CC BY
45
УДК 616.12:611.018.835:611.89:611.013.395 Ю. В.Сілкіна
ПОСЛІДОВНІСТЬ ГІСТОГЕНЕТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ ПРОВІДНИХ КАРДІОМІОЦИТІВ СИНУСНО-ПЕРЕДСЕРДНОГО ВУЗЛА ЕМБРІОНАЛЬНОГО СЕРЦЯ ЛЮДИНИ
Дніпропетровська державна медична академія (м. Дніпропетровськ)
Робота виконана у рамках наукової теми кафедри гістології Дніпропетровської державної медичної академії №°0105Ш07837 «Аналіз нормального й аномального гістогенезу тканинних компонентів серцево-судинної системи людини та експериментальних тварин».
Вступ. Гістогенетичні процеси, які відтворюються на території синусно-передсердного вузла (СПВ) протягом пренатального періоду кардіогенеза людини, регулюються специфічними транскрипційними факторами і мають певну послідовність [3, 9]. Зниження активності одного гістогенетичного процесу ініціює зростання активності іншого, і це не є специфічним саме для провідної системи, що, однак, не зменшує важливості вивчення алгоритму перебудови структурних елементів провідної системи в аспекті динаміки перебігу гістогенетичних реакцій шляхом встановлення специфічних гістохімічних рис структурних елементів СПВ при реалізації програми провідними кардіоміоцитами з метою встановлення закономірностей розвитку і рівня взаємного впливу між міоцитарним та іншими клітинними диферонами в процесі розвитку вузла.
За даними літератури, специфічний олі-госахаридний спектр на поверхні клітини є відображенням певного процесу, який відбувається на рівні окремої клітини або цілої клітинної популяції [1], тому дослідження поверхневої глікокарти провідних кардіоміо-цитів у різні періоди їхнього розвитку є важливим з точки зору вивчення відповідності гліканової складової плазмолеми акту, у якому в цей час задіяна клітина. Відомо, що термінальні залишки р^-галактози на поверхні ембріональних клітин свідчать про їхню схильність формувати адгезійний тип контактів із оточуючим середовищем (з сусідніми клітинами, позаклітинним матриксом) [5], а збільшення у структурі поверхневих глікокон’югатів кінцевих залишків сіалових кислот, навпаки, - про реалізацію клітиною міграційного потенціалу [6]. Коливання системі «адгезія-міграція» у бік одного чи іншого процесу, у свою чергу, відображаються
на олігосахаридному складі плазматичної мембрани клітинної групи, а можливо взагалі є умовою для подібних змін.
Крім того, клітинами провідної системи серця (ПСС) експресуються специфічні антигенні детермінанти, що відрізняє їх від оточуючих скоротливих кардіоміоцитів; для них є характерним, окрім серцевом’язових епітопів, синтезування нейрональних [8], гладком’язових та інших протеїнів [4], і це дозволяє говорити про унікальну генетичну програму, яка реалізується цим типом клітин.
Метою нашого дослідження було встановлення послідовності гістогенетичних процесів провідних кардіоміоцитів у складі СПВ шляхом вивчення експресії вуглеводних та антигенних детермінант.
Об’єкт і методи дослідження. Були досліджені серця ембріонів та плодів людини у строк від 4 до 12 тижнів гестації. Обробка біологічного матеріалу виконувалася за традиційною методикою. При дослідженні біологічного матеріалу були дотримані етичні та законодавчі норми та вимоги, яких необхідно дотримуватися при виконанні морфологічних досліджень органів людини [2]. Для вивчення мембраноасоційованих властивостей клітин використовували наступні лектини: лектин виноградного слимака (HPA) (специфічний до залишків N-ацетил-D-галактозаміну), лектин арахісу (PNA) (специфічний до термінальних залишків -D-галактози), лектин зародків пшениці (WGA) (специфічний до залишків N-ацетил-D-глюкозаміну та N-ацетил-нейрамінової кислоти) (Лектинотест, Львів). Для проведення імуногістохімічного етапу дослідження була використана наступна панель антитіл: антитіла до білків триплету нейрофіламентів (Neurofilament 200kDa & 68kDa) (NF) (Lab-Vision), антитіла до альфа-гладком’язового актину (a-SMA) (DakoCytomation), антитіла до важкого ланцюга міозину (MSA), маркер проліферації Ki-67 (DakoCytomation). Ступінь інтенсивності реакцій оцінювали напів-кількісним методом.
Для більш детальної оцінки процесу утворення контактів провідними кардіоміоцита-ми або їхньої міграційної спроможності ми ввели інтегральний параметр, який характеризує глибину зсуву в системі «адгезія-міграція» у різні періоди гістогенезу вузла, а також надає можливість аналізу контакт-спрямованих або міграційно-спрямованих процесів. Він визначався за формулою:
К= а / б, де
а -кількість WGA-позитивних клітин на 100 клітин;
б -кількість PNA-позитивних клітин на 100 клітин.
Оцінку проводили за наступною схемою: K становить менше 0,5 — різке переважання адгезії; К дорівнює 0,5 - 0,8 - помірне переважання адгезії; К складає 0,9 - 1,1 — рівновага процесів міграції та адгезії; К становить 1,2 - 2,0 — помірне переважання міграції; К більше 2,0 — різке переважання міграції.
Результати досліджень та їх обговорення. Отже, вивчені та ретельно проаналізовані дані лектино- та імуногістохімічних характеристик кардіоміоцитів ПСС дозволили визначити, що за сукупністю гістохімічних та гістоструктурних ознак стає можливим на доелектронномікроскопічному етапі охарактеризувати вид провідної клітини та встано-
вити тип клітинної реакції, яка у даний період реалізує клітина.
Хронологічні та топологічні характеристики розподілення окремих олігосахарид-них залишків на поверхні провідних кардіо-міоцитів у складі СПВ, вивчені за допомогою відповідних лектинів, ми співставили із даними інших маркерних досліджень з метою аналізу динаміки активності тієї чи іншої клітинної реакції протягом ґенезу СПВ, алгоритму їх перемикання та встановлення рис «поведінки» окремих клітинних груп для дослідження процесу паттерналізації внутрішньої структури вузла.
Провідні клітини у складі СПВ при обробці лектинами WGA та PNA не мали виразної реакції на всьому протязі досліджуваного періоду. Високу інтенсивність реакції мали лише клітини неміогенного походження, причому найбільша інтенсивність реакції спостерігалася у період активного формування судинного русла, що відбувалося завдяки міграції клітин сполучнотканинного диферо-ну з епікардіального джерела. Була встановлена динаміка змін інтегрального показника у певний термін; його рівень характеризував міграційно-адгезійний потенціал провідних кардіоміоцитів протягом гістогенезу пейсме-керного центру (рис. 1).
Рис. 1. Динаміка змін міграційно-адгезійного потенціалу провідних кардіоміоцитів синусно-передсердного вузла ембріонального серця людини.
Як видно з діаграми, протягом всього досліджуваного періоду м’язовий клітинний компонент в обох частинах синусно-передсердного вузла характеризувався виразним (на 5-6 та 9-12 тижнях пренатального онтогенезу) або помірним (на 7-8 тижнях гес-тації) переважанням адгезійних процесів. Найбільш виразна динаміка зростання кількості міграційно-активних клітин спостерігалася на 6-7 тижнях ембріонального
періоду, що співпадало із максимальною активністю васкулогенезу та формуванням сполучнотканинної капсули вузла. У цей період рівень інтегрального параметру зростав у 7 разів (р<0,05), порівняно із початковим етапом розвитку.
Вважається, що джерелом мезенхімних клітин, які формують судинну систему та сполучнотканинний апарат міокарду, у тому числі СПВ, є епікард [7]. У ранні періоди кар-
діогенезу він має найбільшу, порівняно з іншими ділянками серця, товщину в області утворення вузла. Тому дані щодо зменшення кількості клітин-мігрантів, які мають на своїй поверхні багато WGA-рецепторів (залишків сіалових кислот), підтверджують цю думку; це пояснює причини зростання у зазначений термін васкулогенної активності та початок утворення сполучнотканинної капсули вузла.
Імуногістохімічне маркування проліфера-тивно активних клітин у складі СПВ дозволило визначити особливості динаміки зміни мітотичної активності у різних ділянках пей-смекерного центру серця, а також провести паралелі між цим параметром та активністю інших гістогенетичних процесів, що відбуваються на його території.
Визначаючи кількісні характеристики реакції з маркером проліферації Кі-67 на ранніх етапах розвитку, ми не мали можливості чітко віддеференціювати м’язовий компонент структури від мезенхімного, тому параметри, представлені на рис. 2, вказують
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0 5,0 0,0
на середні величини для клітин СПВ загалом. Поява специфічних гістоморфологічних ознак клітин різних диферонів вже на 7-8 тижнях дозволяла визначення мітотичного індексу окремо для кардіоміоцитів та для клітин сполучної тканини. Але проведення такого аналізу не дозволяло би коректно провести порівняння параметру між ранніми та пізніми строками. Тому дані, які будуть проаналізовані нижче, відповідають середньому показнику мітотичної активності всіх клітин вузла.
Центральна частина синусного вузла протягом 5-12 тижнів пренатального розвитку людини характеризувалася бімодальністю кривої динаміки проліферативної активності. Перший пік активності припадав на початок розвитку вузла, другий - на 9 тиждень гестації (рис. 2). Подібний тип динаміки ми спостерігали і у периферійній ділянці вузла, але характер висхідної та низхідної частин другого піку проліферації, який припадав на 7-9 тижні ембріонального розвитку, дещо відрізнявся.
%
10
12
ТИЖНІ
центральна частина периферійна частина
Рис. 2. Мітотична активність клітин синусно-передсердного вузла серця людини у пренатальному онтогенезі.
Друга хвиля мітотичної активності в обох ділянках СПВ пов’язана, на наш погляд, із формуванням сполучнотканинної капсули, причому периферійна частина характеризувалася повільним зниженням параметру на відміну від центральної, для якої були характерні більш різкі зміни активності. У подальшому в обох ділянках зниження відсотка мітотично активних клітин відбувалося у вигляді плавної кривої, починаючи від 9 тижня гестації.
Перехресний аналіз динаміки показників відносного об’єму антиген-позитивних та лектин-позитивних ділянок дозволив визначити морфологічні критерії та закономірності
гістогенетичних перетворень різних клітинних груп синусно-передсердного вузла. Так, експресія білків триплету нейрофіламентів спостерігалася тільки у нервових волокнах; вузлові кардіоміоцити були NF-негативними. При цьому, динаміка зростання відносного об’єму NF-позитивних структур мала вигляд зростаючої кривої від 5 до 8 тижня включно, після чого відбувалося зменшення параметру (рис. 3).
Разом з тим, у період з 7 до 8 тижня відбувалося зменшення відносного об’єму а^МА-позитивних клітин на 25,9% (р<0,05) у центрі (рис. 3а) та на 35,7% (р<0,05) на периферії вузла (рис. 3б). Це співпадало у часі із статис-
тично вагомим прогресивним збільшенням відносного об’єму м’язового компоненту, порівняно із попереднім строком, у 1,9 рази у центрі та у 1,2 рази на периферії СПВ. Крім
того, проліферативна активність клітин вузла на 8 тижні мала ознаки уповільнення цього процесу у периферійній частині та майже двократне підвищення активності у центрі (рис.І).
Примітка: * - и*102
Рис. 3. Динаміка відносного об’єму антиген- та лектинпозитивних структур синусно-передсердного вузла ембріонального серця людини.
Отже, співставлення даних змін рівня експресії специфічних антигенних детермінант вказує на наступне: збільшення масової частки нервових волокон у структурі вузла стимулює процес диференціювання клітин
провідної системи. Однак це стосується тільки а^МА-позитивних кардіоміоцитів, що випливає з факту відсутності виразної динаміки проліферативної активності на периферій вузла, де сконцентрована основна частина
цього типу клітин, які коекспресують a-SMA та MSA. «Ядро» ж вузла після насичення нервовими елементами характеризувалося різким зростанням проліферації. Вибух пролі-феративної активності у центральній частині вузла відбувається за рахунок м’язового компоненту, що у часі збігається із повторним збільшенням адгезійного потенціалу клітин з метою формування простих контактів із оточуючими клітинами, критерієм чого є зсув в системі «міграція-адгезія» у бік останньої.
Враховуючи вищеописані паралелі динаміки експресії антигенних та вуглеводних детермінант, слід зазначити, що саме 8 тиждень онтогенезу є найбільш значущим в аспекті переформатування структури СПВ та зміни гістогенетичної програми провідних кардіоміоцитів - перехід із «завдання» збільшення популяції до процесу диференціювання.
Висновки. Таким чином, послідовність гіс-тогенетичних процесів провідних кардіоміо-цитів СПВ в ембріональному серці людини є наступною:
1. Проліферативна активність провідних кардіоміоцитів синусно-передсердного вузла домінує до 8 тижня, після чого зростає швидкість диференціювання.
2. Міграційна активність провідних клітин вузла є мінімальною на відміну від клітин-дериватів епікарду, які приймають участь у формуванні судин та капсули вузла. Утворення нодаль-них провідних клітин відбувається із кардіоміоцитів, що входять до складу стінки правого передсердя.
3. Активне утворення специфічних міжклітинних контактів між провідними
клітинами вузла починається після 8 тижня гестації.
4. Алгоритм гістогенетичних подій на території вузла є наступним: проліферація - диференціювання - формування спеціалізованих міжклітинних контактів.
Перспективи подальших досліджень.
Планується вивчення послідовності гістоге-
нетичних процесів провідних кардіоміоцитів
у передсердно-шлуночковому вузлі.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Антонюк В. О. Лектини та їх сировинні джерела / В. О. Антонюк. - Львів : Кальварія, 2005. - 554 с.
2. Кулініченко В. Л. Дотримання етичних та законодавчих вимог при виконанні наукових морфологічних досліджень : методичні рекомендації / [В. Л. Кулініченко, В. Д. Мішалов, Ю. Б. Чайковський та ін.] // Київ, 2007. - 29 с.
3. Development of the cardiac pacemaking and conduction system / R. Gourdi, B. Harris, J. Bond [et al.] // Birth Defects Res. Embryo Today. - 2003. - Vol. 69, № 1. - Р. 46-57.
4. Harvey R. Patterning the vertebrate heart / R. Harvey // Nature Reviews Genetigs. - 2002. - Vol. 3. - P. 544-556.
5. Lectin histochemistry of the embryonic heart: Expression of terminal and penultimate galactose residues in developing rats and chicks /A. Fazel, R. Thompson, H. Sumida, B. Schulte // Amer. J. Anat. - 2005. - Vol. 184, № 1. - Р. 85-94.
6. Nakamura Т. Neural Crest Cells Retain Multipotential Characteristics in the Developing Valves and Label the Cardiac Conduction System / T. Nakamura, M. Colbert, J. Robbins // Circ. Research. - 2006. - Vol. 98. - P. 1547-1554.
7. Mikawa T. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ / T. Mikawa, R. Gourdie // Develop. Biol. - 1996. - Vol. 4, № 2. - P. 221-232.
8. The neural crest is contiguous with the cardiac conduction system in the mouse embryo: a role in induction? / R. Poelmann, М. Jongbloed, D. Molin [et al.] // Anat. Embryol. -2004. - Vol. 208, № 5. - Р. 389-393
9. Transcriptional Regulation of Cardiac Conduction System Development: 2004 FASEB Cardiac Conduction System Minimeeting, Washington, DC / B. Haris, P. Jay, M. Rackley [et al.] // The Anat. Rec. - 2004. - Vol. 280A, № 2. - P. 10361045.
УДК 616.12:611.018.835:611.89:611.013.395
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГИСТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРОВОДЯЩИХ КАР-ДИОМИОЦИТОВ СИНУСНО-ПРЕДСЕРДНОГО УЗЛА ЭМБРИОНАЛЬНОГО СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА
Силкина Ю.В.
Резюме. Были исследованы сердца эмбрионов и плодов человека на 4-12 неделях пренатального развития. Были использованы иммуногистохимические и лектиногистохимиче-ские маркеры: NF, a-SMA, MSA, Ki-67 (LabVision, (DakoCytomation) и лектины PNA, WGA, HPA (Лектинотест, Львов). Установлено, что пролиферативная активность клеток синусного узла доминирует до 8 недели гестации, после чего возрастает скорость их дифференциров-ки и формирования специфических межклеточных контактов. Миграционная активность проводящих кардиомиоцитов узла минимальна, поскольку розвиваються они из кардиоми-оцитов, входящих в состав стенки правого предсердия. Проводящие кардиомиоциты синусного узла развиваються по алгоритму: пролиферация - дифференцировка - формирование специализированных контактов.
Ключевые слова: проводящая система, синусный узел, сердце, эмбрион человека.
UDC 616.12:611.018.835:611.89:611.013.395
The CHAIN of HISTOGENETIC PROCESSES ATYPICAL MYOSYTES SINOATRIAL NODE in the EMBRYONIC HUMAN HEART Silkina Yu.V.
Summary. Embryonic and fetal human hearts have been investigated on 5-7 week of gestation. Immunohistochemical and lectinohistochemical markers were used: NF, a-SMA, MSA, Ki-67 (LabVision, (DakoCytomation), PNA, WGA, HPA (Lektinotest). Proliferation activity of nodes myosytes dominate untill 8 week gestation. Migration activity atypical myosytes is minimal; they development out of multipotential myocardial cells. The procedure histogenetic processes is: a proliferation - a differentiation - formation of special contacts.
Key words: conductive system, sinoatrial node, human embryonic heart.
Стаття надійшла 12.05.2010 р.
УДК 616 .8- O22+ 619: 576.5З5
1.1. Торяник, В. В. Колесник*
МІКРОСКОПІЧНІ ОЗНАКИ ЯК ДОКАЗОВИЙ ІНСТРУМЕНТ У ФАКТАХ ФОРМУВАННЯ ТА РОЗВИТКУ МОДЕЛЬОВАНОГО ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ
ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України» (м. Харків) *ДУ «Інститут нейрохірургії ім. А. П. Ромоданова АМН України» (м. Київ)
Представлена робота являє собою фрагмент науково-дослідницької тематики: «Розробка технології отримання аутоклітин різних типів біологічних тканин із стромальних клітин кісткового мозку і застосування їх для лікування захворювань різного ґенезу за допомогою аутотрансплантації», номер держ-реєстрації 0106 и003995.
Вступ. На думку фахівців, інсульт являє собою невідкладний стан з більш високою летальністю, ніж переважна чисельність типів раку [6]. Ось чому зрозумілою запорукою успіху інтервенції останнього є раннє розпізнання, діагностика та адекватне клінічному перебігу лікування. «Ланки ланцюга спасіння», що інтерпретується у широкихнев-рологічних колах як найбільш оптимальна тактика, включають п’ятькомпонентів, серед яких провідне місце посідають методи: верифікація (нейровізуалізація) та відповідна нано-технологічна терапія [6,7]. Однією із новаторських вважають технологію використання клітин стромальних компонентів, рекомбінантних тканевих активаторів з метою інтервенції та превентації захворювань неврального ґенезу. На сьогодні відомі західні та вітчизняні нейрохірургічні школи
жваво залучають до свого арсеналу сучасні високотехнологічні експериментальні методи дослідження та лікування ішемічного інсульту [3,4,12]. Переважна більшість із низ стосуються, як правило, створення адекватних і доступних моделей на тваринах в умовах подальших перспектив застосування новітніх засобів лікування [9]. Проте, кожна із експериментальних моделей якою б конструктивною вона, з точки зору дослідника, не видавалась, вимагає певного обґрунтування. Результати моделювання у тварин (лабораторні щури) захисту білої речовини, глії чи субкортикальних нейронів логічно екстраполюються на цільову популяцію хворих з первинним інсультом [5,10]. Тому створення експериментальної моделі інсульту у тварин вимагає залучення об’єктивних морфологічних методів оцінки (характеру оклюзії середньої мозкової артерії, базальних гангліїв, білої речовини) [11]. Окремими авторами зауважується, що майже всі нейропротектори справляють свою дію безпосередньо на рецептори або шляхом внутрішньонейрональ-них механізмів. Відношення останніх до глії чи білої речовини невідоме, проте можливе шляхом застосування гістологічних методів
