CC BY
41
ПРИМЕНЕНИЕ БИОГЕННЫХ СТИМУЛЯТОРОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПАТОЛОГИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ НА МОДЕЛИ СЕРОТОНИНОВОГО ПОРАЖЕНИЯ СЕМЕННИКОВ
Бречка Наталья Михайловна
канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории фармакологии, Государственное Учреждение «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского Национальной Академии Медицинских Наук Украины»,
Украина, г. Харьков E-mail: natalia ipep@mail. ru Стрельников Леонид Семенович профессор, д-р фарм. наук, заведующий кафедрой биотехнологии, Национальный фармацевтический университет, Украина, г. Харьков
E-mail: biotech ukrfa@mail. ru Малова Наталья Георгиевна д-р биол. наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией фармакологии, Государственное Учреждение «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского Национальной Академии
Медицинских Наук Украины», Украина, г. Харьков
Калюжная Ольга Сергеевна канд. фарм. наук, ассистент кафедры биотехнологии, Национальный фармацевтический университет, Украина, г. Харьков
E-mail: olga-kalyuzhnaya@mail. ru Стрилец Оксана Петровна канд. фарм. наук, доцент кафедры биотехнологии, Национальный фармацевтический университет, Украина, г. Харьков
E-mail: biotech ukrfa@mail. ru Невзоров Вячеслав Павлович старший научный сотрудник, кандидат биологический наук, старший научный сотрудник лаборатории патоморфологии, Государственное Учреждение «Институт общей и неотложной хирургии Национальной Академии
Медицинских Наук Украины», Украина, г. Харьков
APPLICATION OF BIOGENIC STIMULANT FOR CORRECTION OF REPRODUCTIVE TRACT PATHOLOGY BY MODEL OF SEROTONINE
LESION OF TESTIS
Natalya Brechka
candidate of Science in Biology, Senior Staff Scientist of the Pharmacology Laboratory, State Institution "V. Danilevsky Institute of Endocrine Pathology Problems of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine ", Ukraine,
Kharkov Leoinid Strelnikov
professor, Doctor of Science in Pharmacy, Head of the Department of Biotechnology,
National University of Pharmacy, Ukraine, Kharkov
Natalya Malova
doctor of Science in Biology, Senior StaffSscientist, Head of the Pharmacology Laboratory, State Institution " V. Danilevsky Institute of Endocrine Pathology Problems of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine ", Ukraine,
Kharkov Olga Kalyuzhnaya
candidate of Science in Pharmacy, Assistant of the Department of Biotechnology,
National University of Pharmacy, Ukraine, Kharkov
Oksana Strilets
candidate of Science in Pharmacy, Associate Professor of the Department of Biotechnology, National University of Pharmacy, Ukraine, Kharkov
Vyacheslav Nevzorov
senior Staff Scientist, Candidate of Science in Biology, Senior Staff Scientist of the Pathomorphology Laboratory, State Institution "Institute of General and Emergency Surgery of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine ", Ukraine, Kharkov
АННОТАЦИЯ
Представлены результаты по исследованию сперматогенной функции семенников, а также ультраструктурных изменений органелл клеток Сертоли и Лейдига, подверженных влиянию серотонина гидрохлорида и введению препарата «Биоглобин-У». Препарат «Биоглобин-У» на фоне серотонина гидрохлорида повышает активность репаративных и синтетических реакций, снижает степень митохондриальной дисфункции и катаболических процессов, а также активирует метаболизм клеток Лейдига, и значительно снижает количество очагов деструкции мембран эндоплазматического ретикулума, мембран ядра и митохондрий.
ABSTRACT
The results of study of ultrastructural changes in the Sertoli cells and Leydig's cells organelles after destructive influence of the serotonin hydrochloride and under influence "Bioglobin-U" have been presented. "Bioglobin-U" increases the activity and reparative synthetic reactions, reduced the degree of mitochondrial dysfunction and catabolic processes and activate the Leydig cell metabolism, and significantly reduces the number of foci destruction membranes of the endoplasmic reticulum, mitochondrial, and membranes of nucleus on the background of serotonin hydrochloride.
Ключевые слова: ультраструктура клеток Сертоли и Лейдига; серотонина гидрохлорид; митохондриальная дисфункция; «Биоглобин-У».
Keywords: ultrastructure of Sertoli's cells and Leydig's cells; serotonin hydrochloride; mitochondrial dysfunction; "Bioglobin-U".
В последнее время фикфируется ухудшение репродуктивного здоровья населения большинства стран Европы, в том числе и Украины, и увеличение числа бездетных браков за счет мужского бесплодия, и это приводит к тому, что восстановление репродуктивной функции и лечение гипогонадизма различной этиологии становится все более актуальной проблемой. Для восстановления фертильности используются различные препараты (гормональные и негормональные), которые не всегда являются эффективными, или имеют большое количество побочных эффектов [3, с. 10—42, 13, с. 6—20]. Поэтому создание новых средств и терапевтических подходов к лечению репродуктивных нарушений — это главная задача.
В последние годы популярным является назначение препаратов биогенных стимуляторов (мумие, прополис, экстракт алоэ). Основной эффект их применения заключается в том, что они вызывают активацию различных систем организма, влияют на активность ферментов, иммунобиологическую реактивность, восстанавливают гормональный баланс, чем и объясняется широта диапазона их применения [15, с. 1307—1312, 12, с. 804—806]. Таким препаратом можно считать «Биоглобин-У» (протеинизированный водно-солевой экстракт плаценты человека в состав которого входят — полипептиды 3,5—7 %, аминокислоты 50—60 %, аминосахара 4—5 %, гексуроновые кислоты 8—9 %) [11, с. 5—8, 9, с. 9—15, 14]. В урологической практике в последнее время его широко применяют при остром и хроническом простатите. Препарат «Биоглобин-У» препятствует дегрануляции тканевых базофилов [7, с. 9—15]. Однако, каким образом данный препарат влияет на морфофункциональное состояние семенников крыс неизвестно.
Целью работы было изучение сперматогенной функции и ультраструктуры семенников крыс при применении препарата «Биоглобин-У» в условиях создания серотониновой модели гипогонадизма для патогенетического обоснования новых методов коррекции.
Материалы и методы
Исследование выполнено на половозрелых самцах крыс популяции Вистар с начальной массой 280—350 г. Животные были разделены на три группы: 1 гр. — отрицательный контроль (интактные крысы), 2 гр. — положительный контроль (контрольная патология — животные с серотониновым поражением яичек [2, с. 18—21]; 3 гр. — группа животных, которым за трое суток до начала введения серотонина гидрохлорида, на фоне введения серотонина (14 суток) и в течение трех суток после инъекций серотонина вводили препарат «БиоглобинУ» (производства компании ПАО «Фармстандарт-Биолек», г. Харьков) в дозе 200 мкл/кг. Серотонина гидрохлорид (Alfa Aesar ®) вводили в течение 14-ти суток подкожно в дозе 5 мг/кг.
Использовали быструю эвтаназию крыс на 21 сутки эксперимента, выделяли семенники. Семенники крыс всех групп фиксировали в 10 % растворе формалина, проводили в спиртах возрастающей прочности, заливали в целоидинпарафин [8]. На срезах, которые окрашивали гематоксилином и эозином, кроме обзорной микроскопии проводили морфометрическую оценку процесса сперматогенеза [10, с. 73—107].
Для электронно-микроскопического исследования кусочки ткани семенника подвергали предварительной фиксации в 2,5 % забуференном растворе глютарового альдегида в течение 5—6 часов при температуре 4 °С. После этого промывали в буферном растворе, окончательную фиксацию проводили в 1 % забуференном растворе четырех окиси осмия. Обезвоживание ткани проводили в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. Затем ткань пропитывали в смеси эпоксидных смол (эпон-аралдит) по стандартным методикам [4, 5, с. 1153—1157]. Полимеризацию блоков проводили в термостате при температуре 60 °С в течение 48 часов. Из полученных блоков,
на ультрамикротоме УМТП-3М изготавливали ультратонкие срезы, монтировали их на электролитические сеточки и, после контрастирования цитратом свинца, изучали под электронным микроскопом ЭМВ-100БР при ускоряющем напряжении 75 кВ.
Экспериментальные животные были выращены в питомнике ГУ « ИПЭП им. В.Я. Данилевского АМН Украины» при естественном освещении и рационе, рекомендованном для данного вида животных, и питьевом режиме ad libitum. Исследования проводились в соответствии с национальными «Общими этическими принципами экспериментов на животных» (Украина, 2001), которые согласуются с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) [6, с. 142—145].
Статистическую обработку цифровых данных проводили параметрическими и непараметрическими методами с использованием критериев Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни [9,с. 349—454].
Результаты и их обсуждение
При гистологическом исследовании яичек крыс группы отрицательного контроля (интактные крысы) обнаружено, что морфометрические параметры сперматогенеза указанной группы отвечали физиологической норме для этих животных [10, с. 73—107].
Количественный анализ процесса сперматогенеза у животных, получавших препарат «Биоглобин-У», свидетельствовал, что его характеристики достоверно улучшились по сравнению с контрольной патологией (серотониновая модель поражения семенников): количество стволовых клеток в канальцах увеличилось в 4 раза, численность канальцев с 12 стадии мейоза возросла в 3,57 раза, индекс сперматогенеза вырос в 2,8 раза, однако еще не достиг показателей интактного контроля.
Все это может происходить благодаря тому, что препарат «Биоглобин-У» содержит полипептиды, аминокислоты, гексуроновые кислоты, аминосахара, которые способны влиять на энергетические звенья общего метаболизма и
восстанавливать состояние, вызванные введением серотонина гидрохлорида [7, с. 9—15, 11,с. 5—8].
Серотонин вызывает спазм сосудов, нарушение трофики и угнетение поддерживающих клеток, и, как следствие, замедление дифференцировки половых клеток, нарушение морфоструктуры яичек. При таких условиях снижается резерв спермиогенеза (дифференцировки сперматид в сперматозоиды), что приводит к уменьшению индекса сперматогенеза, а следовательно, уменьшается концентрация сперматозоидов. Введение животным препарата «Биоглобин-У» в лечебно-профилактическом режиме на фоне серотонина гидрохлорида положительно повлияло на состояние семенников большей части самцов крыс этой группы. В извитых семенных канальцах отсутствовали признаки асперматогенеза, дистрофии поддерживающих и половых клеток, не наблюдалось изменения размеров канальцев. Процесс сперматогенеза в различных канальцах прослежен до стадии поздних сперматид и сперматозоидов (рис. 1).
Нормализующее действие «Биоглобина-У» по восстановлению морфологического состояния семенников крыс, подвергшихся серотониновому поражению, можно объяснить тем, что препарат оказывает биостимулирующее, антиоксидантное, рассасывающее и репаративное действие, восстанавливает трофику яичек, активацию клеток Лейдига и косвенно стимулирует клетки Сертоли [9, с. 9—15].
Рисунок 1. Семенники самцов крыс. Микрофото: окрашено гематоксилин-
эозином х100: а. — интактные самцы крысы — нормальный размер семенных канальцев, половые клетки представлены в полном объеме; б. — после введения серотонина гидрохлорида — опустошение семенных канальцев, уменьшение их размера, расширение межканальцевого пространства; в. — после введения «Биоглобина-У» на фоне серотонина. Нормальное состояние семенных канальцев, половые клетки не изменены
Доказательством восстанавливающего действия исследуемого препарата служило проведенное электронно-микроскопическое исследование ультраструктурной организации поддерживающих эпителиоцитов и интерстициальных эндокриноцитов семенников крыс после воздействия серотонина гидрохлорида в дозе 5 мг/кг, показавшее развитие дистрофических и деструктивных нарушений субмикроскопической организации органелл, а также сперматогенных клеток различной стадии дифференцировки. Подробное описание субмикроскопической организации этих клеток описано нами в ранее опубликованных работах [1, с. 73—79].
После введения «Биоглобина-У» на фоне серотонина гидрохлорида исследование субмикроскопической организации поддерживающих эпителиоцитов выявило полиморфные изменения органелл. Значительная часть клеток Сертоли приобретала типичное строение с наличием слабо выраженных дистрофических нарушений, которые носили адаптационно-компенсаторный характер.
Ядра таких эпителиоцитов содержали преимущественно деконденсированный хроматин, гранулы которого были диффузно рассеяны по кариоплазме. Ядерная мембрана образовывала инвагинации различной глубины и не содержала очагов лизиса. В цитоплазме располагались многочисленные митохондрии, имеющие электронно-плотный матрикс и достаточно большое количество крист. Некоторые митохондрии принимали «гантелевидную форму», что указывало на активацию процесса деления этих органелл (Рис. 2а).
Гладкий эндоплазматический ретикулум хорошо развит, его цистерны электронно прозрачны. Пластинчатый цитоплазматический комплекс Гольджи умеренно гипертрофирован. В области его локализации обнаруживались включения липидов и фагоцитированного материала. Цитоплазматическая мембрана обладала структурой, присущей элементарной мембране.
В препаратах встречалось небольшое количество поддерживающих эпителиоцитов, ультраструктура которых дистрофически, а иногда и деструктивно нарушена.
я б
Рисунок 2. Ультраструктура поддерживающих эпителиоцитов семенников крыс, получавших «Биоглобин-У» на фоне серотонина гидрохлорида: а — делящиеся митохондрии. х31000. б — включения липидов в цитоплазме.
х36000
Ядра этих эпителиоцитов содержали преимущественно конденсированный хроматин, глыбки которого локализовались по периферии матрикса. Ядерная
мембрана сильно разрыхлена, а иногда очагово разрушена. Агранулярный эндоплазматический ретикулум вакуолизирован, его мембраны разрыхлены. В цитоплазме присутствовало небольшое число рибосом и полисом.
Митохондрии располагались в цитоплазме в виде скоплений. Матрикс митохондрий имел высокую электронную плотность и гомогенную структуру. Кристы сильно укорочены. Наблюдается очаговое разрыхление и лизис наружных мембран митохондрий.
В базальном отделе цитоплазмы клеток Сертоли располагались включения липидов. Цитоплазматическая мембрана осмиофильна и утолщена (Рис. 2б). Гладкий эндоплазматический ретикулум представлен в виде очень крупных электронно-прозрачных вакуолей. Зачастую наблюдалась фрагментация его мембран. В цитоплазме практически отсутствовали рибосомы и полисомы.
Пластинчатый цитоплазматический комплекс Гольджи редуцирован. Его гладкие мембраны дезорганизованы. Гиалоплазма клеток Сертоли имела очень низкую электронную плотность.
Ядра интерстициальных эндокриноцитов после введения «Биоглобина-У» на фоне серотонина гидрохлорида содержали хроматин как в конденсированной, так и в деконденсированной формах. Ядерная мембрана очагово разрыхлена, имеет мелкие и глубокие инвагинации. Перинуклеарные пространства несколько расширены. Очаги деструкции ядерной мембраны практически отсутствовали.
Митохондрии в клетах Лейдига варьировали по размерам и форме в широких пределах. Часто обнаруживались митохондрии находящиеся на различных стадиях деления. Матрикс митохондрий имел высокую электронную плотность и содержал многочисленные трубчатые кристы. Очень редко встречались митохондрии с очагами лизиса наружной мембраны (Рис. 3 а).
Рисунок 3. Ультраструктура интерстициальных эндокриноцитов
семенников крыс, получавших «Биоглобин-У» на фоне серотонина гидрохлорида: а — лизис наружных мембран митохондрий. х32000. б — включения липидов и секреторные гранулы в цитоплазме. х34000
Пластинчатый цитоплазматический комплекс Годьджи гипертрофирован, его гладкие мембраны параллельно ориентированы и собраны в стопки. Вокруг них локализуются скопления мелких электронно прозрачных везикул. Цитоплазма содержит многочисленные рибосомы, собранные в полисомы, а также включения липидов и секреторные гранулы (Рис. 3б).
Выводы
1. Длительное введение серотонина гидрохлорида приводит к нарушениям морфофунуционального состояния семенников патологических изменений, которые характеризуются разной степенью деструкции семенных канальцев, дистрофией и гибелью половых клеток, нарушениями на всех этапах сперматогенеза. Также под воздействием серотонина гидрохлорида на внутриклеточном уровне развивается митохондриальная дисфункция, вследствие которой наблюдается нарушение биоэнергетического обеспечения синтетических реакций и активируются катаболические процессы клеток Сертоли и Лейдига.
2. Процесс сперматогенеза значительно улучшается после введения препарата «Биоглобин-У», в различных канальцах прослежен процесс спермотогенеза до стадии поздних сперматид и сперматозоидов.
3. Выявленные нарушения органелл по глубине и степени выраженности лежат в пределах физиологической компенсации и являются обратимыми после снятия негативного влияния серотонина гидрохлорида.
4. Под воздействием «Биоглобина-У» на фоне серотонина гидрохлорида активность репаративных и синтетических процессов возрастает.
5. Сохранялась умеренная митохондриальная дисфункция, низкое содержание рибосом в цитоплазме и редукция пластинчатого цитоплазматического комплекса Гольджи.
6. Препарат «Биоглобин-У» существенно активирует метаболизм клеток Лейдига, что структурно подтверждается увеличением числа рибосом, гипертрофией пластинчатого цитоплазматического комплекса Гольджи и увеличением количества секреторных гранул.
7. Введение «Биоглобина-У» значительно снижает количество очагов деструкции мембран эндоплазматического ретикулума, ядра и митохондрий в клетках Сертоли и Лейдига.
Список литературы:
1. Бречка Н.М., Невзоров В.П., Бондаренко В.А., Коренева Е.В., Малова Н.Г. Нарушение ультраструктуры клеток Сертоли и Лейдига под воздействием серотонина гидрохлорида // Проблеми ендокринно!' патологи. — 2012. — № 2. — С. 73—79.
2. Бутенко 1.Г., Лар'яновська Ю.Б. Корекщя препаратами йохiмбе-генез та йохiмбе-гармонiя порушень сперматогенезу у щурiв, викликаних серотоншом // Експериментальна та кттчна медицина. — 2000. — № 3. — С. 18—21.
3. Гаспаров А.С., Назаренко Т.А. Репродуктивное здоровье. Бесплодие как медико-социальная проблема: практическое руководство. М., 2000. — 56 с.
4. Данилова Л.В. Ультраструктурные исследования сперматогенеза. М: Наука, 1978. — 250 с.
5. Дедов В.И. Ультраструктура клеток Сертоли и Лейдига у крыс в норме и в условиях длительного внутреннего облучения // Цитология. — 1980. — Т. 22, — № 10. — С. 1153—1157.
6. Загальш етичш принципи експерименлв на тваринах // Ендокринолопя. — 2003. — Т. 8, — № 1. — С. 142—145.
7. Козин Ю.И., Россихин В.В., Шитов Г.Г. Оценка эффективности биоглобина у больных хроническим пиелонефритом // Научное и практическое значение биоглобина в медицине как бионормализатора: материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием Х., 2001. — С. 9—15.
8. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. М.: Медицина, Ленингр. отд-ние. 1969. — 424 с.
9. Основные методы статистической обработки результатов фармакологических экспериментов. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Ремедиум. 2000. — С. 349—454.
10. Райцина С.С. Современные проблемы сперматогенеза. М.: Медицина, 1982. — С. 73—107.
11. Россихин В.В. Возможности биокоррекции в урологии и андрологии. Научное и практическое значение биоглобина в медицине, как бионормализатора: материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием. Х., 2001. — С. 5—8.
12. Сотникова Е.П. Адаптационное действие биогенных стимуляторов по
B.П. Филатову / Актуальш питання фармакологи: Конф., присвяч. 70-рiччю кафедри фармакологи ВНМУ iм. М.1. Пирогова, 26—27 жовтня 2007 р., Вшниця // Вюник Вшницького нац. мед. ун-ту. — 2007. — № 11(2/2). —
C. 804—806.
13. Тер-Аванесов Г.В. Фертильность мужчин в ХХ1 веке // Андрология и генитальная хирургия. М., 2000 — 32 с.
14. Шитов Г.Г. Научное и практическое значение биоглобина в медицине, как бионормализатора //Мат. науч.-практ. конф. Х., 2001. — 74 с.
15. Kumar R., Gautam G., Gupta N.P. Drug therapy for idiopatic male infertility: rational versus evidence // J. Urolog. — 2006. — Vol. 176, — № 4, — Pt. 1. — P. 1307—1312.
