Научная статья на тему 'Повышение устойчивости бобово-ризобиального симбиоза к кадмию с помощью ризосферных бактерий, содержащих АЦК деаминазу'

Повышение устойчивости бобово-ризобиального симбиоза к кадмию с помощью ризосферных бактерий, содержащих АЦК деаминазу Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
482
103
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АЦК ДЕАМИНАЗА / АЗОТФИКСАЦИЯ / ГОРОХ / ИНОКУЛЯЦИЯ / КАДМИЙ / КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ / РАСТИТЕЛЬНОМИКРОБНЫЕ АССОЦИАЦИИ / РИЗОСФЕРА / СИМБИОЗ / СТРЕСС / ЭТИЛЕН / ACC DEAMINASE / NITROGEN FIXATION / PEA / INOCULATION / CADMIUM / NODULE BACTERIA / PLANT-MICROBE ASSOCIATIONS / RHIZOSPHERE / SYMBIOSIS / STRESS / ETHYLENE

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Малков Н. В., Зиновкина Н. Ю., Сафронова В. И., Белимов А. А.

Изосферные бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, обладают способностью утилизировать АЦК и стимулировать рост растений в стрессовых условиях благодаря снижению ингибирующего воздействия фитогормона этилена, образующегося из этой аминокислоты. В работе изучали роль АЦК-утилизирующих ризобактерий, относящихся к видам Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Ps. putida, Ps. orysihabitans и Variovoraxparadoxus, в реакции симбиоза клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae с растениями гороха линии SGE и устойчивого к кадмию мутанта SGECd 1 на кадмиевый стресс. В экспериментах с гидропонной культурой при выращивании растений в присутствии 0,5 мкМ CdCl 2 получена существенная стимуляция образования клубеньков на корнях и улучшение роста побегов при инокуляции большинством штаммов. В среднем на инокулированных растениях количество клубеньков было больше у генотипа SGE на 32 % и у мутанта SGECd 1 на 80 %, а биомасса побега повышалась соответственно на 31 и 38 %. Самое высокое положительное влияние на образование клубеньков отмечено для штаммов Ps. brassicacearum Am3, Ps. orysihabitans Ep4 и V. paradoxus 5C-2. В вегетационном опыте с песчаной культурой штамм V. paradoxus 5C-2 достоверно повысил (36 %), а штамм Ps. orysihabitans Ep4 проявил тенденцию к повышению (20 %) активности азотфиксации при инокуляции мутанта SGECd t. Результаты работы свидетельствуют о перспективности применения АЦК-утилизирующих ризобактерий для улучшения адаптации растительно-микробных симбиозов и роста растений на загрязненных тяжелыми металлами почвах.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Малков Н. В., Зиновкина Н. Ю., Сафронова В. И., Белимов А. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

INCREASE IN RESISTANCE OF LEGUME-RHIZOBIAL COMPLEX TO CADMIUM USING RHIZOSPHERE BACTERIA CONTAINING ACC DEAMINASE

Rhizosphere bacteria cjntaining enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase have possibility utilizing ACC and stimulating plant growth under stressful conditions as a result of elimination of inhibiting effect caused by phytohormone ethylene. In the present study the role of ACC-utilizing rhizobacteria belonging to Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Ps. putida, Ps. orysihabitans and Variovorax paradoxus in response of symbiosis between nodule bacteria Rhizobium leguminosarum bv. viciae and pea line SGE or its cadmium tolerant mutant SGECd t plants to cadmium stress was investigated. In hydroponic experiments in the presence of 0.5 uM CdCl 2 a significant stimulation of nodule formation on roots and improvement of plant shoot growth was observed after inoculation with a majority of the studied strains. In the average, the nodule number on the inoculated plants increased on SGE by 32% and on SGECd t by 80%, whereas shoot biomass increased on SGE by 31% and on SGECd t by 38%, respectively. A maximum positive effect on nodulation was obtained after inoculation with strains Ps. brassicacearum Am3, Ps. orysihabitans Ep4 and V. paradoxus 5C-2. In pot experiment with sand culture the strain V. paradoxus 5C-2 significantly increased (by 36%) nitrogen-fixing activity and the strain Ps. orysihabitans Ep4 showed tendency for increasing this parameter (20%) after inoculation of SGECd t mutant. The results suggest a promise for application of ACC-utilizing rhizobacteria for improvement of adaptation of plant-microbe symbioses and plant growth on soils contaminated with heavy metals.

Текст научной работы на тему «Повышение устойчивости бобово-ризобиального симбиоза к кадмию с помощью ризосферных бактерий, содержащих АЦК деаминазу»

вание минеральных удобрений в дозе (NPK)70 на фоне на зерно дозу минеральных удобрений целесообразно последствия 80 т/га навоз. При выращивании кукурузы удвоить.

Литература.

1. Забугина Т.М. Удобрения кукурузы в кукурузно-люцерновом севообороте и монокультуре на суглинистой дерновоподзолистой почве центрального района нечерноземной зоны России: авторефератдисс. к.с./х.н. - 1997. - 24 с.

2. Навальнев В.В., Доманов Н.М., Шаповалов Н.К. Агротехнология, которая обеспечивает сбор 40-45 тонн сахарной свеклы и 5,5 - 6,0 тонн сахара с гектара // Сахарная свекла. - 2006. - №7. - С. 32-34.

3. Хадеев Т.Г., Таланов И.П., Чекмарев П.А. Влияние фонов питания и приемов основной обработки почвы на урожайность и качество зерна яровой пшеницы//Вестник Казанского ГАУ. - 2011. - № 3 (21) . - С. 159-161.

4. Хисматуллин М.М., Миннуллин Г.С., Вафина Л.Т., Сафиоллин Ф.Н. Химический состав и питательность кормов из многолетних трав в зависимости от фона минерального питания и сроков их уборки//Вестник Казанского ГАУ. - 2011. - № 1 (19). - С. 160-162.

EFFECT OF FERTILIZERS AND TILLAGE ON YIELD AND QUALITY OF GREEN MASS

AND GRAIN OF CORN V.N. Samykin, V.D. Solovitchenko, I.V. Logvinov

Summary. The results of the researches which have been carried out on the chernozem typical, show that introduction of organic and mineral fertilizers and the main processing of the soil (plowing, bezotvalny and minimum) on crop rotations influences productivity and quality of propashny cultures. In control options it was received when plowing 27 t/hectares of green material of corn, on bezotvalny processing of 26 and 25 t/hectares at the minimum processing. Introduction of mineral fertilizers (NPK) 70 increased productivity on the plowed allotments to 36 t/hectares, and on bezotvalny processings - to 34 and 33 t/hectares. Application of a double dose (NPK) 140 in comparison with an unary dose where increases made on otvalny, bezotvalny and minimum processings of the soil, respectively 2,0, 4,0 and 2,0 t/hectares. Introduction of 80 t/hectares of KRS manure plowing of 6,0 t/hectares on bezotvalny processings of 6,0 and 5,0 t/hectares in relation to control options gives the following increases of a crop. Increases from double doses of organic and mineral fertilizers depending on soil processing (plowing and bezotvalny processings) made 15-16 t/hectares in relation to control.

Key words: productivity, quality of production, propashny cultures, crop rotation, mineral and organic fertilizers, soil processing.

УДК ОАЕ 631.46:579.64:581.138.1:581.133.9:57.044

ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА К КАДМИЮ С ПОМОЩЬЮ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ, СОДЕРЖАЩИХ АЦК ДЕАМИНАЗУ*

Н.В. МАЛКОВ, аспирант

Н.Ю. ЗИНОВКИНА, инженер-микробиолог

В.И. САФРОНОВА, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

А.А. БЕЛИМОВ, доктор биологических наук, зав. лабораторией

ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Рос-сеольхозакадемии

E-mail: belimov@rambler.ru

Резюме. Ризосферные бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, обладают способностью утилизировать АЦК и стимулировать рост растений в стрессовых условиях благодаря снижению ингибирующего воздействия фитогормона этилена, образующегося из этой аминокислоты. В работе изучали роль АЦК-утилизирующих ризобактерий, относящихся к видам Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Ps. putida, Ps. orysihabitans и Variovoraxparadoxus, в реакции симбиоза клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae с растениями гороха линии SGE и устойчивого к кадмию мутанта SGECd1 на кадмиевый стресс. В экспериментах с гидропонной культурой при выращивании растений в присутствии 0,5 мкМ CdCl2 получена существенная

*Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-49486-а и 09-04-01614-а) и Министерством образования и науки РФ (ГК№ 16.512.11.2162).

стимуляция образования клубеньков на корнях и улучшение роста побегов при инокуляции большинством штаммов. В среднем на инокулированных растениях количество клубеньков было больше у генотипа SGE на 32 % и у мутанта SGECd1 - на 80 %, а биомасса побега повышалась соответственно на 31 и 38 %. Самое высокое положительное влияние на образование клубеньков отмечено для штаммов Ps. brassicacearum Am3, Ps. orysihabitans Ep4 и V. paradoxus 5C-2. В вегетационном опыте с песчаной культурой штамм V. paradoxus 5C-2 достоверно повысил (36 %), а штамм Ps. orysihabitans Ep4 проявил тенденцию к повышению (20 %) активности азотфиксации при инокуляции мутанта SGECdt. Результаты работы свидетельствуют о перспективности применения АЦК-утилизирующих ризобактерий для улучшения адаптации растительно-микробных симбиозов и роста растений на загрязненных тяжелыми металлами почвах. Ключевые слова: АЦКдеаминаза, азотфиксация, горох, инокуляция, кадмий, клубеньковые бактерии, растительномикробные ассоциации, ризосфера, симбиоз, стресс, этилен.

Тяжелые металлы (ТМ), такие как кадмий, свинец, цинк и др., относятся к числу самых распространенных и опасных загрязнителей почвы. В отличие от органических соединений они не поддаются деструкции и способны передвигаться по пищевым цепям экосистемы, концентрируясь в ее высших звеньях - животных и человеке. Интенсивное развитие промышленности и сельскохозяйственного производства приводит к об-------------------------------------------- 53

CD

s

x

а)

о

о.

Л

I

(1)

ю

LQ

240

200

160

120

80

40

0

3.0

2.5

2.0

1.5 1,0 0,5 0,0

i

1* 2 3* 4 5* 6 7 8 9*10*11 Варианты инокуляции

г

Ъ

5

i

I

2 3* 4* 5* 6* 7 8* 9* 10*1 Г Варианты инокуляции

Рис. 1. Влияние АЦК-утилизирующих ризобактерий на образование клубеньков (А) и биомассу побегов (Б) гороха линии SGE в присутствии в питательном растворе 0,5 мкМ CdCl2 (Эксперимент № 1): 1 - инокуляция только клубеньковыми бактериями без обработки кадмием; 2 - инокуляция только клубеньковыми бактериями; 3 - штамм Am3; 4 - штамм Bm3;

5 - штамм Ep4; 6 - штамм Cm3; 7 - штамм Cm4; 8 - штамм Ep3;

9 - штамм 5C-2; 10 - штамм 3C-1; 11 - штамм 3P-4. Отрезками указаны ошибки средних; звездочками помечены варианты, достоверно отличающиеся от варианта 2.

разованию как локальных очагов с экстремально высокими концентрациями ТМ, так и к загрязнению обширных территорий. Традиционные физико-химические способы очистки почвы, чрезвычайно дорогостоящи, создают новые отходы, снижают плодородие почвы и разрушительны для экосистем. Мелиоративные мероприятия по ремедиации сельскохозяйственных угодий в основном направлены не на очистку почвы, а на предотвращение поступления токсикантов в продукцию. Поэтому необходимо разрабатывать новые эффективные экологически безопасные методы и технологии, которые характеризуются низкими затратами ресурсов и энергии. В этой связи представляет интерес использование потенциала растений [1].

Одна из важнейших задач при создании эффективных технологий фиторемедиации - поиск подходящих видов и генотипов. К сожалению, растения с большой биомассой, в основном сельскохозяйственные культуры (горчица сарептская, рапс, подсолнечник, и др.), отличаются ограниченной способностью к аккумуляции ТМ в надземных органах и требуют соблюдения определенных агротехнических мероприятий для достижения высокой продуктивности на загрязненных почвах (мелиорация, высокие дозы удобрений и др.). Дикие растения металлофиты и гипераккумуляторы

ТМ (Thlaspi caerulescens, Alyssum murale и др.) характеризуются очень маленькой биомассой, что не позволяет проводить их механизированную уборку [2]. Поэтому усилия многих исследователей направлены на создание трансгенных растений и мутантных форм [3]. На сегодняшний день известны несколько мутан-тых форм с пониженной устойчивостью к ТМ, которые используют для изучения механизмов воздействия последних на растения [4...6]. Мутант Arabidopsisthaliana MRC-32 обладает повышенной устойчивостью к Cd, но одновременно характеризуется карликовостью, замедленным ростом и меньшим количеством листьев

[7]. Недавно был получен мутант гороха SGECd' -уникальная и единственная в мире форма растений, которая обладает одновременно повышенной устойчивостью и аккумуляцией кадмия в корнях и побегах

[8]. Наши исследования показали, что у SGECd’ морфологические, физиологические и биохимические реакции на кадмиевый стресс выражены гораздо слабее, а биомасса и концентрация Cd в тканях в несколько раз больше, чем у растений дикого типа. Эти свойства, а также высокая симбиотрофность гороха, как бобового растения, делают указанный мутант уникальной моделью и очень перспективным объектом исследований, направленных на создание устойчивых и высокопродуктивных растительно-микробных систем для фиторемедиации загрязненных почв.

Растения вступают в симбиотрофные отношения с разнообразными микроорганизмами, которые играют положительную роль в процессах их роста и питания, а также повышают адаптацию к неблагоприятным условиям среды [9, 10]. Микроорганизмы отличаются высокой устойчивостью к ТМ и активно участвуют в трансформации не только питательных элементов, но и токсичных ТМ в почве и ризосфере. Многие их свойства и механизмы положительного влияния на растения могут противодействовать негативным эффектам ТМ. Универсальным антистрессовым эффектом обладают симбиотрофные бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, благодаря которому в растениях снижается концентрация этилена, сигнального вещества, запускающего каскад неспецифических стрессовых реакций и ингибирующего ростовые процессы [11]. Благодаря АЦК-деаминазной активности микроорганизмы способны стимулировать рост растений в условиях стресса, в том числе вызванного высокими концентрациями ТМ [12]. Однако экспериментальные сведения о снижении токсического эффекта ТМ и улучшении роста растений на загрязненных почвах весьма фрагментарны. Например, показано, что инокуляция штаммом Serratia quinivorans SUD165 существенно снижала токсичность Ni и образование стрессового этилена у проростков рапса [13]. Наши эксперименты с рапсом [14], горохом [11] и пастбищными бобовыми [15] также продемонстрировали положительное действие АЦК-утилизирующих бактерий различных таксономических групп при стрессе, вызванном кадмием и другими ТМ.

Как правило, растения менее устойчивы к ТМ, чем микроорганизмы, что, вероятно, связано с их более сложной организацией. Например, сильное угнетение роста гороха наблюдалось при концентрации 5 мкМ Cd, а клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae - при 50 мкМ [16]. В то же время в случае выращивания гороха в присутствии 0,5 мкМ Cd не наблюдалось ингибирования роста корней, однако

количество симбиотических клубеньков снижалось в 4 раза [16]. Иногда даже устойчивые к ТМ бактерии не оказывали положительного эффекта на растения из-за ингибирования их АЦК-деаминазной активности [11]. Следовательно, симбиотические отношения между микроорганизмами и растениями могут быть очень чувствительны к ТМ и нарушаться при их концентрациях ниже, чем минимально токсичные для каждого из партнеров в отдельности. Это свидетельствует о необходимости более детального изучения взаимодействия растений с бактериями, содержащими АЦК деаминазу, и поиска путей повышения его эффективности при использовании растительно-микробных систем для фиторемедиации загрязненных почв.

Цель наших исследований - изучить возможности повышения устойчивости азотфиксирующего симбиоза гороха с клубеньковыми бактериями к кадмию путем инокуляции растений ассоциативными микроорганизмами, содержащими АЦК деаминазу.

Условия, материалы и методы. Растительным объектом исследований были лабораторная линия гороха SGE и её мутант SGECcT, который отличается повышенной устойчивостью к кадмию и аккумуляцией этого элемента [17]. Микробиологические объекты исследований - устойчивые к кадмию штамм клубеньковых бактерий гороха Rhizobium legumi-nosarum bv. viciae CIAM1066 и штаммы ассоциативных АЦК-утилизирующих ризобактерий Achromobacter xylosoxidans (штаммы Cm3, Cm4, Ep3), Pseudomonas brassicacearum (штамм Am3), Ps. putida (штамм Bm3), Ps. orysihabitans (штамм Ep4) и Variovoraxparadoxus (штаммы 5C-2, 3C-1 и 3P-4) из ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВНИИСХМ).

В течение 4 сут. клубеньковые бактерии выращивали на агаризованной маннитно-дрожжевой среде [16], а ассоциативные бактерии на агаризованной среде BPF [14]. Затем делали смыв клеток со среды и готовили водные суспензии бактерий, которые в тот же день использовали для инокуляции.

Влияние ризобактерий на образование симбиотических клубеньков изучали на гидропонной культуре. Семена гороха линии SGE (масса семян 0,15. 0,16 г; эксперимент №1) и мутанта SGECC' (масса семян 0,13.0,14 г; эксперимент №2) поверхностно стерилизовали и скарифицировали в концентрированной H2SO4 в течение 30 мин. Затем их проращивали в течение 3 дн. в чашках Петри на фильтровальной бумаге при 25 C° без света. Проростки перемещали в пластиковые сосуды (два сосуда по 5 семян на генотип), содержащие 850 мл питательного раствора следующего состава: MgSO4 (400 мкМ), KCl (100 мкМ), KH2PO4 (600 мкМ), CaCl2 (100 мкМ), Ca(NO3)2 (15 мкМ), Fe-тартрат (20 мкМ), смесь микроэлементов. Инокуляцию проводили путем добавления в сосуды водных суспензий клубеньковых и ассоциативных бактерий до концентрации 106 кл./мл. На следующий день в сосуды добавляли CdCl2 в концентрации 0,5 мкМ. Контролем служили варианты только с инокуляцией клубеньковыми бактериями в отсутствии и присутствии кадмия. Питательный раствор не аэрировали (с целью избежания активного удаления этилена из зоны корней) и не меняли (для сохранения адаптированных популяций бактерий на корнях), а растворы питательных элементов периодически добавляли прямо в сосуды. Растения выращивали в течение 35 дн. в ростовой камере (фитотрон) при цикле день/ночь - 12/12 ч,

температуре 23/180° и относительной влажности 50.60 %. В конце опытов определяли массу каждого растения и количество клубеньков на корнях (повторность 10 растений на каждый вариант).

Для изучения влияния ризобактерий на азотфикси-рующую активность клубеньков гороха в летний период (июнь-июль) в теплице с естественным световым и температурным режимами был проведен вегетационный опыт. Растения линии БОЕ и мутанта БОЕОС выращивали в сосудах, содержащих 2,0 кг промытого кварцевого песка и 500 мл питательного раствора следующего состава (мкМ): КН2Р04 - 600; МдБ04 -400; 0а012 - 50; Ре-тартрат - 20; Н3В03 - 4; МпБ04 - 3; 7пБ04 - 7; Ыа2Мо04 - 0,5. Стартовая доза азотного удобрения в форме 0а(Ы03)2 составляла 5 мкМ. Для каждого варианта опыта готовили 5 сосудов с тремя растениями в каждом. Инокуляцию проводили путем добавления в питательный раствор суспензий клубеньковых и ассоциативных бактерий до концентрации 106 кл./мл. Раствор 0С012 в добавляли в сосуды на 24-е, 27-е, 30-е и 33-е сут. после инокуляции каждый раз в расчете по 2 мг ОС на 1 кг песка. Затем растения продолжали культивировать в течение 14 сут. Контролем служили варианты инокуляции только клубеньковыми бактериями в отсутствии и присутствии кадмия. Влажность песка поддерживали на уровне 60.70 % от полной влагоемкости путем регулярного полива. Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым

а

Л

X

о

ю

>*

240

200

160

120

80

40

0

3.0

2.5

2.0

1.5 1,0 0,5 0,0

ЕЕ

ЕЕ

ЕЕ

і

а

1* 2 з* 4* 5* 6 7* 8* 9*10*11* Варианты инокуляции

ЕЕ

і

ЕЕ

і

ЕЕ

і

і

2 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* 10*1 Г Варианты инокуляции

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 2. Влияние АЦК-утилизирующих ризобактерий на образование клубеньков (А) и биомассу побегов (Б) мутанта гороха ввЕСс!* в присутствии в питательном растворе 0,5 мкМ СсЮ2 (Эксперимент № 2): 1 - инокуляция только клубеньковыми бактериями без обработки кадмием; 2 - инокуляция только клубеньковыми бактериями; 3 - штамм Ат3; 4 - штамм Вт3;

5 - штамм Ер4; 6 - штамм Ст3; 7 - штамм Ст4; 8 - штамм Ер3;

9 - штамм 5С-2; 10 - штамм 3С-1; 11 - штамм 3Р-4. Отрезками указаны ошибки средних; звездочками помечены варианты, достоверно отличающиеся от варианта 2.

CD

S

X

X

ш

сЗ

03

Q.

0)

ю

>,

Контроль Cd+5C-2

Cd Cd+Ep4

Варианты опыта

400

Контроль Cd+5C2

Cd Cd+Ep4

Варианты опыта

Рис. 3. Влияние АЦК-утилизирующих ризобактерий на образование (А) и азотфиксирующую активность (Б) клубеньков гороха линии SGE (белые столбики) и мутанта SGECd' (штрихованные столбики) в присутствии CdCl2 (Вегетационный опыт): контроль -инокуляция только клубеньковыми бактериями без обработки кадмием; Cd - инокуляция только клубеньковыми бактериями; Cd+5C-2 - штамм 5C-2; Cd+Ep4 - штамм Ep4. Отрезками указаны ошибки средних; звездочками помечены варианты, достоверно отличающиеся от варианта Cd для каждого генотипа гороха.

методом [18]. Для этого на 47-е сутки выращивания растений корни вместе с клубеньками (9 растений в каждом варианте опыта) вынимали из песка, аккуратно отмывали в воде и помещали в герметичные флаконы вместимостью 30 мл. Во флакон добавляли ацетилен в количестве 10 % от его объема и инкубировали при комнатной температуре 1ч. После этого в специальные флаконы отбирали образцы газовой фазы для последующего анализа. Корни взвешивали и определяли количество клубеньков. Содержание образовавшегося в ходе биохимической реакции этилена измеряли на газовом хроматографе GC-2010. В конце эксперимента определяли биомассу побегов.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью программы STATISTICA V-6.0. При выборе подходящего метода математического анализа данных руководствовались соответствующими рекомендациями [19].

Результаты и обсуждение. В эксперименте №1 с горохом линии SGE обработка кадмием снижала количество клубеньков более чем в 2 раза (рис. 1А). Инокуляция штаммами АЦК-утилизирующих бактерий Ps. brassicacearum Am3, Ps. orysihabitans Ep4), а также V. paradoxus 5C-2 и 3C-1 уменьшала негативное влияние этого элемента на образование клубеньков. Наибольший благоприятный эффект отмечен в варианте

со штаммом Ep4. Кроме того, кадмий существенно ингибировал рост побегов, а присутствие ризобактерий нивелировало этот эффект (рис. 1Б). Важно отметить, что при обработке кадмием клубеньки у инокулирован-ных ассоциативными ризобактериями растений стали образовываться гораздо быстрее. Вероятно, это также внесло вклад в активный рост побегов и снятие ингибирующего эффекта тяжелого металла. Причем действие ризобактерий на массу корней было менее выражено (данные не представлены). Существенная стимуляция клубенькообразования при инокуляции АЦК-утилизирующими ризобактериями отмечена и у обработанных кадмием растений мутанта SGECd' (рис. 2А). В этом случае все изучаемые штаммы, за исключением A. xylosoxidans Cm3, достоверно повышали количество клубеньков. Более выраженный эффект ризобактерий на мутанте SGECd', вероятно, связан с его повышенной устойчивостью к кадмию, которая обусловила более эффективное взаимодействие с микросимбионтами. Это подтверждают данные о влиянии кадмия на клу-бенькообразование - количество клубеньков у мутанта снизилось на 46 % (рис. 2А), а у дикого типа - на 61 % (рис. 1А) и рост растений - биомасса побега мутанта уменьшилась на 20 % (рис. 2Б), а дикого типа - на 33 % (рис. 1Б). Также как и в эксперименте с линией SGE (рис. 1Б) инокуляция АЦК-утилизирующими ризобактериями существенно улучшила рост побегов мутанта SGECd' (рис. 2Б). При этом положительный эффект обеспечили все изучаемые штаммы, а самым большим он был при использовании штаммов Ps. brassicacearum Am3 и A. xylosoxidans Cm4. Растения мутанта отличались от растений дикого типа меньшей биомассой и количеством клубеньков, что, на наш взгляд, связано с различиями в массе семян, взятых для экспериментов, поскольку при использовании одинаковых семян различия между генотипами в оптимальных условиях роста не существенны [17].

Штаммы АЦК-утилизирующих ризобактерий Ps. orysihabitans Ep4 и V. paradoxus 5C-2, испытанные в вегетационном опыте, показали высокую способность стимулировать образование клубеньков и рост растений. Обработка кадмием снизила количество клубеньков у обоих генотипов гороха (рис. 3А). В таких условиях инокуляция АЦК-утилизирующими ризо-бактериями не повлияла на образование клубеньков. Возможно, это связано с тем, что обработка кадмием не проводилась до стадии образования клубеньков, и у растений не происходило усиления биосинтеза фитогормона этилена в оптимальных условиях роста. Как известно, именно повышенный уровень этого соединения, которое активно синтезируется в стрессовых условиях, ингибирует процесс клубенькообразования [20]. Вероятно, что эффект ризобактерий, связанный с активностью АЦК деаминазы и снижением уровня этилена в корнях, не проявился до обработки кадмием, а негативное действие этого элемента на клубень-кообразование опережало влияние ризобактерий. Действительно, индукцию фермента АЦК деаминазы и его эффект можно обнаружить только после повышения биосинтеза этилена и, следовательно, после начала ингибирования образования клубеньков этим гормоном. Кадмий вызвал существенное снижение азотфиксирующей активности клубеньков у растений линии SGE, но не у устойчивого к этому токсиканту мутанта SGECd' (рис. 3Б). Именно у мутантной линии гороха штамм V. paradoxus 5C-2 достоверно повысил, а штамм Ps. orysihabitans Ep4 обеспечил проявление

тенденции к увеличению активности азотфиксации клубеньков (рис. 3Б). Это свидетельствует о важной роли устойчивости к тяжелым металлам растения для эффективного функционирования бобово-ризобиального симбиоза в стрессовых условиях. В этом опыте ризо-бактерии не оказали существенного влияния на рост растений (данные не представлены).

Выводы. Таким образом, мы установили, что АЦК-утилизирующие ризобактерии улучшают образование и функционирование симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями в присутствии токсичных концентраций кадмия. Они стимулируют образование

симбиотических клубеньков у гороха линии SGE и его устойчивого к кадмию мутанта SGECd'. В зависимости от генотипа растения ризобактерии с АЦК деами-назной активностью способствуют снижению негативного действия кадмия на процесс азотфиксации. Положительное влияние ризобактерий проявляется в повышении биомассы обработанных кадмием растений. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения АЦК-утилизирующих ризобактерий для улучшения адаптации растительномикробных симбиозов и роста растений на загрязненных тяжелыми металлами почвах.

Литература.

1. Handbook for Phytoremediation, Golubev I.A. (Ed.), NOVA Sci. Publ., USA, 2011, 815 p.

2. Padmavathiamma P.K., Li L.Y. Phytoremediation technology: Hyper-accumulation metals in plants // Water Air and Soil Pollution. - 2007. - V. 184. - P. 105-126

3. Goel S., Malik J.A., Nayyar Y. Molecular approach for phytoremediation of metal-contaminated sites // Archives of Agronomy and Soil Science. - 2009. - V. 55. - P. 451-475.

4. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cad1 mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient// Plant Physiology. - 1995. - V. 107. - P. 1059-1066.

5. He J.Y., Ren Y.F., Wang F.J., Pan X.B., Zhu C., Jiang D.A. Characterization of cadmium uptake and translocation in a cadmium-sensitive mutant of rice (Oryza sativa L. ssp. japonica) //Archives of Environmental Contamination and Toxicology. - 2009. - V. 57. - P. 299-306.

6. Welch R.M., LaRue T.A. Physiological characteristics of Fe accumulation in the ‘Bronze' mutant of Pisum sativum L., cv‘Sparkle' E107(brz brz)//Plant Physiology. - 1990. - V. 93. - P. 723-729.

7. Watanabe A., Ito H., Chiba M., Ito A., Shimizu H., Fuji S., Nakamura S., Hattori H., Chino M. et al. Isolation of novel types of Arabidopsis mutants with altered reactions to cadmium: cadmium-gradient agar plates are an effective screen for the heavy metal-related mutants // Planta. - 2010. - V. 232. - P. 825-836.

8. Tsyganov V.E., Belimov A.A., Borisov A.Y., Safronova V.I., Georgi M., Dietz K.-J., Tikhonovich I.A. A chemically induced new pea (Pisum sativum L.) mutant SGECd1 with increased tolerance to and accumulation of cadmium // Annals of Botany. - 2007. -V. 99. - P. 227-237.

9. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. -СПб.: Изд-во С.Петерб. ун-та, 2009. - 210 с.

10. Белимов А.А. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов: Авторефератдисс. д-ра биол. наук. - С-Петербург: изд-во ИЦЗР, 2008. - 46 С.

11. Safronova V I, Stepanok V V, Engqvist G L, et al. Root-associated bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated in cadmium supplemented soil // Biology and Fertility of Soils. - 2006. - V. 42. - P. 267-272.

12. Glick B.R., Todorovic B., Czarny J. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase // Critical Reviews in Plant Science. - 2007. - V. 26. - P. 227-242.

13. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. A plant growth promoting bacterium that decreases nickel toxicity in plant seedlings. Applied and Environmental Microbiology //1998. - V. 64. - P. 3663-3668.

14. BelimovA.A., Safronova V.I., Sergeyeva T.A., Egorova T.N., Matveyeva V.A, TsyganovV.E., BorisovA.Y., TikhonovichI.A., Kluge

C., Preisfeld A., Dietz K.-J., Stepanok V.V. Characterisation of plant growth-promoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase // Canadian Journal of Microbiology. - 2001. - V. 47. - P. 642-652.

15. Delorme T.A., Gagliardi J.V., Angle J.S., et al. Influence of the zinc hyperaccumulator Thaspi caerulescens J. & C. Presl. and the nonmetal accumulator Trifolium pratense L. on soil microbial populations // Canadian Journal of Microbiology. - 2001. - V. 47. -P. 773-776.

16. Belimov A.A., Wenzel W.W. The role of rhizosphere microorganisms in heavy metal tolerance of higher plants // Aspects of Applied Biology. - 2009. - V. 98. - P. 81-90.

17. Tsyganov V.E., BelimovA.A., Borisov A.Y., Safronova V.I., Georgi M., Dietz K.-J., Tikhonovich I.A. A chemically induced new pea (Pisum sativum L.) mutant SGECd1 with increased tolerance to and accumulation of cadmium //Annals of Botany. - 2007. - V. 99. - P. 227-237.

18. Hardy R.W.F., Burns R.C., Holsten R.D. Application of the C2H2-C2H4 assay for measurement of nitrogen fixation // Soil Biology and Biochemistry. - 1973. - V. 5. - P. 47-82.

19. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

20. Guinel F.C., Geil R.D. A model for the development of the rhizobialandarbuscular mycorrhizalsymbioses in legumes and its use to understand the roles of ethylene in the establishment of these two symbioses // Canadian Journal of Botany. - 2002. V. 80. - P. 695-720.

INCREASE IN RESISTANCE OF LEGUME-RHIZOBIAL COMPLEX TO CADMIUM USING RHIZOSPHERE BACTERIA CONTAINING ACC DEAMINASE N.V. Malkov, N.Yu. Zinovkina, V.I. Safronova, A.A. Belimov

Summary. Rhizosphere bacteria cjntaining enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase have possibility utilizing ACC and stimulating plant growth under stressful conditions as a result of elimination of inhibiting effect caused by phytohormone ethylene. In the present study the role of ACC-utiiizing rhizobacteria belonging to Achromobacterxylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Ps. putida, Ps. orysihabitans and Variovorax paradoxus in response of symbiosis between nodule bacteria Rhizobium leguminosarum bv. viciae and pea line SGE or its cadmium tolerant mutant SGECdt plants to cadmium stress was investigated. In hydroponic experiments in the presence of 0.5 uM CdCl2 a significant stimulation of nodule formation on roots and improvement of plant shoot growth was observed after inoculation with a majority of the studied strains. In the average, the nodule number on the inoculated plants increased on SGE by З2% and on SGECdt by 80%, whereas shoot biomass increased on SGE by З1% and on SGECdt by зВ%, respectively. A maximum positive effect on noduiation was obtained after inoculation with strains Ps. brassicacearum Am^, Ps. orysihabitans Ep4 and V. paradoxus SC-2. In pot experiment with sand culture the strain V. paradoxus SC-2 significantly increased (by З6%) nitrogen-fixing activity and the strain Ps. orysihabitans Ep4 showed tendency for increasing this parameter (20%) after inoculation of SGECdt mutant. The results suggest a promise for application of ACC-utiiizing rhizobacteria for improvement of adaptation of piant-microbe symbioses and plant growth on soils contaminated with heavy metals.

Key words: ACC deaminase, nitrogen fixation, pea, inoculation, cadmium, nodule bacteria, piant-microbe associations, rhizosphere, symbiosis, stress, ethylene.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.