технологии живых систем» разработана биологически активная добавка к пище на основе смеси коровьего и козьего молока, рекомендуемая в качестве использования заменителя материнского молока.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ado А.Д. Общая аллергология. -М.:Медици-на, 1978. -426 с.
2. Баранова М.Г., Осташевская Д.М., Красникова М.В. Химический состав кисломолочных продуктов из козьего молока // Молочная промышленность. - 1998. -74. - С. 25-26.
3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкий Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. -М.: Мир, 1982.-446 с.
4. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. -М.,1984. - 344 с.
5. Давидов Р.Б. Молоко и молочное дело. - М.: Колос, 1973. - 256 с.
6. Исаченко Л. Козье молоко // Наука и жизнь.
- 1981. -77. - С. 122-123.
31/2002
Вестник Ставропольского государственного университета
7. Конь И.Я. Искусство вскармливания детей первого года жизни: современные представления и проблемы // Российский педиатрический журнал. - 1999. - №2. - С. 45-48.
8. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. /E.Д. Левина. -М.: Мир, 1971. - 248 с.
9. Петрова М.А., Махкамов Г.М. О козьем молоке. - Ташкент, 1952. - 104 с.
10. Студенкин М.Я., Ладодо К.С. Питание детей раннего возраста. - Л.: Наука, 1991. - 207 с.
11. Тёпел А. Химия и физика молока. - М.: Пищевая промышленность, 1979. - 622 с.
12. Desjeux J.F. Nutritional value of goat milk. Reunion de Surgeres // Le Lait. - 1993. - V. 73. - P. 573-580.
13. Eastham E.J., Walker W.A. Adverse effects of milk formula ingestion on the gastrointestinal tract: An update // Gastroenterology. - 1979. - V. 76. - P. 365-374.
14. Eastham E.J., Walker W.A. Effect of cow's milk on the gastrointestinal tract: A persistent dilemma for the pediatrician // Pediatrics. - 1977. -V. 60. -P. 477-481.
15. Fontaine J., Navarro. J. Small intestine biopsy in cow milk protein allergy // Arch. Dis. Child. -1975. - V. 50. -P. 357-360.
16. Gamble J.A., Ellis N.R., Besley A.K. Composition properties of goat's milk as compared with cow's milk // US Dept. Agric. Tech. Bull. - 1939. -V. 671. - P. 1-72.
17. Halpla T.C., Byrne W.J., Ameat M.E. Colitis persistent diarrhea and soy protein intolerance // J. Pediatr. - 1977. - V. 97. -P. 404-407.
18. John R., Maxine L., Plummer P. Determination of immunoglobulins in caprine colostrum replacers //Dairy Goat J, 1990. - V. 68. -N. 4.-P. 8-9.
19. Juntunen K., Ali-Yrkko, S., Goat's milk for children allergic to cow's milk // Kiel. Milchwirt. For-schungsber. - 1983. - V. 35. - P. 439-40.
20. Molina E., Martin-alvarez P., Ramos M. Analysis of cow's, ewe's and goat's milk mixtures by capillary electrophoresis: quantification by multivariate regression analysis intern // Dairy J. - 1999. -V. 9. -N2.-P. 99-105.
21. Pahud J., Monti J., JostR. Allergenicity of whey proteins. Its modification by tryptic in-vitro hydrolysis of the protein // J. Prediat. Gastroenterol. -1985. -N. 4. -P. 408-413.
22. Wymazala S., Roborzynski M., Kowalski Z. Koza cennym producentem mleka: uzytkowanie mleczne oraz wlasciwosci fiziko-chemiczne i odzywcze mleca koziego // Biul. Inform. Inst. zo-otechn. zacl. inform. - Kracow, 1984. - V. 4. - P. 143-144.
Об авторе
Андрусенко Светлана Федоровна, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры биохимии. Автор 2 патентов на изобретение, лауреат II Международного салона инвестиций и инноваций, обладатель золотой медали за разработки в области биотехнологии, автор 12 научных публикаций, разработчик 7 пакетов нормативно-технической документации. Область научных интересов: биотехнология получения и применения биологически активных веществ.
