CC BY
33
УДК 636.2.082: 577.2
Россоха В.1., ® к.с.-г.н., ст.н.с. (rossokha v@mail.ru), Шкавро Н.М., н.с. (shkavro@ukr.net),
1нститут тваринництва УААН, Харкгв
ПОШУК ПОРОДОСПЕЦИФ1ЧНИХ ГЕНЕТИЧНИХ ДНК-МАРКЕР1В ДЛЯ ТИПУВАННЯ Б1ОЛОГ1ЧНИХ ЗРАЗК1В ВЕЛИКО1 РОГАТО1
ХУДОБИ
У статтг наведет результати тестування представникгв трьох стад великог рогатог худоби - аборигенног сгрог украгнськог та малочисельних на Украгнг шаролезьког та свгтлог аквгтанськог поргд за полгморфними мгкросателгтними локусами ДНК з метою пошуку унгкальних породоспецифгчних маркерних алелгв. Для стада шаролезьког породи виявлено п'ять статистично вгроггдних алельних варганти (за локусом INRA023 - алелг розмгром 200 п.н. та 218 п.н., за локусом TGLA53 -154 п.н. та 176 п.н. та за локусом ЕТН3 - 123 п.н.), а для вибгрки тварин стада сгрог украгнськог породи - шгсть унгкальних (приватних) алелгв (за локусом TGLA53 - 172 п.н., за локусом TGLA126 - 111 п.н. та 125 п.н., за локусом TGLA227 - 79 п.н., за локусом ЕТН225 - 152 п.н. та за локусом INRA023 - 196 п.н.), якг характернг тгльки для цих поргд i не зустргчаються бгльше в гнших дослгджуваних породах великог рогатог худоби.
Ключовi слова: ДНК, мгкросателгтнг локуси, полгморфгзм, маркернг алелг, велика рогата худоба.
Вступ. Важливим питанням, на якому сконцентроваш зусилля багатьох вчених, е розробка нових високотехнолопчних засобiв збереження щнного генетичного матерiалу локальних порщ велико! рогато! худоби, а саме !х ДНК. Якщо ДНК тдлягае довгостроковому збер^анню, необхщною вимогою е надання найбшьш повно! шформаци про характер матерiалу, що збер^аеться, тож необхщним е наявшсть генетичного паспорта, а саме ДНК-паспорта, що базуеться на визначенш алельних варiантiв високополiморфних мжросател^них послщовностей ДНК [1, 2]. Маркування зразюв бiоматерiалу для крюконсерваци за допомогою мжросателтв стае необхщним для !х ефективно! щентифшацп тсля довготривалого збер^ання.
Матер1али та методи. З метою ДНК-паспортизацi! окремих представниюв генетично цiнних порiд сшьськогосподарських тварин, генетичний матерiал яких потребуе глибокого вивчення та збереження, виявлення маркерних алелiв, характерних певним породам, проводили дослщження геному 61 голови велико! рогато! худоби, в тому чи^ 23 голови велико! рогато! худоби породи шароле (ДП племзавод «Гонтарiвка» 1Т УААН), 27 голiв худоби сiро! укра!нсько! породи та 11 голiв свiтло! аквiтансько! породи (ДПДГ «Полiванiвка» 1ТЦР УААН), яю складають племiнне ядро
® Россоха В.1., Шкавро Н.М., 2010
211
дослщжуваних стад. ДНК видаляли 3i 100 мкл перифершно! кров^ ввдбрано! з хвостово! вени в npo6ipra з антикоагулянтом ЕДТА, за використання проте!нази К (за методом Кавасаю з модифiкацiями) [3, 4]. Мжросател^ний полiморфiзм був проаналiзований, базуючись на 10 маркерах, що рекомендованi ISAG для диференщаци порщ велико! рогато! худоби, а саме -BM1824, BM2113, INRA023, SPS115, TGLA53, TGLA126, TGLA227, ETH3, ETH10, ETH225. Мiкросателiтнi локуси були амплiфiкованi за допомогою полiмеразно! ланцюгово! реакци (ПЛР). Використовували термоциклер БiоКом (РоЫя), стандартнi реагенти «Набiр для генотипування велико! рогато! худоби» («Bovine PCR Typing Kit II»; фiрми Applied Biosystems). Реакцшна сумш для проведення ПЛР мктила: 10x PCR Buffer, dNTPmix (сумiш 4 дезоксирибонуклеотидiв по 1.25 mM кожний), AmpliTaq Gold DNA полiмеразу (5U/^L) та по 2.5 pmol кожного з праймерiв. Загальний об'ем сумiшi - 14 мкл. Дослщжувану ДНК додавали об'емом 1,0 мкл.
Реакцiю проводили в наступному температурному режима початкова денатуращя - 95 оС - 5 хв; 31 цикл за схемою: денатуращя - 94 оС - 45 с; вщпал праймерiв - 61 оС - 45 с; синтез - 72 оС - 60 с; заключний синтез - 72 оС - 60 хв.
Аналiз продуктiв амплiфiкацi! проводили методом капшярного електрофорезу на ДНК-секвенаторi ABI PRISM 3110 ^рми Applied Biosystems). Як стандарт розмiрiв фрагментiв ДНК використовували маркер R0X-350.
Результати дослщження.
В результатi тестування велико! рогато! худоби трьох стад дослщжуваних порщ за 10-ма мжросател^ними локусами ДНК, щентифжовано 152 алелi, серед яких 55 алелiв - у шаролезько!, 48 - у сiро! укра!нсько! та 49 - у св^ло! аквiтансько! порiд.
Найбiльша кiлькiсть алелiв спостерiгалась у локусi TGLA53 (10 алелiв) у велико! рогато! худоби породи шароле та в локусах TGLA53 (8 алелiв) у свггло! аквiтансько! та TGLA227 (8 алелiв) у сiро! укра!нсько! порiд. Iншi алелi показали досить рiвномiрний розподш у специфiчних локусах (в локус INRA023 по 6 алелiв у шаролезько! та Ыро! укра!нсько! порщ, також по 6 алелiв вiдмiчено в локусах ЕТН225 та TGLA126 у Ыро! укра!нсько!, TGLA227 та SPS115 у шаролезько! та 7 алелiв в локус TGLA227 у свггло! аквiтансько! порiд, для локусш ВМ2113, ЕТН10, TGLA122, ЕТН3 та ВМ1824 - вщ 3 до 5 алелiв). Найменше число алелiв вiдмiчено в локусi ЕТН10 у шароле, за яким було щентифжовано два алелг Були розрахованi частоти алелiв у специфiчних локусах та критери достовiрностi зустрiчання алелю в популяци (за критерieм Стьюдента - t - достовiрнiсть коефiцieнту кореляци вибiркового значення частоти алелю з генеральною сукупшстю), значення проаналiзованих параметрiв наведенi в таблищ 1.
Спираючись на отримаш данi за визначенням критерiю Стьюдента (див. табл. 1), можна стверджувати, що дослщжувана вибiрка е репрезентативною, тобто вщображае характернi особливостi дослщжуваних стад.
212
Таблиця 1
Частоти алел1в мжросателггних локупв, що ¡дентнфнковаш за трьома
дослщжуваними породами велико! рогато!' худоби_
Локус шароле ира укра!нська св1тла акв1танська
алель (п.н.) частота алел1в частота алел1в частота алел1в
1 2 3 5 7
178 0,152 ± 0,053" 0,037 ± 0,026 0,273 ± 0,095'
ВМ 1824 180 0,167 ± 0,051' 0,045 ± 0,044
182 0,457 ± 0,073'" 0,444 ± 0,068'' 0,364 ± 0,103'
188 0,391 ± 0,072''' 0,352 ± 0,065''' 0,273 ± 0,095'
190 0,045 ± 0,044
131 0,217 ± 0,061 0,091 ± 0,061
133 0,065 ± 0,036 0,630 ± 0,066'' 0,136 ± 0,073
гч £ М 135 0,174 ± 0,056' 0,130 ± 0,046' 0,227 ± 0,089'
137 0,500 ± 0,074''' 0,167 ± 0,051' 0,273 ± 0,095'
139 0,022 ± 0,022 0,056 ± 0,031 0,273 ± 0,095'
196 0,259 ± 0,060'
198 0,043 ± 0,030
200 0,174 ± 0,056'
гъ гч о 206 0,391 ± 0,072'' 0,204 ± 0,055''' 0,409 ± 0,105'
% 208 0,111 ± 0,043' 0,091 ± 0,061
г ни 212 0,043 ± 0,030 0,315 ± 0,063''' 0,091 ± 0,061
214 0,217 ± 0,061' 0,056 ± 0,031 0,364 ± 0,103'
216 0,056 ± 0,031
218 0,087 ± 0,042'
154 0,109 ± 0,046'
158 0,043 ± 0,030 0,045 ± 0,044
160 0,065 ± 0,036 0,100 ± 0,041' 0,136 ± 0,073
162 0,065 ± 0,036 0,040 ± 0,027 0,091 ± 0,061
1Л 164 0,022 ± 0,022 0,273 ± 0,95'
< 166 0,174 ± 0,056' 0,320 ± 0,063''' 0,136 ± 0,073
о Н 168 0,043 ± 0,030 0,380 ± 0,066'' 0,136 ± 0,073
170 0,326 ± 0,069'' 0,045 ± 0,044
172 0,160 ± 0,050'
176 0,109 ± 0,046'
184 0,043 ± 0,030 0,045 ± 0,044
248 0,565 ± 0,073' 0,635 ± 0,066' 0,636 ± 0,103 '
252 0,022 ± 0,022 0,115 ± 0,043' 0,045 ± 0,044
сл 254 0,174 ± 0,056' 0,019 ± 0,019 0,136 ± 0,073
№ сл 256 0,152 ± 0,053'' 0,019 ± 0,019
260 0,065 ± 0,036 0,212 ± 0,056''' 0,182 ± 0,082'
213
1 2 3 5 7
TGLA 227 77 0,065 ± 0,036 0,185 ± 0,053 0,045 ± 0,044
79 0,111 ± 0,043"
81 0,174 ± 0,056" 0,019 ± 0,018
83 0,283 ± 0,066"' 0,056 ± 0,031 0,136 ± 0,073
87 0,109 ± 0,046" 0,148 ± 0,048" 0,136 ± 0,073
89 0,174 ± 0,056" 0,185 ± 0,053" 0,273 ± 0,095"
91 0,174 ± 0,056" 0,227 ± 0,089"
93 0,222 ± 0,057""" 0,136 ± 0,073
97 0,037 ± 0,026 0,045 ± 0,044
TGLA 126 111 0,083 ± 0,038"
113 0,042 ± 0,027
115 0,630 ± 0,071" 0,292 ± 0,062""" 0,409 ± 0,105"
117 0,196 ± 0,058" 0,292 ± 0,062""" 0,182 ± 0,082"
119 0,063 ± 0,033 0,091 ± 0,061
123 0,174 ± 0,056" 0,318 ± 0,099"
125 0,208 ± 0,055"""
ETH 3 115 0,037 ± 0,026
117 0,652 ± 0,070""" 0,611 ± 0,066" 0,636 ± 0,103"
119 0,087 ± 0,042" 0,259 ± 0,060" 0,273 ± 0,095
121 0,022 ± 0,022 0,091 ± 0,061
123 0,174 ± 0,056"
125 0,043 ± 0,030 0,093 ± 0,039
ETH 10 217 0,891 ± 0,046" 0,426 ± 0,067" 0,727 ± 0,095"
219 0,109 ± 0,046" 0,426 ± 0,067""" 0,182 ± 0,082"
221 0,148 ± 0,048" 0,045 ± 0,044
223 0,045 ± 0,044
ETH 225 140 0,022 ± 0,022 0,333 ± 0,064" 0,091 ± 0,061
144 0,065 ± 0,036 0,093 ± 0,039" 0,273 ± 0,095"
146 0,022 ± 0,022 0,037 ± 0,026 0,045 ± 0,044
148 0,239 ± 0,063""" 0,167 ± 0,051" 0,545 ± 0,106"
150 0,652 ± 0,070""" 0,278 ± 0,061" 0,045 ± 0,044
152 0,093 ± 0,026"
Примггка: ± - статистична похибка частот алелiв;
дост^ршсть зус^чання алеллю в популяцп при *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Анал1з отриманих даних свщчить, що за локусом TGLA53 визначено найбшьшу кшькють алел1в (10) у велико! рогато! худоби породи шароле, де з найвищою частотою виступае алель довжиною 170 пн (0,326), а з найменшою - алель 164 пн (0,022). Спостер1гаеться найбшьша р1зниця в частотах алел1в м1ж трьома дослщжуваними породами за алелями 170 пн та 164 пн. Так, вони зовЫм вщсутш у Ыро! укра!нсько! породи, а в св1тло! акв1тансько!,
214
на противагу до шароле, з найвищою частотою виступае алель довжиною 164 пн (0,273), а з найменшою - алель 170 пн (0,045). За локусом TGLA227 щентифжовано велику кшькють алелiв розмiром вiд 77 до 97 пн (8 алелiв у Ыро! укра!нсько! та 7 алелiв у свило! аквпансько! порiд). Серед визначених алелiв з найвищою частотою у шаролезько! породи зустрiчаеться алель 83 пн (0,283), алель 93 пн у сiро! укра!нсько! (0,222) та алель розмiром 89 пн (0,273) у свило! аквпансько! порщ. Iншi алелi показали досить рiвномiрний розподiл - вiд 0,056 (83 пн) до 0,174 (89 пн). Локус ЕТН10 представлений найменшою кшькютю алелiв - вщ 2 у шароле до 4 у свило! аквпансько! порiд. З найбiльшою частотою виступае алель 217 пн, у шаролезько! породи вш зустрiчаеться майже в 90% випадках, у свпло! аквпансько! - бiльш нiж 70% та майже 50% - у шро! укра!нсько! порiд. Алелi розмiром 221 пн та 223 пн зустрiчаються з низькою частотою у дослщжених представникiв свiтло! аквiтансько! (по 0,045) та з частотою 0,148 (221 пн) Ыро! укра!нсько! порщ. За локусом ВМ1824 iдентифiковано найбшьшу кiлькiсть алелiв - 5 у свггло! аквiтансько! породи, найменшу - 3 у шароле. Серед визначених алелiв з найвищою частотою, за вама трьома дослщженими породами велико! рогато! худоби, виступав алель довжиною 182 пн (у шароле = 0,457, у Ыро! укра!нсько! = 0,444 та у свггло! аквпансько! = 0,364), алель довжиною 188 пн також показав схожу частоту за вЫма трьома породами, однак алель довжиною 178 пн у шароле та Ыро! укра!нсько! порщ показав найнижчу частоту, хоча у свилш аквианськш породi вiн зустрiчався значно частше, а найнижчу частоту в цш породi показали алелi довжиною 180 та 190 пн (по 0,045). За локусом ШКА023 у велико! рогато! худоби шаролезько! породи щентифжовано алелi довжиною вщ 198 пн до 218 пн, а в аро! укра!нсько! породи ще й алель довжиною 196 пн. У шароле з найвищою частотою представлений алель 206 пн (0,391) так само, як i в свило! аквпансько! породи (0,409), з низькою частотою в цих породах представлеш алелi 212 пн, хоча у Ыро! укра!нсько! худоби цей алель виступае з найвищою частотою (0,315). Для локусу SPS115 щентифжовано алелi довжиною вщ 248 пн (саме цей алель виступае з найвищою частотою у вшх трьох дослщних породах велико! рогато! худоби) до 260 пн. Серед вЫх 5 алелiв алель розмiром 248 пн зустрiчаеться бiльш шж в 60% випадках. За локусом TGLA126 у велико! рогато! худоби Ыро! укра!нсько! породи виявлена найбшьша кiлькiсть алелiв розмiром 115 пн та 117 пн (по 0,292). Алель 115 пн також показав найвищу частоту i в шших двох породах -шаролезькш та свилш аквiтанськiй (з частотою 0, 630 та 0, 409 вщповщно). Найменше по шрш укра!нськiй породi представлений алель 113 пн (0,042), який зовам вщсутнш в шших двох породах. У свило! аквпансько! породи алель 123 пн зустрiчаеться досить часто (0,318), а в шароле вш показав найнижчу частоту (0,174) i зовшм вiдсутнiй у шро! укра!нсько! породи. За локусом ЕТН225 з найменшою частотою за вЫма трьома дослщними породами виступае алель довжиною 146 пн (вщ 0,022 до 0,045). З високою частотою представлений алель 150 пн у шаролезько! та шро! укра!нсько! порщ (0,652 та 0,278 вщповщно), хоча у представниюв свило! аквпансько! породи вш зустрiчаеться досить рщко (0,045). З найбшьшою частотою по цш
215
породi представлений алель довжиною 144 пн (0,273). Iншi алелi показали рiвномiрний розподш в дослщжених породах.
В результатi проведеного аналiзу розподiлу частот алелiв дослщжуваних мiкросателiтних локусiв, знайдено маркернi алел^ характернi для певних порiд. Так, для стада шаролезько! породи за локусом INRA023 виявлено алелi розмiром 200 п.н. та 218 п.н., за локусом TGLA53 - алелi 154 п.н. та 176 п.н. та за локусом ЕТН3 алель довжиною 123 п.н. Всього виявлено п'ять ушкальних алельних варiантiв мжросател^них локусiв, що характернi тiльки для шаролезько! породи i не зустрiчаються бiльше в двох iнших дослщжуваних породах.
Для дослщжуваного стада шро! укра!нсько! породи також виявлено шють унiкальних (приватних) алелiв - за локусом TGLA53 - 172 п.н., за локусом TGLA126 - 111 п.н. та 125 п.н., за локусом TGLA227 - 79 п.н., за локусом ЕТН225 - 152 п.н. та за локусом INRA023 - 196 п.н.
Визначеш ушкальш алелi можуть виступати в якосп високошформативних породоспецифiчних генетичних маркерiв при щентифжацп бюлопчних зразюв невiдомого походження, або, наприклад, при iдентифiкацi! зразкiв шсля довготривалого зберiгання. Таким чином, проведен пiлотнi дослiдження, звичайно, вони потребують подальшого доповнення та модифiкацiй, за вивчення бшьшо! кiлькостi тварин для ефективного формування панелi мiкросателiтних маркерiв, що вiдображають характернi особливостi конкретно! породи та популяцп в цшому.
Таким чином, спираючись на даш про частоти зустрiчання алелiв в специфiчних мiкросателiтних локусах ДНК, можна з високою вiрогiднiстю пiдтверджувати походження (батьювство), приналежнiсть окремих iндивидiв до визначено! породи, а також вивчати та доповнювати iнформацiю про породну насичешсть специфiчними ДНК-маркерами.
Висновки. В результат проведених дослiджень виявленi найбшьш полiморфнi локуси: TGLA53 для шаролезько! породи (10 алелiв) та TGLA227 для Ыро! укра!нсько! породи (8 алелiв). Визначенi унiкальнi статистично вiрогiднi маркернi алельнi варiанти мiкросателiтних локуЫв, характернi для популяцiйно! вибiрки двох стад: INRA023 - 200п.н., 218 п.н.; TGLA53 -154 п.н., 176 п.н.; ЕТН3 - 123 п.н. (стадо шаролезько! худоби племзаводу «Готовка») та TGLA53 - 172 п.н.; TGLA126 - 111 п.н., 125 п.н.; TGLA227 -79 п.н.; ЕТН225 - 152 п.н.; INRA023 - 196 п.н. (стадо шро! укра!нсько! худоби племзаводу «Полiванiвка».
Л1тература
1.Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е. Сулимова // Успехи соврем. биологии. - 2004. - Т.124. - № 3. - С. 260-271.
2.Williams J.L. The use of marker-assisted selection in animal breeding and biotechnology / J.L. Williams // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 2005. - 24(1). - P. 379-391.
216
Hayxoeuu eicnux flHYBMET iMeni C.3. f^uцbкого Tom 12 № 2(44) ^acmuna 3, 2010
3.Kawasaki E. S. Sample preparation from blood, cells and other fluids / Eds M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. While // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. - San Diego. - 1990. - P. 146-152.
4. Coppieters W. Rechtstreekse genotypering von stress (on) gevoelligheit bij verkens met behulp met van DNA ondrrzoek / Van Zeveren A., Van De Weghe A., Peelmn L., Bouguet Y // Vlaams Diergeneeskunding Tijdschrift. -1992. - 61. - P. 68-72.
Summary Rossokha V.,Shkavro N. Institute of animal science UAAN, Kharkov, Ukraine THE SEARCH OF BREEDSPECIFIC GENETIC DNA MARKERS FOR TYPING OF CATTLE BIOLOGICAL MATERIAL
This article highlights the polymorphism of 11 microsatellite DNA markers testing results of herds of native Gray Ukrainian and small number of animal Charolais and Akvitanse cattle breeds for the unique breedspecific markers alleles search. For the herds of Charolais breed was identified the five statistically reliable allelic variants (for loci INRA023 - alleles by length 200 bp and 218 bp, for loci TGLA53 -154 bp and 176 bp, for loci ETH3 - 123 bp), and for the herds of grey Ukrainian breed - six unique (prived) alleles (for loci TGLA53 - 172 bp, for loci TGLA126 - 111 bp and 125 bp, for loci TGLA227 - 79 bp, for loci Etn225 - 152 bp, and also for loci INRA023 - 196 bp).
Keywords: DNA, microsatellite loci, polymorphism, marker allele, cattle.
Cmammx nadiumna do peda^ii 4.03.2010
217
