CC BY
72
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2
УДК 543:615.33
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕФЕПИМА В ВОДНЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
Е. Г. Кулапина1, О. И. Кулапина2, В. А. Каренко1
Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского E-mail: kulapinaeg@mail.ru
Разработаны потенциометрические сенсоры на основе органического ионообменника цефепим-тетрафенилборат, чувствительные к цефепиму. Установлен оптимальный состав мембран. Исследованы поверхностные и объемные свойства мембран сенсоров. По стационарным сопротивлениям оценена константа диссоциации электродноактивного компонента в фазе мембраны. Показана возможность ионометрического определения це-фепима в водных и биологических средах.
Ключевые слова: цефепим, потенциометрические сенсоры, водные и биологические среды.
Potentiometric Sensors for Determination of Cefepime in Water and Biological Environments
E. G. Kulapina, O. I. Kulapina, V. A. Karenko
Potentiometric cefepime sensors based on an organic ion-exchanger such as cefepime with tetraphenylborate are developed. The optimum membrane composition is established. The surface and volume properties of membranes are investigated. The constant of dissociation of the ion-exchanger in a membrane phase is calculated by stationary resistance. Potentiometric determination of cefepime in water and biological environments is present.
Key words: cefepime, potentiometric sensors, water and biological environments.
DOI: 10.18500/1816-9775-2016-16-2-138-143
Введение
С момента открытия цефалоспоринов - одного из наиболее популярных классов антибиотиков - прошло чуть более 65 лет. За эти годы они по праву заняли достойное место в арсенале средств борьбы человека с инфекциями [1].
Основа всех цефалоспоринов представлена дигидротиазолидиновым кольцом, соединенным с Р-лактамным кольцом. Синтезировано более 50 лекарственных средств этой группы. В схемах начальной эмпирической терапии инфекций различной локализации в большинстве случаев отдается предпочтение лекарственным средствам цефалоспоринового ряда, поскольку они имеют широкий спектр антимикробной активности, хорошие фармакокинетические характеристики, низкую токсичность и хорошую переносимость, хорошо сочетаются с другими антибактериаль-
ными лекарственными средствами, удобны в применении и дозировании.
Цефалоспорины IV поколения относятся к высокоэффективным антибиотикам с биполярной структурой. Цефемовое ядро этих антибиотиков несет отрицательный заряд, четвертичный азот циклопентопиридиновой группы - положительный заряд, что придает молекуле структуру цвиттер-иона [2].
Цефалоспорины IV поколения (цефепим и цефпиром) имеют наиболее широкий спектр активности среди цефалоспоринов. Они являются парентеральными лекарственными средствами, частично противостоят гидролизу плазмидными Р-лактамазами [3, 4].
Важное свойство цефепима заключается в том, что он часто сохраняет активность даже в отношении штаммов, резистентных к цефа-лоспоринам III поколения. Цефепим является парентеральным лекарственным средством, проявляет высокую активность в отношении неферментирующих микроорганизмов, действует на грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы, способен быстро поступать внутрь микробной клетки [3, 4].
Несмотря на все достоинства цефалоспо-риновых антибиотиков IV поколения, авторами [5] опубликован обзор, в котором продемонстрировано увеличение смертности больных с нейтропенической лихорадкой при лечении цефепимом по сравнению с терапией другими Р-лактамными антибиотиками. Установлено увеличение смертности больных с инфекциями разных локализаций при лечении цефепимом на 26 % по сравнению с терапией другими Р-лактамными антибиотиками [6].
Представляется разумным воздерживаться от использования цефепима при нейтропениче-ской лихорадке и, по-видимому, при инфекциях кожи и мягких тканей, в то время как этот антибиотик остается действенным средством лечения больных с пневмониями и инфекциями других локализаций как в виде монотерапии, так и, при
© Кулапина Е. Г, Кулапина О. И., Каренко В. А., 2016
Е. Г. Кулапина и др. Потенциометрические сенсоры для определения цефепима
необходимости, в сочетании с другими антибиотиками (например, метронидазолом) [1].
Для определения цефалоспориновых антибиотиков в различных лекарственных препаратах, фармацевтических составах, в биосредах используются электрохимические, спектроскопические, хроматографические, микробиологические, иммунологические методы, капиллярный электрофорез [7, 8].
Одним из перспективных методов определения антибиотиков в фармацевтических формах и биологических жидкостях является прямая потенциометрия и потенциометрическое титрование с использованием различных сенсоров [7, 8].
Предложены ионоселективные электроды на основе органических ионообменников; в качестве противоиона использовался тетраде-циламмоний. Определены основные электрохимические характеристики потенциометрических сенсоров: интервал линейности, время отклика электрода, дрейф потенциала, предел обнаружения, коэффициенты потенциометрической селективности. Показана возможность применения предложенных сенсоров для определения некоторых цефалоспориновых антибиотиков в фармацевтических формах и биологических субстратах (кровь, плазма, смешанная слюна); предел обнаружения 10-6 М [7].
Настоящее исследование посвящено разработке нового потенциометрического сенсора с пластифицированной мембраной, чувствительного к цефепиму, оценке его электроаналитических характеристик в водных средах и ротовой жидкости.
Экспериментальная часть
Цефепим. Коммерческое название препарата: «Цефепим»; фирма-производитель: «Линкольн Парентеральс», Индия; форма выпуска: порошок для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения; состав: 1 флакон содержит цефепима гидрохлорида в пересчете на цефепим - 1 г.
Раствор цефепима 110-2 М концентрации готовили растворением навески препарата m = 0,1200 г в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 25 мл. Рабочие растворы концентрацией 110-3 - 110-6 М готовили последовательным разбавлением исходных.
Исследуемые мембраны содержали в качестве инертной матрицы поливинилхлорид, растворитель-пластификатор (дибутилфталат) и электродноактивный компонент цефепим-те-трафенилборат (cefep-ТФБ). С учетом сложности состояния цефепима необходимо было создать кислотность, при которой цефепим существует в виде катиона (рН = 2), поэтому синтез электродноактивного компонента (ЭАК) проводили из кислого раствора. Получали ЭАК смешением 50 мл 0,01 М ТФБ, 50 мл 0,01 М раствора цефепима и 5 мл 0,1 М HCl в стеклянном стакане. Осадок выпадал в течение 1 суток. Затем осадок центрифугировали и высушивали в сушильном шкафу при температуре 30°С в течение 2-3 часов.
Попытки синтезировать соединение цефе-пим-катионы тетраалкиламмония не привели к положительным результатам, так как в щелочной и нейтральной средах цефепим существует в виде цвиттер-иона [9].
Приготовление пластифицированных мембран осуществляли по следующей методике: навески ЭАК и растворителя-пластификатора дибутилфталата (ДБФ) помещали в бюкс, затем при перемешивании на магнитной мешалке прибавляли 1,5 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и постепенно - навеску поливинилхлорида (ПВХ). Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси (соотношение ПВХ: ДБФ по массе равно 1:3). Полученную мембранную композицию выливали в чашку Петри и оставляли на воздухе до полного удаления ТГФ на строго горизонтальной поверхности для получения мембраны одинаковой толщины. Мембраны имели вид эластичных пленок и хранились над парами растворителя-пластификатора. Изготовлены серии мембран с концентрацией ЭАК 1-5%. В работе использовались электроды с пластифицированными мембранами с жидкостным заполнением.
К отшлифованному торцу поливинилхлоридной трубки приклеивали селективные мембранные диски, диаметр которых соответствовал диаметру трубки. Клей получали растворением 0,5 г ПВХ и 0,25 г ДБФ в 5 мл ТГФ. После высыхания клея внутрь трубки заливали 1,5 мл стандартного 110-3 М раствора хлорида натрия и 1,5 мл 110-3 М раствора цефепима (соотношение по объему 1:1).
Химия
139
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2
Подготовка электродов к работе. Ионоселективные электроды требуют предварительного кондиционирования, так как отклик некондиционированных электродов замедлен и плохо воспроизводим. Перед работой электроды кондиционировали в 10-3 М растворе антибиотика в течение суток.
Электрохимические характеристики изучали методом ЭДС с использованием элемента с переносом:
Л§,Л§С1,КС1нас /исслед. раствор/мембрана/ внутр.раствор/AgCl, Ag
Контакт между полуэлементами осуществляли с помощью солевого мостика, заполненного насыщенным раствором хлорида калия.
ЭДС цепи измеряли на иономере И-160 М при температуре 20±3° С (погрешность измерения ЭДС ±1 мВ); электрод сравнения - стандартный хлоридсеребряный ЭВМ-1МЗ. Измерения ЭДС в анализируемых растворах проводили от меньшей концентрации к большей. Для ускорения достижения значения потенциала внешний раствор перемешивали на магнитной мешалке.
Время установления стационарного потенциала электродов проводили при скачкообразном изменении концентраций лекарственных веществ на порядок. Измерения проводили в интервале концентраций 110-4 - 110-3 М от растворов с меньшей концентрацией к растворам с большей концентрацией.
Контроль рН растворов проводили на рН-метре рХ 150 мП со стеклянным (ЭСЛ-63-07) и хлоридсеребряным (ЭВМ-1МЗ) электродами.
Произведение растворимости (Ks) определяли методом потенциометрического титрования. Точку эквивалентности находили графически.
Для исследования объемных свойств мембран под током была использована четырехэлектродная система, состоящая из пары платиновых (токопроводящих) и пары хлоридсеребряных (регистрирующих) электродов. Измерения проводились в гальваностатическом режиме при силе тока 5 мкА в течение 3 часов. Направление тока поляризации изменялось каждый час. При этом оценивалось падение напряжения на мембране при прохождении через ячейку постоянного тока и электрическое сопротивление мембран, контактирующих с раствором цефепима различных концентраций.
Результаты и их обсуждение
Электродные функции сенсоров выполняются в растворах цефепима в интервале концентраций 110-2 - 110-4 М с угловыми
коэффициентами (52±4) мВ/рС. Потенциалопределяющей является реакция ионного обмена на границе раздела мембрана - раствор с предварительной диссоциацией ионообменника в фазе мембраны:
(Cefep) ТФБ-СФ?+м
► Cefep+ + ТФБ-Cefep
р-р
При проведении серийных анализов важным фактором, определяющим возможность применения ИСЭ, является время отклика на изменение концентрации раствора. Показано, что стационарное значение потенциала сенсоров на основе Cefep-ТФБ с СЭАК = 1,3,5% устанавливается соответственно через 100, 80, 60 с (Ccefep = 110-4 М, 110-3 М).
Коэффициенты потенциометрической селективности, определенные методом биионных потенциалов, по отношению к некоторым цефа-лоспориновым антибиотикам оказались равными 6,210-2 (цефотаксим, цефуроксим); 6,910-2 (цефалексин).
Дрейф потенциала составил 2-4 мВ/сут. Как правило, дрейф потенциала ИСЭ обусловлен изменением в структуре поверхности электрода и растворением ионообменника в исследуемом растворе.
Для определения срока службы снимались электродные функции сенсора на основе Cefep-ТФБ (Сэак = 3%) в свежеприготовленных растворах цефепима на протяжении длительного времени и по изменению угла наклона электродной функции судили о чувствительности данного электрода к антибиотику. Срок службы сенсоров составил 2-3 мес.
Оценены некоторые физико-химические характеристики электродноактивных компонентов в водных средах и фазе мембраны. Стехиометрическое соотношение компонентов и растворимость ионных ассоциатов определяли методом потенциометрического титрования 110-3 М раствора ТФБ 110-2 М раствором цефепима и 110-3 М раствора цефепима 110-2 М раствором ТФБ. В качестве индикаторного электрода использовался сенсор на основе Cefep-ТФБ (Сэак = 3%). Пример кривой потенциометрического титрования представлен на рис. 1.
Соотношение реагирующих компонентов в органическом ионообменнике оказалось равным 1:1.
Для оценки величины произведения растворимости (Ks) ионного ассоциата использован подход потенциометрического титрования по реакции осаждения с использованием электрода,
140
Научный отдел
Е. Г. Кулапина и др. Потенциометрические сенсоры для определения цефепима
AE/AV
Рис. 1. Дифференциальная кривая титрования 10 мл 110 3 М раствора ТФБ 110-2 М раствором цефепима
обратимого к титруемому иону и с учетом того, что электрод сохраняет функцию на титруемый ион после точки эквивалентности [10]. Величину Ks труднорастворимых соединений рассчитывали по формуле
Е-Е о
К , = 10 S
Сшт.(% _ Ц;.т.т.)
Vi-V2
где Е - значение потенциала, найденное по кривой титрования после к.т.т., мВ; Е^) - начальная величина потенциала при ^нт = 0, мВ; S - угловой коэффициент электродной функции, мВ/рС; V - объем аликвоты , взятой для титрования, мл; V2 - объем титранта после к.т.т.; ^.тт. -объем титранта в к.т.т., мл; С - концентрация титранта, моль/л.
Произведение растворимости оказалось равным (9,8±0,1) 10-9.
С целью получения некоторых данных
0 транспорте ионов в мембранах на основе Cefep-ТФБ была определена зависимость сопротивления мембран от времени при различных концентрациях электродноактивного компонента. Электрическое сопротивление мембраны определяли по закону Ома:
R = U/I, Ом,
где U - падение напряжения на мембране, В;
1 - сила тока, А.
Временные зависимости сопротивления мембран на основе Cefep-ТФБ представлены на рис. 2.
R, МОм
Рис. 2. Зависимость сопротивления мембран от времени при смене полярности в 110-3 М растворе цефепима; цифры на кривых соответствуют концентрации ЭАК
Химия
141
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2
При увеличении концентрации электродноактивных компонентов, стационарное сопротивление мембран уменьшается, что связано с увеличением концентрации ионообменных центров в фазе мембраны (рис. 3).
По величинам стационарного сопротивления графическим методом Краусса-Брея [11] рассчитывали кажущиеся константы диссоциации электродноактивных соединений в фазе мембраны. При этом полагали, что равновесие между ионами и ассоциатами при низких концентрациях подчиняется закону разбавления Оствальда: Кд=а2с/( 1 - а2), где с - общая молярная концентрация соединения, а - степень
диссоциации [12]. Выражая а через относительную эквивалентную электропроводность Х/Х0 (X - эквивалентная электропроводность, Х0 - предельная электропроводность), получаем следующее выражение для константы диссоциации: Кд = cX2/(Xo2(1 - X/Xo)). Константу диссоциации мембранноактивных компонентов оценивали с помощью метода Фуосса-Крусса, преобразуя последнее выражение как 1/X = 1/Xo +(Хс) / Кд Xо2 [12]. Рассчитанная таким образом кажущаяся константа диссоциации органического ионообменника Cefep-ТФБ в мембранной фазе оказалась равной (4,0 ± 0,2) 10-3.
R, МОм
Рис. 3. Зависимость стационарного сопротивления мембран на основе Cefep-ТФБ от концентрации электродноакгивного компонента в мембране
Исследованы также зависимости сопротив- ности при различной концентрации цефепима
ления мембраны от времени при смене поляр- (рис. 4).
R, МОм
t, с
Рис. 4. Зависимость сопротивления мембраны на основе Cefep-ТФБ от времени при различной концентрации цефепима, М: 110-4 (1); 110-3 (2); 110-2 (3): СЭДК = 4%
142
Научный отдел
Е. Г. Кулапина и др. Потенциометрические сенсоры для определения цефепима
Стационарное сопротивление мембран уменьшается с возрастанием концентрации цефепима в примембранных растворах, что свидетельствует о проникновении антибиотика в среду мембран (рис. 5).
Поведение сенсора на основе Cefep-ТФБ на фоне ЖРП
Пробоподготовка жидкости ротовой полости (ЖРП). Сбор ЖРП производили не ранее, чем через 15 мин после еды, перед сбором
рекомендуется прополоскать ротовую полость. В чистые полиэтиленовые пробирки собирали ЖРП, центрифугировали ее в течение 10 мин, при скорости 3500 об/мин для осаждения белков. Надосадочную жидкость отбирали в ячейку (3— 5 мл), погружали индикаторный и хлоридсе-ребряный электроды и при перемешивании измеряли величину ЭДС. Предварительно индикаторный электрод кондиционировали в ЖРП без антибиотика.
R, МОм
0 1 2 3 4 5 РС
Рис. 5. Зависимость стационарного сопротивления мембраны на основе Cefep-ТФБ с от концентрации растворов цефепима. СЭАК = 4%
Интервал линейности электродной функции составил 110-2 — 110-4 М, при этом уменьшается угловой коэффициент, что свидетельствует о белковом отравлении поверхности сенсора.
Проведено определение цефепима на фоне ЖРП в модельных растворах; относительная погрешность составляет 8—10%.
Работа выполнена в рамках Госзадания Минобрнауки РФ в сфере научной деятельности (базовая часть) по Заданию № 4.121.22.2014/к, шифр «Флуорофор».
Список литературы
1. Березняков И. Г. Цефепим сегодня и завтра // Болезни и антибиотики. 2011. Т. 5, № 2. С. 95—103.
2. Яковлев С. В. Цефепим — цефалоспориновый антибиотик IV поколения // Антибиотики и химиотерапия. 1999. № 7. С. 32—37.
3. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М. : Наука, 2004. 528 с.
4. Богомолова Н. С., Орешкина Т. Д., Большаков Л. В. Перспективы использования цефалоспоринового антибиотика четвертого поколения в хирургии // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 48, № 7. С. 20—22.
5. Paul M., Yahav D., Fraser A., Leibovici L. Empirical antibiotic monotherapy for febrile neutropenia : syste-
matic review and meta-analysis of randomized controlled trials // J. Antimicrob. Chemother. 2006. Vol. 57. Р 89—176.
6. Yahav D., Paul M., Fraser A., Sarid N, Leibovici L. Efficacy and safety of cefepime : a systematic review and meta-analysis // Lancet Infect. Dis. 2007. Vol. 7. Р 48—338.
7. КулапинаЕ. Г., Снесарев С. В., Кулапина О. И., Баринова О. В. Некоторые проблемы обеспечения избирательности и чувствительности определения антибиотиков в лекарственных и биологических средах // Проблемы аналитической химии : в 20 т. Т. 16. Фармацевтический анализ. М. : Аргамак-Медиа. 2013. С. 326—361.
8. Кулапина О. И., Кулапина Е. Г. Антибактериальная терапия. Современные методы определения антибиотиков в лекарственных и биологических средах. Саратов : Сарат. источник, 2015. 91 с.
9. Алексеев В. Г. Бионеорганическая химия пенициллинов и цефалоспоринов. Тверь : Твер. гос. ун-т, 2009. 104 с.
10. Марьянов Б. М. Методы линеаризации в инструментальной титриметрии. Томск : Изд-во Томск. ун-та, 2001. 154 с.
11. Фиалков Ю. Я., Житомирский А. Н., Тарасенко Ю. А. Физическая химия неводных растворов. Л. : Химия, Ленингр. отд-ние, 1973. 376 с.
12. Кулапина Е. Г, Барагузина В. В., Кулапина О. И., Чернов Д. В. Электрохимические свойства мембран на основе ассоциатов Р-лактамных антибиотиков с тетрадециламмонием // Электрохимия. 2005. Т. 41, № 8. С. 981—986.
Химия
143
