CC BY
37
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 575.222.73:582.734.4:581.143.6
Е.В. АМБРОС, кандидат биологических наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск, Россия
ПОЛУЧЕНИЕ МЕЖРОДОВЫХ ГИБРИДОВ FRAGARIA ANANASSA X POTENTILLA NEPALENSIS МЕТОДОМ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ
Показана перспективность применения эмбриокультуры для получения межродовых гибридов Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis. Определен оптимальный срок изоляции зародышей. Формирование растений-регенерантов происходило как путем прямой регенерации на безгормональной среде МС, так и через стадию каллусогенеза при культивировании на модифицированной среде МС с добавлением 0,2 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д. Жизнеспособные образцы получены путем регенерации из каллусной ткани на питательных средах МС с добавлением 0,75 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГК3.
Ключевые слова: Fragaria x ananassa Duch., Potentilla nepalensis Hook., межродовая гибридизация, розовоцветковые сорта, селекция, эмбриокультура.
Введение
Получение новых форм культурных растений с заданными признаками - одна из актуальных проблем биологии. Земляника занимает лидирующее место в мире среди ягодных культур по площадям и урожаю. До сих пор сортимент этой культуры, представленный более 5 тысячами сортов, создан на базе одного вида - земляники крупноплодной (Fragaria x ananassa Duch., 2n=8x=56). Этот вид обладает высокой экологической и репродуктивной пластичностью благодаря высокому уровню плоидности и гетерозиготности, обусловленной спонтанной гибридизацией между двумя октоплоидными американскими видами F. virginiana Mill. и F. chiloensis Mill. [6]. Тем не менее, интрогрессия в фонд садовой земляники ценного генетического материала дикорастущих видов (например, Potentilla L.) приобретает все большую значимость. Создание розовоцветковых сортов F. x ananassa с ремонтантным типом плодоношения является перспективным направлением селекции. С этой целью в межродовые скрещивания с представителями рода Fragaria L. вовлекались различные роды семейства Rosaceae L.: Rosa L., Padus Mill., Potentilla, Comarum L. и др. [3, 7]. В большинстве случаев межродовая гибридизация приводит к оплодотворению, однако процент жизнеспособных проростков невелик, что обусловлено межгеномной несовместимостью [5]. Культивирование зародышей in vitro снижает риск потери ценных генотипов, так как их развитие протекает в контролируемых условиях [2]. В связи с этим целью данной работы было получение межродовых гибридов Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis Hook. с использованием метода эмбриокультуры.
Объекты и методы исследования
Исходным материалом послужили семянки, полученные от скрещивания F. ananassa x P. nepalensis. В качестве эксплантов для культивирования in vitro использовали незрелые зародыши и семядоли незрелых зародышей. Для получения асептического материала семянки обрабатывали 70%-ным спиртом в течение 5 мин, стерилизовали 30%-ным раствором перекиси водорода в течение 15 мин с последующим четырехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Зародыши в условиях ламинарного бокса извлекали из семянок, разрезанных поперек в
апикальной части [9]. Экспланты переносили на модифицированную среду Мурасиге-Скуга - МС [10], содержащую 0,5-1,0 г/л гидролизата казеина, 1,0 мг/л тиамина, 5,0 мг/л пиридоксина, 5 мг/л никотиновой кислоты, 3-5% сахарозы и различные варианты регуляторов роста: 1) 0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурина) + 2,0 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту); 2) 0,2 мг/л БАП + 1,0 мг/л 2,4-Д; 3) 0,2 мг/л БАП + 2,0 мг/л 2,4-Д; 4) 0,1 мг/л БАП + 5,0 мг/л 2,4-Д; 5) 5,0 мг/л БАП + 0,1 мг/л НУК (а-нафтилуксусную кислоту); 6) 1,0 мг/л БАП + 0,9 мг/л НУК; 7) без регуляторов роста (контроль). Изолированные экспланты выдерживали 4 недели в темноте при температуре 25°С. После каллусообразования их переносили в условия 16-ти часового фотопериода, при температуре днем 23-25°С, ночью 16-18°С, освещенности 4 клк. Эксперимент проводился в трех повторностях.
Результаты и обсуждение
Известно, что успех эмбриокультуры in vitro во многом зависит от срока изоляции зародыша и состава питательной среды. Всего было введено в культуру in vitro 1016 зародышей. Поскольку абортирование зародыша может происходить на ранних этапах развития, их извлекали из незрелых семянок в несколько периодов: через 10-15 дней после опыления (ДПО), 15-20 ДПО, 20-25 ДПО, 25-30 ДПО. Зародыши, изолированные на 10-15 ДПО, находились в глобулярной стадии развития. Через 15-20 дней после опыления происходила дифференциация семядолей, и зародыш вступал в сердечковидную стадию развития, а к 20-25 дню по мере роста семядолей переходил в стадию торпеды. Зародыши, извлеченные на 25-30 ДПО, имели сформированные семядоли с первичным корешком и почечкой (рис. 1).
Рис. 1. Зародыши ¥. ananassa х Р. пера1гт1$: а) 15-20 ДПО;
б) 25-30 ДПО.
Условные обозначения: 1 - семядоли, 2 - первичный корешок.
При культивировании зародышей, изолированных на 15-20, 20-25, 25-30 ДПО, на безгормональной среде МС 4,5% зародышей формировали проростки. В основном прорастали зародыши, извлеченные на 25-30 ДПО (рис. 2 а). Через семь дней зародыши развивались в проростки и к концу четвертого месяца культивирования имели 5-7 настоящих листьев (рис. 2 б).
Рис. 2. Регенерант, полученный от скрещивания ¥. ananassa х Р. nepalensis: а) через 7 дней культивирования; б) через 3 месяца культивирования на
безгормональной среде МС.
Доля регенерантов составила 3,6%, так как на ювенильной стадии большинство всходов погибли. Известно, что при культивировании гибридного материала, полученного при отдаленных скрещиваниях, могут наблюдаться различные аномалии роста, затрагивающие надземную и корневую части [8]. В нашем эксперименте аномалии при формировании растений выражались в отсутствии или резком ослаблении ростовых процессов, отсутствии роста корня или роста корня без развития семядольного листа, нарушении полярности, образовании этиолированных листьев, возникновении некротических участков тканей при последующем усыхании. Выявленные аномалии, возможно, обусловлены генетической отдаленностью компонентов скрещивания, которые в силу межродовой несовместимости приводят к летальности проростков.
В качестве индуктора адвентивного побегообразования у гибридных проростков был выбран БАП, так как по сравнению с другими цитокининами (кинетином и изопентениладенозином) наилучшие показатели регенерационной способности земляники отмечены на среде при добавлении данного регулятора роста [4]. Введение БАП в концентрации 0,25 мг/л позволило получить жизнеспособные конгломераты с 10-15 микропочками, из которых удавалось получить от 3 до 6 микропобегов на один эксплант, способных к дальнейшему росту. Сформировавшиеся побеги переносили на среду МС с половинным содержанием макроэлементов, без регуляторов роста и с пониженным содержанием сахарозы (2%). Все микропобеги проявили способность к регенерации корней.
Для увеличения выхода растений при микроразмножении Г. ana.na.ssa х Р. nepalenis, кроме прямой регенерации растений из изолированных зародышей, использовали регенерацию адвентивных побегов из изолированных участков семядолей. Известно, что ткани семядолей у многих видов растений обладают высоким морфогенетическим потенциалом [11]. В качестве контроля использовали питательную среду МС без регуляторов роста, на которой отмечалась 100%-ная гибель эксплантов. При культивировании эксплантов на среде с регуляторами роста через 2-3 дня семядоли укрупнялись, а через 7 дней формировалась каллусная ткань. После 3 недель культивирования у 97% эксплантов, изолированных из семянок на 20-25 и 25-30 ДПО, на средах № 2 и № 6 образовался морфогенный каллус - плотный, молочного цвета, зеленеющий на свету (табл.1, рис. 3).
Рис. 3. Морфогенный каллус, полученный из семядоли зародыша, изолированного через 28 ДПО (среда МС с 0,2 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д , 2 недели культивирования in vitro).
Таблица 1
Влияние стадии развития зародыша, комбинаций и концентраций
Возраст эксплантов Концентрация регуляторов Отзывчивость
(ДПО) роста, мг/л эксплантов
БАП 2,4-Д НУК
0,5 2,0 - НМК
10-15 0,2 1,0 - Д
0,2 2,0 - Д
0,1 5 - Д
5,0 - 0,1 НМК
15-20 1,0 - 0,9 НМК
0,5 2,0 - НМК
0,2 1,0 - НМК
1,13 - 0,93 МК
20-25 0,1 5 - НМК
0,2 1,0 - МК
0,5 2,0 - НМК
0,2 1,0 - МК
25-30 0,5 2,0 - НМК
5 - 0,1 НМК
Условные обозначения: Д - дегенерация экспланта, НМК - неморфогенная каллусная ткань, МК - морфогенная каллусная ткань.
На семядолях зародышей, изолированных из семянок через 15-20 ДПО, формировалась неморфогенная каллусная ткань рыхлой консистенции, сильно обводненная, бесструктурная, желто-кремового цвета, не зеленеющая на свету, а также плотная, зернистая, краснеющая на свету ткань (рис. 4).
Рис. 4. Неморфогенный каллус, полученный из семядоли зародыша, изолированного через 15 ДПО (среда МС с 0,2 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д, 3 недели культивирования in vitro).
Неморфогенный каллус впоследствии некротизировался. Семядоли зародышей, извлеченные на 10-15 ДПО, в основном дегенерировали, почти не образуя каллусной ткани.
Для регенерации растений морфогенные каллусы были перенесены на среду с БАП в концентрации 0,75 мг/л, на которой происходило формирование микропочек с образованием конгломерата коротких побегов (рис. 5).
Рис. 5. Адвентивное побегообразование через 5 недель культивирования на среде
МС с 0,75 мг/л БАП.
Причем доля каллусов, образовавших побеги у эксплантов, изолированных на 25-30 ДПО, была в 2 раза больше по сравнению с эксплантами, изолированными на 2025 ДПО (табл. 2).
Таблица 2
Способность к образованию каллусной ткани и последующая индукция _ органогенеза из семядоли зародыша (п=20)_
Возраст экспланта (ДПО) Доля эксплантов, образовавших каллусную ткань, % Доля каллусов, образовавших побеги, %
10-15 2,2 0,0
15-20 92,0 0,0
20-25 97,1 1,9
25-30 92,1 3,8
При последующем субкультивировании конгломератов с микропобегами на среде МС с добавлением гибберелловой кислоты (ГК3) в концентрации 0,1 мг/л происходила их элонгация [1], и к концу шестого месяца культивирования регенеранты имели 5-7 настоящих листьев. Максимальный коэффициент размножения составил 1729 новых побегов за пассаж через 6 месяцев после введения в культуру (рис. 6).
А.
"ЧЧГ
V LÍñr
v f ¿
w
Рис. 6. Кластеры микропобегов F. ananassa x P. nepalensis, полученные на
среде МС с 0,1 мг/л ГК3.
Для укоренения регенерантов использовали безгормональную среду МС с половинным содержанием макроэлементов и пониженным содержанием сахарозы (2%). Корнеобразование наблюдали через 3-4 недели. Всего с помощью эмбриокультуры было получено 29 образцов предположительно гибридного происхождения, т.е. проявляющих морфологические признаки Fragaria ananassa и Potentilla nepalensis. Дальнейший цитологический анализ числа хромосом в соматических тканях внесет окончательную ясность в их происхождение. Основные трудности возникли при адаптации регенерантов к условиям ex vitro, часть из них в процессе адаптации погибла. В настоящий момент адаптировано 6% растений, которые могут быть включены в селекционный процесс.
Выводы
1. Наиболее компетентными к развитию оказались зародыши, выделенные из семянок через 25-30 ДПО. Этот период изоляции экспланта обеспечил максимальный выход растений - регенерантов.
2. Получение морфогенного каллуса оказалось возможным только при использовании в качестве исходного материала эксплантов, изолированных из семянок на 20-25 и 25-30 ДПО при культивировании на модифицированной среде МС с добавлением 0,2 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д.
3. Регенерация in vitro проходила по пути как прямого, так и непрямого геммогенеза.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития», проект №9.
Список литературы
1. Амброс Е.В. Перспективы использования межродовых гибридов Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis в интродукции и селекции /Е.В.Амброс, Т.И.Новикова // Вестник ИрГСХА. - 2011. - Вып. 44, №4. - С. 7- 13.
2. Расторгуев С.Л. Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений: Научное издание/С.Л.Расторгуев. - Мичуринск: МичГАУ, 2009. -203 с.
3. Asker S. Some viewpoints on Fragaria x Potentilla intergeneric hybridization /S. Asker // Hereditas. - 1971. - № 67. - P. 181-190.
4. Bhatt I.D. Micropropagation of Indian wild strawberry /I.D.Bhatt, U.Dhar// Plant Cell, Tissue and Organ Cult. - 2000. - V. 60, №2. - P. 83-88.
5. Chen Z. J., Ni Z. Mechanisms of genomic rearrangements and gene expression changes in plant polyploids /Z.J. Chen, Z. Ni.// BioEssays. - 2006. - V. 28, № 3. - P. 240252.
6.Darrow G.M. The strawberry - history, breeding and physiology/G.M.Darrow. -New York: Holt, Rinehart and Winston, 1966. - 447 p.
7. Ellis J.R. Fragaria-Potentilla intergeneric hybridization and evolution in Fragaria /J R. Ellis //Proc. Linnean Society of London. - 1962. - V.173. - Р. 99-106.
8.Mangelsdorf A.J. Studies on the genetics of Fragaria /A.J. Mangelsdorf // Genetics. - 1927. - V. 12. - P. 307-339.
9. Miller A.R. Enhanced strawberry seed germination through in vitro culture of cut achenes / A.R. Miller//J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 1992. - Vol. 117, № 2. - P. 313-316.
10. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures /T. Murashige, F. Skoog // Physiol Plant. - 1962. - V.15, № 3. - P. 473-497.
11. Silva T. In vitro production and propagation of Fragaria vesca x Potentilla fruticosa hybrids / Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 1996. - V. 46. - P. 51-58.
Статья поступила в редакцию 06.03.2013 г. E.V. AMBROS, PhD in Biology
Central Siberian Botanical Garden of the Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia
OBTAINING OF ITERSPECIFIC FRAGARIA ANANASSA X POTENTILLA NEPALENSIS HYBRIDS BY EMBRYO CULTURE
An application of embryo culture for obtaining of Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis hybrids has been studied. Optimum period of embryo isolation has been determined. Formation of microplants was occurred both by direct regeneration on hormoneless MS medium and by callusogenesis on modified MS medium with 0,2 mg l-1 BA and 1,0 mg l-1 2,4-D. Viable samples were obtained by regeneration from a callus tissue on modified MS media supplemented with 0,75 mg l-1 BA and 0,1 mg l-1 GA3.
С.В. АМБРОС, кандидат бгологгчних наук
Федеральна державна бюджетна установа науки «Центральний сибiрський боташчний сад Сибiрського вiддiлення РАН», м. Новосибiрськ, Росiя
ОТРИМАННЯ М1ЖРОДОВИХ Г1БРИД1В FRAGARIA ANANASSA X POTENTILLA NEPALENSIS МЕТОДОМ ЕМБРЮКУЛЬТУРИ
Показано перспективнiсть застосування ембрюкультури для отримання мiжродових гiбридiв Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis. Визначено оптимальний строк iзоляцii зародив. Формування рослин-регенерашив вiдбувалося як шляхом прямо! регенерацп на безгормональному середовищi МС, так i через стад^ калюсогенезу при культивуваннi на модифшованому середовищi МС з додаванням 0,2 мг/л БАП 1,0 мг/л 2,4-Д. Життeздатнi зразки отриманi шляхом регенерацп з калюсно! тканини на поживних середовищах МС з додаванням 0,75 мг/л БАП i 0,1 мг/л ГК3.
Е.В. АМБРОС, кандидат биологических наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН», г. Новосибирск, Россия
ПОЛУЧЕНИЕ МЕЖРОДОВЫХ ГИБРИДОВ FRAGARIA ANANASSA X POTENTILLA NEPALENSIS МЕТОДОМ ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ
Показана перспективность применения эмбриокультуры для получения межродовых гибридов Fragaria ananassa x Potentilla nepalensis. Определен оптимальный срок изоляции зародышей. Формирование растений-регенерантов происходило как путем прямой регенерации на безгормональной среде МС, так и через стадию каллусогенеза при культивировании на модифицированной среде МС с добавлением 0,2 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д. Жизнеспособные образцы получены путем регенерации из каллусной ткани на питательных средах МС с добавлением 0,75 мг/л БАП и 0,1 мг/л ГК3.
УДК 581.143.6
ТВ. ПОЛУБОЯРОВА, кандидат биологических наук; Т.И. НОВИКОВА, доктор биологических наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный Сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск, Россия
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ДЕКОРАТИВНЫХ ЛУКОВ ПОДРОДА MELANOCROMMYUM ИЗ ОРГАНОВ ЦВЕТКА
Исследован морфогенный потенциал in vitro флоральных эксплантов (фрагментов оснований соцветий, бутонов и зрелых цветков) Allium giganteum Regel и A. altissimum Regel. Наиболее эффективная регенерация адвентивных побегов получена из бутонов среднего яруса закрытого соцветия с использованием среды BDS, дополненной 2 мг/л БАП и 2 мг/л НУК для A. altissimum и 1 мг/л БАП и 1 мг/л НУК для A. giganteum. Культивирование in vitro ускоряет развитие луков.
Ключевые слова: морфогенный потенциал, Allium giganteum, A. altissimum, клональное микроразмножение, условия ex vitro.
