Потребление нефти Сорочинского месторождения углеводород-окисляющими штаммами Gordona terrae и Acinetobacter sp Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

Учредители:

Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН

(электронный журнал)

2013 * № 1

On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru

© О.А. Гоголева, 2013 УДК 57.083.133 О.А. Гоголева

ПОТРЕБЛЕНИЕ НЕФТИ СОРОЧИНСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ УГЛЕВОДОРОД-ОКИСЛЯЮЩИМИ ШТАММАМИ GORDONA TERRAE И ACINETOBACTER SP.

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург, Россия

Изучена способность углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae и Acinetobacter sp. к деструкции нефти Сорочинского месторождения, а также динамика ката-лазной активности в процессе потребления углеводородов. Экспериментально установлено, что по мере потребления углеводородов наблюдается снижение каталазной активности штаммов-деструкторов. Установлена прямая зависимость между уровнем каталазной активности углеводородокисляющих бактерий и снижением концентрации нефти в среде. Полученные результаты могут иметь практическое значение.

Ключевые слова: углеводородокисляющие бактерии, численность, деструкция нефти, каталазная активность.

O.A. Gogoleva

CONSUMPTION OF OIL FROM SOROCHINSK FIELD BY THE HYDROCARBON-OXIDIZING STRAINS GORDONA TERRAE AND ACINETOBACTER SP.

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia

The ability of Gordona terrae and Acinetobacter sp. to consume the oil from Sorochinsk field is studied. The dynamics of catalase activity during hydrocarbon consumption is examined. During hydrocarbon destruction the decreasing of catalase activity of strains-destructors is established experimentally. A direct relationship between catalase activity level of hydrocarbon-oxidizing microorganisms and the decreasing of oil concentration in the medium is established. These results may have practical significance.

Ключевые слова: hydrocarbon_oxidizing bacteria, quantity, destruction of oil, catalase activity.

Введение.

Поступление в окружающую среду, как нефти, так и продуктов ее переработки ежегодно приводит к увеличению антропогенно загрязненных территорий. В связи с этим особую значимость приобретает изучение микроорганизмов, способных осуществлять биодеструкцию углеводородов.

Для аэробных микроорганизмов важнейшим фактором успешного окисле-

ния нефти и нефтепродуктов является достаточное содержание кислорода, необходимого для преобразования нефтяных фракций [1]. Кислород участвует в процессах окисления углеводородов, так как последние не окисляются непосредственно дегидрогеназами бактерий. Для их разложения необходим начальный этап активации - превращение с участием оксигеназ и кислорода в спирты [2, 3].

Окисление углеводородов происходит по свободно-радикальному механизму и является цепной реакцией, инициатором которой выступает кислород [4, 5]. Первичным молекулярным продуктом является гидропероксид или пероксид. Образование свободных радикалов из продуктов, образующихся в цепной реакции окисления, в частности пероксидов, приводит к ускорению цепного окисления [6, 7]. В защите клеток от действия пероксидов принимает участие каталаза, однако данных об изменении каталазной активности в литературе нет, поэтому целью нашего исследования стало изучение динамики каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе потребления нефти.

Материалы и методы.

Для экспериментальных исследований были отобраны чистые культуры углеводородокисляющих бактерий Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 и Gordona terrae ИКВС № 19, выделенные нами ранее из природной среды и содержащиеся в лабораторных условиях.

Для выращивания культуры Acinetobacter sp. использовали мясопептон-ный агар, культивирование штамма G. terrae осуществляли на модифицированном агаре Чапека [8]. Культуры выращивали при температуре 25-27°С, в течение 24 часов. Через 24 часа из выросших культур готовили взвесь по стандарту мутности БАК-5 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Культивирование бактерий с нефтью Сорочинского месторождения (Со-рочинский район Оренбургской обл.) проводили на жидкой минеральной среде Раймонда [8]. Колбы (V 500 мл), заполняли средой Раймонда в объеме 250 мл, в

-5

которую вносили микробную взвесь в количестве 1 см3 так, чтобы конечная концентрация бактерий составила 106 кл/см3. В качестве единственного источ-

-5

ника углерода в среду добавляли 1 см3 нефти Сорочинского месторождения,

-5

при этом конечная концентрация во флаконе составляла 750,0±0,5 мг/дм . Эксперимент поводили в течение 35 суток, инкубацию образцов осуществляли при температуре 25-27°С в условиях естественного освещения. Динамику численности бактерий учитывали чашечным методом. Подсчет выросших на чашках

колоний осуществляли в автоматическом режиме с помощью счетчика колоний ProtoCOL HR (Великобритания).

Содержание нефти в опытных образцах определяли в аккредитованном испытательном центре ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» с помощью флуориметрического метода на жидкостном анализаторе «Флюорат - 02». Для этого 100 мл культуральной жидкости переносили в делительную воронку, отбирали 10 мл гексана и ополаскивали им сосуд, в котором находилась проба, затем гексан помещали в делительную воронку. Смесь перемешивали 30 сек, отстаивали до появления прозрачного верхнего слоя, который отделяли, помещали в кювету и измеряли концентрацию нефти в экстракте. Водную фазу отбирали в цилиндр и точно фиксировали ее объем.

Концентрацию нефти рассчитывали по формуле:

Хпр=( ХИзмХ Vrx К1)/ V^,

где:

Хпр - концентрация нефти в пробе воды, мг/мл;

Хизм - концентрация нефти в растворе гексана, измеренная на приборе,

мг/л;

Vr - объем гексана, взятый для экстракции, мл;

Vnp - объем пробы, мл;

К1 - степень разбавления экстракта.

Содержание нефти в исследуемом образце выражали в процентах от исходной концентрации.

Наличие и уровень каталазной активности углеводородокисляющих бактерий определяли фотометрически по методике Бухарина О.В. с соавт. [9]. Для этого исследуемые штаммы микроорганизмов высевали из опытных образцов на мясопептонный агар или агар Чапека, не содержащих нефть. Посевы инкубировали в течение 2 суток при температуре 25°С, затем из выросших колоний делали взвесь с оптической плотностью 0,2 усл. ед. (при длине волны 492 нм).

-5

К 0,2 мл полученной взвеси исследуемого штамма добавляли 1 см свежеприготовленного 0,0125М раствора пероксида водорода и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, реакцию разложения пероксида водорода каталазой останавливали добавлением 5 капель 2Н раствора соляной кислоты. Затем добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,025М раствора иодида калия, тщательно

перемешивали и осаждали клетки исследуемого штамма центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g. Через 10 мин после центрифугирования замеряли светопоглощение образовавшегося в надосадочной жидкости комплекса йод -йодид калия (при длине волны 492 нм в плоскодонном полистироловом 96-луночном планшете с ячейкой объёмом 0,25 мл на фотометре «ИФА-ОЭП»).

Расчет активности каталазы проводили по формуле:

Акат=(12.5х(1- ОДоп/ ОДк)/Тх ОДм),

где:

Акат - активность каталазы в микромоль/минЮД;

ОДоп - оптическая плотность комплекса йод - йодид калия в опыте;

ОДк - оптическая плотность комплекса йод-йодид калия в контроле, полученном путём смешивания исходных объёмов растворов пероксида водорода, йодида калия и соляной кислоты;

Т - время инкубации исследуемой культуры с пероксида водорода;

ОДм - оптическая плотность микробной взвеси, взятой для определения каталазной активности;

Каталазную активность исследуемой культуры бактерий выражали в процентах от исходного уровня.

Результаты и обсуждение.

Динамика численности микроорганизмов при деструкции дизельного топлива. Максимальные значения численности монокультуры штамма G. terrae (контроль 1) при потреблении нефти Сорочинского месторождения наблюдались к 12 суткам культивирования, при этом численность бактерий увеличивалась на один порядок по сравнению с исходными значениями. К концу эксперимента (35 сутки) численность незначительно снижалась (рис. 1).

При потреблении нефти Сорочинского месторождения монокультурой штамма Acinetobacter sp. (контроль 2) численность бактерий увеличивалась более чем на два порядка, достигая максимальных значений к 12 суткам, после чего наблюдалось резкое снижение численности Acinetobacter sp. (контроль 2), которая к 35 суткам возвращалась к исходным значениям.

При совместном культивировании штаммов Acinetobacter sp. и G. terrae на нефти Сорочинского месторождения численность штамма G. terrae, также как и в контроле 1, достигла максимальных значений к 12 суткам, увеличиваясь на один порядок, а затем постепенно снижаясь. Численность Acinetobacter sp. в

условиях сокультивирования с О. ієгтє достигла максимальных значений быстрее, чем в монокультуре (контроль 2), и уже к 6 суткам увеличилась более чем на два порядка. После 6 суток эксперимента численность ЛстєїоЬасїєг зр. плавно снижалась вплоть до 35 суток.

9

с;

□ ш

О

О)

“ 8

7

6 5

1 6 12 23 35 сутки

-----1еггае (контроль 1) ----Аапе1оЬас1ег ер.(контроль 2)

-----1еггае (опыт) ----Аапе1оЬас1ег ер. (опыт)

Рис. 1. Динамика численности (1§КОЕ/мл) углеводородокисляющих

бактерий при потреблении нефти Сорочинского месторождения.

Изменение численности Лст&оЪа&вг зр. и О. 1вггав в процессе деструкции нефти Сорочинского месторождения свидетельствует о различной скорости потребления углеводородов исследуемыми бактериями. Выявленные различия в скорости роста исследуемых культур бактерий в условиях их сокульти-вирования позволяют предположить, что штаммы микроорганизмов потребляют разные фракции нефти.

Потребление микроорганизмами нефти Сорочинского месторождения. На следующем этапе эксперимента проведено определение интенсивности потребления нефти исследуемыми штаммами бактерий. Первоначальная концен-

-5

трация нефти в среде составляла 750,0±0,5 мг/дм , что соответствовало 100% содержания нефти в исходной среде. Для учета испаряемости нефти был поставлен контроль 3 - минеральная среда Раймонда с добавлением нефти Соро-чинского месторождения без культур микроорганизмов.

Наиболее интенсивное снижение углеводородов, в первые 12 суток, на-

блюдали в эксперименте (контроль 2) со штаммом ЛЫпе^ЬаМег зр. (рис. 2). Уже к шестым суткам содержание нефти в опыте с ЛсШоЬааег зр. составило 66,8±2,3% от первоначального уровня, затем интенсивность потребления нефти уменьшалась и к 35 суткам содержание нефти составило 56,0±2,6 % от первоначального уровня. В опытах со штаммом О. 1еггае (контроль 1) динамика потребления нефти была иной. К шестым суткам данные бактерии потребили углеводородов меньше, чем ЛсШоЬа^ет зр., но после 12 суток интенсивность их потребления нефти продолжала увеличиваться, и к концу эксперимента содержание нефти в среде составило 29,9±2,6% от первоначального уровня.

-е-

ф

100

90

80

о.

с[ 70

о

о

60

50

40

30

20

\ \

\ \ \ 4 ч * • " ^

VI ' і \ 1 \

т

]

N

т

1 6 ------Єогсіопа Іеггае (контроль 1)

і- -сокультивирование

12 23 35 СУТКИ

-------АсіпеїоЬасІег ер. (контроль 2) у

— • • контроль 3

Рис. 2. Содержание нефти (%) Сорочинского месторождения при разных вариантах эксперимента.

В условиях совместного культивирования штаммов ЛсіпєїоЬасїєг зр. и О. їєггає на нефти Сорочинского месторождения интенсивность микробного потребления углеводородов в первые 12 суток была сопоставима с контролем 2 (штамм ЛсіпєїоЬасїєг зр.), а после 12 суток - с контролем 1 (штамм О. їєггає). Подобная динамика снижения углеводородов в среде культивирования, очевидно, связана с потреблением разных фракций нефти исследуемыми штамма-

ми, что особенно ярко выражено при их совместном культивировании.

Таким образом, установлено, что в лимитирующих условиях оба исследованных штамма бактерий способны к потреблению нефти Сорочинского месторождения, однако по сравнению с ЛсШоЪаавг зр. более высокую убыль углеводородов обеспечивала монокультура G. terrae (контроль 1), а также ассоциация штаммов О. 1вггав и Лст&оЪа&вг зр.

Динамика каталазной активности микроорганизмов в процессе деструкции нефти Сорочинского месторождения. В ходе эксперимента определялась динамика каталазной активности исследуемых штаммов бактерий в условиях потребления нефти. Исходная каталазная активность у Лст&оЪа&вг зр. составила 4,8±0,4 усл.ед., а у О. 1вггав - 3,3±0,06 усл.ед., что в обоих случаях соответствовало 100%. В эксперименте каталазная активность штамма Лст&оЪа&вг зр., как в монокультуре, так и при сокультивировании, была выше, чем у штамма О. 1вггав (рис. 3).

110

100

90

80

70

60

50

> /// / к / /

Чг: V \ \ \ у г /

1 6 ------1еггае (контроль 1)

------Согс1опа1еггае (опыт)

12 23 35

------Асте1оЬас1ег эр. (контроль 2) СУТКИ

■ Асте1оЬас1ег ер.(опыт)

Рис. 3. Динамика каталазной активности (%) штаммов микроорганизмов при потреблении нефти Сорочинского месторождения.

При совместном культивировании штаммов на нефти Сорочинского месторождения снижение каталазной активности штаммов происходило более интенсивно, чем в экспериментах с монокультурами. Снижение каталазной активности у Лст&оЪа&вг зр. (контроль 2) к 6 суткам произошло на 19,2±4,0% от

исходного уровня, тогда как в эксперименте при сокультивировании бактерий уменьшение у них каталазной активности к этому сроку было более интенсивным - на 28,1±2,3 % от исходного уровня. Максимальное снижение каталазной активности у Acinetobacter sp. наблюдали на 12 сутки, как в контроле (на 30±2,8 %), так и в опыте (на 32,3±3,4 %).

У штамма G. terrae разница между снижением каталазной активности в опыте и контроле наблюдали после 12 суток. В эксперименте при сокультивировании бактерий каталазная активность G. terrae после 12 суток уменьшалась, а к 23 суткам ее снижение достигало 22,3±3,5% от исходного уровня, тогда как в контроле оно составило 38,9±3,1%. Следует отметить, что максимальное снижение каталазной активности штамма G. terrae регистрировали на 12 сутки как в контроле (на 41,0±3,7%), так и опыте (на 38,9±2,9 %).

Иначе говоря, при совместном культивировании Acinetobacter sp. и G. terrae в первые шесть суток приоритет имеет Acinetobacter sp., что подтверждается динамикой численности бактерий, интенсивностью снижения у них ката-лазной активности и данными химического анализа.

Анализ корреляционной зависимости между снижением каталазной активности штаммов бактерий (доли от исходного уровня) и снижением концентрации нефти Сорочинского месторождения в среде культивирования (доли от исходного уровня) показал сильную положительную связь между этими показателями для исследованных штаммов Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 (г=0,87; р=0,05) и Gordona terrae ИКВС № 19 (г=0,90; р=0,05).

В результате исследования установлено, что исследуемые штаммы G. terrae и Acinetobacter sp., как в монокультурах, так и ассоциации, могут использовать нефть Сорочинского месторождения в качестве единственного источника углерода и энергии. При этом они, вероятно, потребляют различные углеводороды, входящие в ее состав, о чем свидетельствуют данные, полученные в ходе эксперимента. Представленные результаты использованы при разработке способа выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов [10].

(Работа выполнена по проекту № 12-П-4-1039 Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы

развития» и проекту молодых ученых и аспирантов УрО РАН № 13-4-НП-401)

ЛИТЕРАТУРА.

1. Миронов О.Г. Бактериальная трансформация нефтяных углеводородов в прибрежной зоне морей. Морской экологический журнал. 2002. Т. 1. № 1: 56-66.

2. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами. Успехи современной микробиологии. 2006. Т. 126. № 3: 285296.

3. Maeng J.H., Sakai Y., Tani Y., Kato N. Isolation and characterization of a novel oxygenase that catalyzes the first step of n-alkane oxidation in Acinetobacter sp. strain M-l. J. Bacteriol. 1996. V. 178. №. 13: 3695 - 3700.

4. Эммануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. М.: Высш. шк., 1984. 463 с.

5. Мочалова О.С., Антонова Н.М., Гурвич Л.М. Роль диспергирующих средств в процессах трансформации и окисления нефти в водной среде. Водные ресурсы. 2002. Т. 29. № 2: 221-225.

6. Rojo F. Degradation of alkanes by bacteria. Environmental Microbiology. 2009. V. 11 (10): 2477-2490.

7. Петров А.А. Углеводороды нефти. М.: Наука, 1984. 264 с.

8. Кузнецов С.И., Дубинина Г.А. Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 288 с.

9. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Забирова Т.М., Иванов Ю.Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р. Бюлл. эксп. биол. 2000. Т. 130. № 7: 80 - 82.

10. Немцева Н.В., Гоголева О.А., Бухарин О.В. Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. Патент РФ на изобретение № 2426781 от 20.08.2011. Бюл. 2011. №23.

Поступила 27.03.2012

(Контактная информация: Гоголева Ольга Александровна - к.б.н., старший научный

сотрудник лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного

симбиоза; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел. (3532) 775417; E-mail: olik-

[email protected])