CC BY
44
№03/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
ПОВРЕЖДАЮЩАЯ РОЛЬ ЭНДОГЕННОГО ОКСИДА АЗОТА В РАЗВИТИИ 5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО DSS-КОЛИТА У КРЫС
о
0
1 Трубицына И.Е., Дроздов В.Н., Барышников Е.Н., Чикунова Б.З., Петраков А.В.
о
г Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, Москва
| Трубицына Ирина Евгеньевна
* 111123, Москва, шоссе Энтузиастов, д. 86
| Тел.: 8 (495) 304 3096
| E-mail: gastroenter@rambler.ru
РЕЗЮМЕ
Проведено экспериментальное исследование на крысах для выяснения роли индуцибельной продукции NO в патогенезе воспаления слизистой оболочки толстой кишки. Введение DSS вызывает образование повреждений слизистой оболочки толстой кишки разной степени выраженности, которое сопровождается повышением синтеза NO и стабильного метаболита NO — цитруллина. Ингибирование NO-синтазы уменьшает высвобождение N0 и образование повреждений толстой кишки. Система NO является одним из патогенетических звеньев развития воспалительной реакции при язвенном повреждении слизистой оболочки толстой кишки. Проведение экспериментальных исследований на животных позволит провести дальнейшее изучение роли системы NO в динамике развития повреждений и защитной роли ингибирования NO-синтазы лекарственными препаратами.
Ключевые слова: толстая кишка; воспаление; NO.
SUMMARY
An experimental study on rats to determine the role of inducible NO production in the pathogenesis of inflammation of the mucous membrane of the colon. The introduction of DSS induces the formation of lesions of the colon mucosa of different severity, which is accompanied by increased synthesis of NO and the stable metabolite of NO - citrulline. Inhibition of NO-synthase reduces the release of NO and the formation of lesions of the colon. The Conduct of experimental research on animals will allow further study of the role of NO in the dynamics of damage development and the medication protective role of inhibition of NO-synthase.
Keywords: colon; inflammation; NO.
Оксид азота (NO) — плейотропная свободнорадикальная сигнальная молекула. В регуляции синтеза этого медиатора задействованы два механизма: кальмодулинзависимый и кальмоду-линнезависимый. От того, какой механизм задействован, зависит количество синтезируемого NO. В физиологических условиях работает кальмодулинзависимый механизм, связанный с постоянно присутствующими конститутивными формами синтазы оксида (NO-C), эндотелиальной и нейрональной [3].
Кальмодулиннезависимый механизм включается под действием цитокинов при патологических состояниях, таких как шок, воспаление и др. В макрофагах, включая их всевозможные разновидности, и гепатоцитах появляется индуцибельная
форма синтазы оксида азота (iNOS), создается высокая концентрация NO, который оказывает токсические действие на атакуемые макрофагами объекты.
Уровень содержания NO коррелирует с активностью заболевания при язвенном колите. Нет ясности, является ли повышенная продукция NO лишь маркером активного заболевания либо свидетельствует об участии вещества в развитии каскада воспалительной реакции.
Проведено большое число экспериментальных исследований для выяснения роли индуцибельной продукции NO, но однозначных данных не получено. Ингибирование iNOS могло вызывать как уменьшение, так и увеличение повреждений слизистой оболочки толстой кишки.
Целью нашей работы является установление участия NO в патогенезе воспаления кишечной стенки при экспериментальном колите у крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на белых крыс, весом 180 - 220 г (средний вес 200 г). Содержание животных в виварии соответствовало санитарным правилам. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами гуманного обращения с животными. Все манипуляции выполняли под общей анестезией с соблюдением требований асептики и антисептики.
Для определения уровня NO в сыворотке крови использовали метод определения нитрита/нитрата (NOx) [2].
Уровень цитруллина определяли в гомогенатах ткани методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Стайер» фирмы «Аквилон» с флуометрическим детектированием в изократическом режиме. Экспериментальный колит вызывали пероральным назначением 5%-ного раствора полимера декстрана натрия сульфата Dextran sodium sulfate (DSS). Для ингибирования NO-синтазы животным внутрибрюшинно вводили
1,0 мл 1%-ного водного раствора Methyleni coeruelei, который является неспецифическим ингибитором индуцибельной и конституциональных форм фермента.
Индекс повреждений (ИП) рассчитывали по системе баллов отдельно по макро- и микроскопической картине.
Внешний осмотр (макро): отек — 1 балл; гиперемия -2 балла; кровоизлияния: точечные — 3 балла; слитые — 4 балла; эрозии: единичные, каждая эрозия — 5 баллов, эрозия с кровотечением — 6 баллов; язва — 7 баллов; язва обширная — 8 баллов. Заживший дефект — 4 балла.
Гистология (микро): 0 — нормальная ткань; 1 балл — инфильтрация мононуклерами или присутствие единичных рассеянных полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) без утолщения собственной пластинки слизистой оболочки или подслизистой оболочки; 2 балла — умеренное увеличение воспалительных клеток с некоторым утолщением кишечной стенки; 3 балла — выраженная инфильтрация ПЯЛ и мононуклеарами, утолщение собственной пластинки слизистой и подслизистой оболочек; 4 алла — эрозии, фокальные язвы слизистой; 5 баллов — распространенные язвы и некроз.
Подсчитывали сумму баллов и определяли среднее значение повреждений на одно животное.
Экспериментальный колит вызывался 5%-ным раствором декстрана натрия сульфата, Dextran sodium sulfate (DSS). Животные были разделены на четыре группы. Первая опытная — О1 (5 животных) — вместо воды в качестве питья получали 5%-ный раствор DSS + в/б введение 1,0 мл физиологического раствора.
Вторая — О2 (5 животных) — вместо воды раствор DSS + в / б введение 1,0 метиленового синего; третья — К1 (5 животных), контрольная группа — обычный режим питания и питья + в / б введение 1,0 мл физиологического раствора; четвертая — К2 (5 животных) — обычный режим питания и питья + в / б введение 1,0 мл метиленового синего. Продолжительность исследования — 7 дней.
На седьмой день животных забивали под эфирным наркозом. Кровь забирали для определения уровня стабильных метаболитов N0 (N0 ). Брюшную стенку вскрывали, извлекали кишечник, осматривали брюшную стенку, серозный покров кишечника. Из макроскопически измененных участков производился забор слизистой оболочки толстой кишки для определения цитруллина. Ткань промывали в физиологическом растворе, промокали фильтровальной бумагой, взвешивали, помещали в 2,0 мл дистиллированной воды и гомогенизировали в стеклянной ступке тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 8000 об /мин. Супернатант сливали в отдельные пробирки для последующего определения цитруллина, все манипуляции проводили на холоде.
Материал для гистологического исследования слизистой толстой кишки также забирали из мест с макроскопически измененной слизистой оболочки толстой кишки.
У контрольных животных биологический материал брали с аналогичных участков слизистой оболочки толстой кишки.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
За время наблюдения у животных из группы с DSS-индуцированными повреждениями слизистой оболочки толстой кишки (колитом) наблюдалась жажда (приходилось доливать 5%-ный раствор Б88), снижение аппетита (на 2 - 5-е стуки оставалось до 50%, на 5 - 7-е сутки — 25% корма), снижение физической активности, животные держались ближе друг к другу. У 5 животных (50%) на 5-е сутки была отмечена примесь крови в оформленном кале. У 3 (30%) наблюдался кашицеобразный стул. Во второй группе животных с DSS-индуцированным колитом, которым ежедневно вводили метиленовый синий, не отмечалось заметного изменения поведения. Корм в кормушке не оставался. Стул оформленный, без примесей. Моча окрашена в синий цвет. В контрольных группах поведение животных обычное, в группе с введением метиленового синего окрашена моча.
МАКРОСКОПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
У всех животных на серозной оболочке усилен сосудистый рисунок конечного отрезка нисходящего
Б >
а
So L 2
о £ р
Щ а
HI £Е
2
a.
Н ч
U
га
L
Б
га
X
<
га
I-
х
ш
2
s
а
ш
с
и
v
m
1-Л
№03/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
нет. Имеется четкая граница между нисходящим отделом, который окрашен метиленовым синим, и прямой кишкой, которая розовая без окраски (рис. 3 см. на цветной вклейке). В двух случаях зажившая эрозия (20%).
Контрольные группы без особенностей, окраски слизистой оболочки толстой кишки метиленовым синим в третьей группе не выявлено (рис. 1 см. на цветной вклейке).
Макроскопический индекс повреждения статистически различался ^ < 0,001) в разных группах животных: в первой опытной группе он составил
11,64 ± 1,04 балла, во второй — 3,52 ± 0,01. В группах контроля макроскопических признаков повреждения не выявлено: ИП — 0 баллов.
Разница между группами с введением и без метиленовой сини у крыс с экспериментальным колитом, вызванным DSS, статистически достоверна— * p < 0,005.
Разница между группами с введением и без метиленовой сини у крыс с экспериментальным колитом, вызванном DSS, статистически достоверна: * p < 0,05.
Таблица 1
МАКРО- И МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОВРЕЖДЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ ПОСЛЕ ПРИЕМА DSS
Макроскопический индекс повреждения, M ± m Гистологический индекс повреждения, M ±m
I гр. (DSS), п = 5 11,64 ± 1,04 6,8 ± 0,2
II гр. (DSS + МС), п = 5 3,52 ± 0,01* 5,0 ± 0,32*
Контроль (физ. р-р + МС), п = 5 0 0
Контроль (физ. р-р), п = 5 0 0
Примечание: *p< 0,001, разница между группами I и II.
Таблица 2
УРОВЕНЬ СТАБИЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ NO У КРЫС
Уровень NOx, мкмоль/ л
без введения ингибитора NOS, M ± m введение метиленового синего, M ± m
DSS (n = 10 + 10) 57,9 ± 4,37 39,2 ± 2,26*
У интактных животных (n = 5) 30,2 ± 2,5
Таблица 3
УРОВЕНЬ ЦИТРУЛЛИНА В ТКАНИ ТОЛСТОЙ КИШКИ У КРЫС
Уровень цитруллина, мкг/г ткани
без введения ингибитора NOS, M ± m введение метиленового синего, M ± m
DSS (n = 5 + 5) 138,1 ± 27,3 64,7 ± 14,5 *
У интактных животных (n = 5) 36,1 ± 6,9
отдела и прямой кишки. У 60% животных через серозную оболочку просвечивают кровоизлияния. Видны отечные, увеличенные в размере пейеровы бляшки.
В первой группе животных слизистая оболочка толстой кишки отечна, складки утолщены, кровоизлияния, эрозии с кровотечением и без него, встречаются единичные эрозии и язвы. Отек и гиперемия дистального отдела нисходящей и прямой кишки встречается у 10 (100%) животных. Единичные кровоизлияния — у 5 (50%). Эрозии на границе нисходящего отдела и прямой кишки — у 6 (60%). Кровоточащие эрозии — у 2 (20) %. Язвы встречались у 2 (20%) животных. У всех животных слизистая оболочка проксимального и дистального отделов прямой кишки легко кровоточит (рис. 2 см. на цветной вклейке).
Вторая группа животных — слизистая отечна в дистальном отделе нисходящей кишки, незначительная гиперемия. В одном случае (10%) была эрозия в проксимальном отделе прямой кишки. Прямая кишка — слизистая оболочка гладкая, отека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, экспериментальное воспроизведение язвенного колита введением DSS вызывает образование повреждений слизистой оболочки толстой кишки разной степени выраженности, которое сопровождается повышением синтеза N0 и стабильного метаболита N0 — цитруллина. Ингибирование МО-синтазы уменьшает высвобождение N0 и образование повреждений толстой кишки. Система
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников Е. Н., Дроздов В. Н., Трубицына И. Е. и др. Взаимосвязь продукции оксида азота с воспалительным повреждением при экспериментальном колите у крыс // Тезисы докл. 8-го съезда НОГР // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2008. — № 1, Прил. № 1. — С. 10 - 12.
2. ЛазебникЛ. Б., Барышников Е. Н., Дроздов В. Н. и др. Оксид азота как маркер воспаления при неспецифическом язвенном колите
N0 является одним из патогенетических звеньев развития воспалительной реакции при язвенном повреждении слизистой оболочки толстой кишки [1; 2].
Проведение экспериментальных исследований на животных позволит провести дальнейшее изучение роли системы N0 в динамике развития повреждений и защитной роли ингибирования К0-синтазы лекарственными препаратами.
и болезни Крона // Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2006. — № 6. — С. 4 - 8.
3. Арзамасцев А.П., Северина И. С., Григорьев Н. Б. и др. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы Ы0-синтаз (химический аспект) // Вестн. РАМН. — 2003. — № 12. — С. 88 - 95.
Б >
а 5 О I- 2 <£ О £ р Щ а
Н1Ё
Я^
2 ч
I- ч
и
га
I.
Б
га
х
<
га
I-
х
ш
2
а
ш
с
и
V
т
О
