CC BY
169
УДК 57.083.13+577.152.321*1
ОДЕРЖАННЯ І ВЛАСТИВОСТІ а-АМІЛАЗИ З Bacillus sp. BKL40
О. І. Кубрак
В. І. Лущак
Прикарпатський національний університет ім. В. Стефаника, Івано-Франківськ
E-mail: lushchak@pu.if.ua
Виділено штам ВacШus Бр. BKL40, здатний секретувати в середовище культивування а-амілазу, стабільну за високих температур і лужних значень рН. Оптимізацією умов культивування штаму-продуцента досягнено найбільшої продукції ензиму. Інтенсивність синтезу а-амілази не залежала від наявності крохмалю в середовищі культивування й стимулювалася додаванням пептону (0,3%) та дріжджового екстракту (0,2%). Ензим повністю зберігав амілолітичну активність після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С. а-Амілаза виявляла високу активність у широкому діапазоні значень рН — від 6,0 до 11,0 і зберігала активність навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Досліджувана а-амілаза не активувалась іонами кальцію та іонами інших двовалентних металів (1 мМ), а також не інгібувалась ЕДТА та ЕГТА (1-10 мМ), що може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її молекули.
Ключові слова: а-амілаза, ВacШus Бр., алкалостабільність, термостабільність, продукція.
а-Амілаза (1,4-а-О-глюкан глюканогід-ролаза, ЕС 3.2.1.1) — один з амілолітичних ензимів, який здійснює невпорядковане розщеплення 1,4-а^-глікозидних зв’язків крохмалю та інших полісахаридів з утворенням суміші лінійних і розгалужених вуглеводів: декстринів, олігосахаридів, мальтози й глюкози в а-аномерній конфігурації [1, 2]. Ці ензими застосовують у багатьох галузях народного господарства [3, 4]. Їх використовують для отримання цукру та спирту, виготовлення паперу й текстилю [1, 4], утворення адгезивних речовин і оброблення стічних вод [3]. Вони незамінні у хлібопекарстві, пивоварінні та виноробстві [2]. а-Амілази застосовують у біотехнологічних процесах приготування кормів для тварин та харчових добавок для дітей і людей похилого віку [5]. Віднедавна а-амілази почали використовувати як компоненти екологічно безпечних мийних засобів [3, 6].
Оскільки більшість стадій біотехно-логічних процесів проводять за підвищених температур, термостабільність а-амілаз є необхідною умовою для їх практичного застосування [7]. Використання термостабільних а-амілаз має низку переваг порівняно із застосуванням термолабільних аналогів: дозволяє уникати забруднення мезофільною мікрофлорою, зменшувати витрати на охо-
лодження промислових реакторів і збільшувати загальну швидкість процесів [7, 8]. Стабільні за підвищених температур і лужних значень рН (> 8,0) а-амілази можуть застосовуватись як компоненти екологічно безпечних мийних засобів, оскільки вони легко утилізуються живими організмами в навколишньому середовищі [3, 6, 9].
Для багатьох індустріальних процесів з використанням а-амілаз, зокрема у процесі виготовлення пива чи сиропів, бажано уникати додавання кальцію, оскільки він спричинює пошкодження обладнання оксалатом кальцію, псує якість і вигляд продукції [7], а тому потребує додаткових витрат для подальшого видалення [10]. Проте майже всі відомі а-амілази містять іони кальцію, задіяні у підтриманні структурної цілісності їхніх молекул [11]. Залежність активності алкалофільних а-амілаз від іонів кальцію перешкоджає використанню їх як компонентів мийних засобів, оскільки останні зазвичай містять хелатуючі агенти [12].
а-Амілази містяться в організмах тварин, рослин, грибів і мікроорганізмів, проте тільки ензими мікробного походження використовують у промисловості [1], оскільки вони стабільніші, ніж рослинні та тваринні а-амілази, і можуть бути відносно легко отримані завдяки тому, що є позаклітинними
ензимами, які секретуються бактеріями в порівняно дешеві середовища культивування [13]. Як продуценти а-амілаз із бажаними властивостями у біотехнології часто використовують бактерії роду Bacillus [1, 7]. Різні види цього роду займають майже всі існуючі екологічні ніші і продукують ензими з різноманітними властивостями [14].
Досягнення найвищої продукції економічно важливих а-амілаз з бажаними властивостями — одне з основних завдань наукових досліджень. Надпродукції ензиму можна досягти двома шляхами: генетичними
маніпуляціями або оптимізацією умов культивування штаму-продуцента. Створення рекомбінантних штамів — високовартісний і тривалий процес, і часто рекомбінантний штам з посиленою продукцією ензиму нестабільний, тоді як збільшення синтезу ензиму у разі зміни складу живильного середовища чи умов культивування ґрунтується на природній стратегії адаптації мікробів до мінливих умов довкілля [15].
Метою цієї роботи було оптимізувати основні компоненти середовища культивування бактерій Bacillus sp. BKL40 для одержання найвищої продукції а-амілази, стабільної за підвищених температур, лужних значень рН і в присутності хелаторів.
Матеріали і методи
Штами і реактиви
У роботі використовували водорозчинний картопляний крохмаль, трис-(гідрокси-метиламінометан), хлорид кальцію, фосфат калію (однозаміщений), етилендіамінтетра-оцтову кислоту (ЕДТА) та етиленгліколь-^^№№-тетраоцтову кислоту (ЕГТА) («Sigma», США), пептон («Fluka», Німеччина), дріжджовий екстракт («Микроген», Росія). Решта використаних реактивів — вітчизняного виробництва. Усі застосовані в роботі реактиви були найвищого доступного ступеня чистоти.
Як препарат ензиму використовували стабільну за підвищених температур і лужних значень рН позаклітинну а-амілазу з бактерій роду Bacillus штаму BKL40, ізольованого та ідентифікованого нами як описано раніше [16].
Оптимізація середовища культивування
Культивування бактерій проводили в живильному середовищі такого складу (%, маса/об’єм): 0,1 KH2PO4; 0,25 Na2HPO4; 0,1 NaCl; 0,2 (NH4)2SO4; 0,005 MgSO47H2O; 0,005 CaCl22H2O (pH 6,5) [17]. Мінеральне
середовище доповнювали органічними компонентами: 0,025%-м крохмалем, 0,3%-м пептоном та 0,2%-м дріжджовим екстрактом для досягнення найбільшої продукції ензиму. Інокульоване бактеріями живильне середовище інкубували при температурі 40 0С на орбітальному шейкері Skyline (Литва) при 150 об/хв протягом 24 год.
Для отримання посівного матеріалу (іно-куляту) бактерії штаму-продуцента переносили мікробіологічною петлею у стерильних умовах у колбу Ерленмеєра місткістю 50 мл з 10 мл стерильного живильного середовища і культивували протягом 24 год у зазначених вище умовах.
Одержаний інокулят вносили у стерильних умовах у круглодонні колби місткістю 50, 100 чи 250 мл з 10, 20 чи 50 мл стерильного живильного середовища, відповідно, для отримання основних культур бактерій. Посівний матеріал додавали з розрахунку 0,5% інокуляту (об’єм/об’єм) відносно об’єму середовища. Культивування бактерій проводили протягом 24 год при 40 0С. Під час культивування здійснювали відбір з культур частини середовища культивування для визначення OD600 (параметра росту бактеріальної культури), концентрації позаклітинних протеїнів та активності а-амілази.
Вплив крохмалю на продукцію а-аміла-зи вивчали, додаючи різні концентрації водорозчинного картопляного крохмалю (0-1%) до складу мінерального живильного середовища, доповненого 0,3%-м пептоном і 0,2%-м дріжджовим екстрактом.
Важливість пептону для продукції а-амі-лази оцінювали, вносячи різні концентрації пептону (до 1% ) до складу неорганічного живильного середовища з 0,025% -м крохмалем і 0,2%-м дріжджовим екстрактом.
Роль дріжджового екстракту для синтезу і секреції а-амілази досліджували, додаючи його (до 1%) до неорганічного живильного середовища, яке містило 0,025% крохмалю і 0,2% пептону.
Одержання ензиму та визначення активності а-амілази
Після 24 год культивування бактеріальних культур клітини видаляли центрифугуванням при 8 000 g протягом 15 хв на центрифузі Опн-8 (СРСР). Отримані супернатанти використовували як препарати позаклітинної а-амілази. Для одержання вищої концентрації протеїну в отриманих ензимних препаратах проводили висолювання сульфатом амонію до досягнення 90%-го насичення. Осаджені протеїни відділяли центрифугуванням
(8000 g, 12 хв), а осади ресуспендували в невеликих об’ємах 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,0).
Амілолітичну активність визначали модифікованим йодометричним методом, який ґрунтується на зниженні інтенсивності забарвлення комплексу крохмаль — йод унаслідок зменшення концентрації крохмалю за дії а-амілази [18, 19]. Поглинання цього комплексу реєстрували при довжині хвилі 600 нм на спектрофотометрі 8реео1 211 (Німеччина). Активність а-амілази визначали в суміші (0,5 мл), яка містила 0,25 мл 1%-го розчину крохмалю і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0).
Перед додаванням препаратів ензимів суміш для реакції нагрівали до температури 40 0С протягом 5 хв. Одночасно з дослідними готували 10 проб калібрувального графіка з різною кількістю 1%-го розчину крохмалю, але без додавання ензиму. Ензимні препарати у дослідні проби додавали з розрахунку, щоб загальний об’єм буфера і препарату ензиму дорівнював 0,25 мл. Після 30 хв гідролізу за температури 40 0С суміш охолоджували протягом 3 хв на льоду для зупинення реакції. Для проведення вимірювання в лінійному діапазоні спектрофотометра всі проби розводили. При цьому з кожної проби відбирали 0,04 мл суміші, змішували з 0,4 мл розчину йоду-йодиду калію (0,025% J2 в 0,025% ^) в 0,2 н. НС1 і доводили об’єм проби до 2 мл охолодженою дистильованою водою.
Активність а-амілази розраховували за формулою:
Акт =
(С - С
V вих к
) • ^пр • П
І • ^преп • [пр°теш]
де Свих — вихідна концентрація крохмалю у пробах перед реакцією, мг/мл (0,1 мг/мл після розведення проб); Скін — кінцева концентрація крохмалю у пробах, обчислена за рівнянням калібрувального графіка, мг/мл; ^р — загальний об’єм проби, мл (2 мл після розведення проб); П — розведення проб перед вимірюванням (12,5 раза); і — час гідролізу, хв (30 хв); ^реп — об’єм ензимного препарату, мл; [протеїн] — концентрація загального протеїну в ензимному препараті, мг/мл.
За одиницю (1 Од) активності а-амілази приймали кількість крохмалю (мг), розщепленого за 1 хв у даних умовах. Питому активність виражали в перерахунку на 1 мг загального протеїну (Од/мг протеїну).
Визначення активності та стабільності а-амілази за різних значень рН
Вплив величини рН на активність а-амі-лази досліджували, визначаючи активність ензиму за різних значень рН. З метою уникнення небажаного впливу аніонів різних буферів використовували 50 мМ суміш цитрат-ного (15 мМ), фосфатного (20 мМ) і трис-(15 мМ) буферів, доведену до різних значень рН (від
4,0 до 12,0) методом титрування соляною кислотою чи гідроксидом калію. З метою підтримання рН суміші для визначення активності а-амілази 1%-ні розчини крох-малів готували на відповідних буферах для кожного значення рН. Ці ж самі буфери та розчини крохмалів використовували для приготування проб калібрувальних графіків для розрахунку активності а-амілази за досліджуваних значень рН відповідно до описаного вище.
Визначаючи стабільність а-амілази за різних значень рН, препарати ензиму змішували з відповідними буферами (аналогічними до буферів, використаних для визначення рН-залежності) та інкубували за кімнатної температури (25 0С) протягом 24 год. Одночасно з дослідними пробами інкубували відповідні кількості кожного буфера у пробах калібрувальних графіків, окремих для кожного значення рН. Перед визначенням залишкової активності а-амілази всі проби попередньо інкубували протягом 5 хв при 40 0С, а потім змішували з попередньо нагрітими до температури 40 0С 1%-ми розчинами крохмалів, приготованими на цих буферах. Подальші етапи визначення активності проводили згідно з описаною вище методикою.
Дослідження термостабільності
Для дослідження термостабільності ен-зимні препарати а-амілази (середовища культивування після видалення бактерій) інкубували на водяній бані за температур 60 і 70 0С упродовж 30 хв. Після інкубації денатуровані термолабільні протеїни відділяли центрифугуванням (8000 g, 15 хв) і в отриманих супернатантах визначали концентрацію загального протеїну та активність а-амілази відповідно до описаного вище.
Вплив хелаторів
До суміші для визначення а-амілазної активності (0,5 мл), яка містила 1%-й розчин крохмалю (0,25 мл) і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0), додавали розчин ЕДТА та ЕГТА до досягнення кінцевих концентрацій 1 і 10 мМ. Визначення залишкової
активності а-амілази проводили відповідно до вищенаведеного.
Вплив катіонів двовалентних металів
У суміш для визначення активності а-амі-лази, яка містила 1%-й розчин крохмалю і 50 мМ фосфатний буфер (рН 7,0), вносили розчини відповідних солей двовалентних металів до досягнення кінцевої концентрації іонів 1 мМ. Визначення залишкової активності а-амілази проводили згідно з описаним вище. Для дослідження впливу іонів Ca2+, Zn2+, Ba2+, Co2+, Mg2+, Mn2+ і Cu2+ використовували хлориди металів, а іони Fe2+ і Ni2+ додавали у вигляді сульфатів.
Визначення концентрації загального протеїну
Концентрацію загального протеїну визначали методом Бредфорда [20]. Для побудови калібрувального графіка використовували сироватковий бичачий альбумін.
Статистична обробка результатів
Статистичну обробку результатів проводили, застосовуючи програму MYNOVA [20]. Дані наведено як середні значення ± похибка середнього.
Результати та обговорення
Культивування бактерій
Бактерії вирощували при температурі 40 0С, оскільки ця температура була оптимальною для росту бактеріальної культури і синтезу а-амілази у більшості відомих продуцентів а-амілази з роду Bacillus [17, 21, 22]. Секрецію а-амілази бактеріями-продуцентами реєстрували з настанням експоненційної фази росту бактеріальної культури. Вміст ензиму в середовищі культивування зростав протягом логарифмічної фази росту та досягав максимального значення на 24-й год культивування. При подальшому культивуванні бактерій (до 48-ї год) активність а-амі-лази у середовищі культивування не змінювалась (рис. 1). Концентрація позаклітинних протеїнів збільшувалася протягом усього часу культивування. Проте оптична густина суспензії бактерій (OD600) — параметр росту бактеріальної культури — різко знижувалась, починаючи з 9-ї год культивування, оскільки бактеріальні клітини злипалися, незважаючи на інтенсивне перемішування середовища культивування.
Слід зауважити, що такі результати було одержано у разі внесення різної кількості посівного матеріалу (0,5 і 5%, об’єм/об’єм)
.5 и
teH І
S ^ ? ь s о ft в
А Ен О
‘й й W \
Й Ч
к
<
3,0-
2.5
2,0-
1,5.
1,0
0,5-
0,0-
750-1
600-
§450- /У\
Р А \
О ’ 1 If % '
□ 300- А/ :
150- 0- if t*» і—■—і—■—і—-—і—■—і—
0.0.7!! Ч
0 10 20 ЗО 40 50
Час культивування,год
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
Я
cd
ft
Н
И
ш
Я
и
о
К
Рис. 1. Ріст бактеріальної культури, накопичення зовнішньоклітинних протеїнів та активність а-амілази упродовж культивування бактерій Bacillus sp. BKL40.
Наведено дані типового експерименту
в основні культури. Наші результати добре узгоджуються з даними, отриманими іншими дослідниками, які додавали 1% (об’єм/об’єм) [23], 2% (об’єм/об’єм) [9, 22, 24], 5% (маса/об’єм) [17] або 10% (об’єм/об’єм) [25] іно-куляту відносно об’єму основних культур, проте у всіх випадках (незалежно від складу середовища) спостерігали найбільший вміст а-амілази після 24-48 год культивування бактерій-продуцентів.
Оптимізація концентрації крохмалю Продукція а-амілази, подібно до інших позаклітинних ензимів, потребує відповідного джерела вуглецю та азоту. Оскільки крохмаль є природним субстратом а-аміла-зи, секрецію деяких відомих а-амілаз стимулювали з використанням крохмалю у складі живильного середовища як єдиного джерела вуглецю [26, 27]. Для отримання найбільшої продукції а-амілази бактеріями роду Bacillus використовували живильні середовища з високою концентрацією крохмалю (1%) [21, 22, 25, 28]. У наших експериментах крохмаль концентрацією 1% у середовищі культивування Bacillus sp. BKL40 стимулював ріст бактеріальної культури і секрецію позаклітинних протеїнів, проте забезпечував надзвичайно низький вміст а-амілази серед цих протеїнів (низьку питому активність). Зате а-амілаза інтенсивно виділялася бактеріями за низької концентрації крохмалю —0,025%. Продукція а-амілази бактеріями штаму Bacillus sp. BKL40 мала конститутивний характер, ензим виділявся навіть у разі відсутності крохмалю в середовищі культивування (рис. 2). Подібні результати були отримані Z. Konsoula і M. Lia-kopoulou-Kyriakides [17], найбільшої
продукції а-амілази бактеріями Bacillus sub-tilis досягали в присутності 0,05%-го крохмалю, а також без додавання крохмалю в живильне середовище.
-і 2000
1500
Я
1000 о
500
Jo
Рис. 2. Вплив різних концентрацій крохмалю на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та активність а-амілази (п = 3)
Оптимізація концентрації пептону
Синтез а-амілази залежить від наявності джерела азоту в середовищі культивування [29, 30]. Незважаючи на спроби знайти альтернативні джерела азоту для продукції а-амі-лази, як, зокрема, соєва мука [15, 24, 31], м’ясний екстракт [9] та пшеничні висівки [22], найчастіше дослідники використовують пептон і дріжджовий екстракт у різних концентраціях та комбінаціях [9, 32, 33].
З метою отримання найбільшої продукції а-амілази в живильне середовище додавали різні концентрації пептону (0-1%). У разі культивування бактерій у плоскодонних колбах активність а-амілази в середовищі культивування зростала зі збільшенням концентрації пептону в ньому від 0 до 0,2%. Подальше збільшення концентрації пептону призводило до зниження вмісту а-амілази серед інших позаклітинних протеїнів, хоча при цьому досягали найвищих показників росту бактеріальної культури і секреції позаклітинних протеїнів (рис. 3, А). Ці результати відрізняються від результатів
C. Teodoro і M. Martins [33] та B. Dettori-Campus зі співавт. [34], які отримали найбільшу продукцію а-амілази, додаючи 1 % -й пептон у середовище культивування бактерій роду Bacillus. В аналогічних експериментах, але із застосуванням круглодон-них колб для культивування бактерій негативний ефект високих концентрацій пептону послаблювався, і максимальний
вміст а-амілази спостерігався при концентраціях пептону в середовищі культивування 0,3-0,7%. Однак за наявності 1%-го пептону в живильному середовищі активність а-амілази була на 35% нижчою, ніж у присутності 0,3%-го пептону (рис. 3, Б).
1200
Є
800 О
400
0,05 0,1 0,2 03 0,5 0,7
Концентрація пептону, %
Рис. 3. Вплив різних концентрацій пептону на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та активність а-амілази.
Культивування проводили в плоскодонних (А) і круглодонних (Б) колбах. А — наведено усереднені дані трьох експериментів, Б — наведено результати типового експерименту
Колби Ерленмеєра дослідники найчастіше використовують для культивування мікроорганізмів, проте вони не забезпечують належної аерації та перемішування живильного середовища, а ці параметри надзвичайно важливі для продукції позаклітинних ензимів. Подібні небажані ефекти у разі застосування плоскодонних колб були зауважені S. Narang і T. Satyanarayana [35] та J. Uma Maheswar Rao і T. Satyanarayana [10], особливо зі збільшенням відношення об’єму середовища культивування до загального об’єму колби. Тому всі наступні
експерименти ми проводили, використовуючи круглодонні колби.
Оптимізація концентрації дріжджового екстракту
Дріжджовий екстракт найчастіше доповнює пептон у складі живильних середовищ для культивування різних мікроорганізмів. Він є важливим фактором синтезу а-амілази мікробними продуцентами [36]. Дріжджовий екстракт слугував єдиним джерелом азоту для отримання максимальної продукції а-амілази з Bacillus sp. IMD434 [37]. Проте у деяких випадках дріжджовий екстракт не впливав на продукцію а-амілази бактеріями Bacillus sp. [23].
Ми виявили залежний від концентрації ефект дріжджового екстракту на продукцію а-амілази бактеріями Bacillus sp. BKL40 (рис. 4). Збільшення концентрації дріжджового екстракту до 0,2% стимулювало продукцію а-амілази, проте подальше зростання його концентрації в середовищі культивування мало протилежний ефект. Подібні результати одержали R. Saxena зі співавт. [9], які спостерігали максимальну продукцію а-амілази бактеріями Bacillus sp. PN5 у разі додавання 0,5%-го пептону і 0,3%-го дріжджового екстракту. Слід зазначити, що в наших експериментах дріжджовий екстракт справляв позитивний ефект на ріст бактеріальної культури та продукцію а-амілази, проте при цьому він майже не впливав на синтез і секрецію позаклітинних протеїнів, концентрація яких не змінювалася за різних концентрацій дріжджового екстракту (за винятком 1%-го).
з-
.5 м
СО
* о
hQB й ч
go ' w <
0.04
м
¡1—І ф Ен О ft В
Я
cd
ft
Ен
и
ф
я
и
О
К
0,05
0,7
0,00
1500
а
750 О
0,1 0.2 0,3 0,5
Концентрація дріжджового екстрату, %
Рис. 4. Вплив різних концентрацій дріжджового екстракту на ріст бактеріальної культури, секрецію зовнішньоклітинних протеїнів та вміст а-амілази (п = 3)
рН-залежність і рН-стабільність
Незважаючи на наявність багатьох продуцентів а-амілази серед бактерій роду Bacillus, розвиток біотехнології вимагає пошуку нових продуцентів а-амілаз із бажаними властивостями. Зокрема, відносно новим напрямом використання а-амілаз є включення їх до складу мийних засобів. Проте для цих потреб можна застосовувати тільки алкалофільні та алкалостабільні ензими [6]. Більшість відомих термостабільних а-амі-лаз характеризуються найвищою активністю за нейтральних чи слабокислих значень з рН-оптимумами при рН 5,5 [25], 6,0 [38] або в межах 5,0-7,0 [24].
Досліджувана нами а-амілаза з Bacillus sp. BKL40 мала однаково високу активність у широкому діапазоні рН — від 6,0 до 11,0 без явного рН-оптимуму (рис. 5, А). Подібний характер рН-залежності виявляла а-амі-лаза з термофільного штаму Bacillus sp. SMIA-2 [39]. Висока активність за лужних значень рН дозволяє характеризувати а-амі-лазу з Bacillus sp. BKL40 як алкалофільний ензим. Алкалофільні а-амілази знайдено в окремих представників роду Bacillus. Зокрема, Bacillus sp. TS-23 продукував а-аміла-зу з рН-оптимумом близько рН 9,0 [8], Bacillus sp. PN5 виділяв а-амілазу, яка виявляла найвищу активність при рН 10,0 [9], а Bacillus sp. GM8901 секретував а-амілазу з рН-оптимумом між 10,0 і 11,0 [6].
Для ензимів, які можуть бути потенційно використані для промислових цілей, украй важливо не тільки мати високу активність за лужних значень рН, але й підтримувати активність упродовж інкубації за цих значень рН. Так, активність а-амілази з Bacillus sp. PN5 не змінювалася після 6 год інкубації за різних значень рН — від 5,0 до 11,0 [9], а активність а-амілази з G. thermodenitri-ficans HR010 не зазнавала змін після 24 год інкубації при рН 4,0-9,0 [25]. Використана у наших дослідженнях а-амілаза з Bacillus sp. BKL40 повністю зберігала амілолітичну активність після 24 год інкубації в діапазоні значень рН 7,0-12,0 (рис. 5, Б). Проте досліджуваний ензим втрачав активність під час інкубації за кислих значень рН. Після 24 год перебування при рН 4,0-5,0 активність а-амілази знижувалася до 6-7% відносно максимального значення. Подібний характер стабільності за різних значень рН типовий для більшості досліджених ал-костабільних а-амілаз, які нездатні довго підтримувати свою ензимативну активність при рН, нижчих ніж 6,0 [40].
pH
pH
Рис. 5. Вплив величини рН на активність (А) і стабільність (Б) а-амілази з Bacillus sp. BKL40 (n = 3-5)
Термостабільність є критично важливою характеристикою для можливого промислового використання а-амілаз [7]. Більшість індустріальних процесів проводять при температурах, вищих за 50 0С, оскільки при цьому досягається вища швидкість реакції і знижується ризик бактеріального забруднення продукції [1, 7]. Значну частину наукових робіт присвячено пошукові продуцентів термостабільних а-амілаз, у тому числі серед бактерій роду Bacillus [8, 9, 25,
39, 41].
Однак для амілолітичних ензимів надзвичайно важливо не тільки виявляти, але й підтримувати високу активність за підвищених температур якомога довше. Зазвичай молекули протеїнів не здатні довго витримувати температуру близько 100 0С у зв’язку
з незворотними змінами у структурі їхніх молекул. Тому а-амілази, які мають найвищу активність за високих температур, швидко втрачають її вже після кількох хвилин перебування за цих температур унаслідок термічної денатурації протеїнових молекул.
Наприклад, а-амілази з Bacillus sp. I-3 і G. thermodenitrificans HR010 виявляли найвищу швидкість гідролізу крохмалю при 70 і 80 0C відповідно, проте втрачали 30 і 100% своєї активності після 30 хв інкубації за цих температур [24, 25].
Досліджуючи стабільність а-амілази з Bacillus sp. BKL40 після 30 хв інкубації при 60 і 70 0С, ми встановили, що її питома активність навіть збільшувалась у 3 й 4 рази (рис. 6). Зростання питомої активності протягом інкубації за підвищених температур частково може пояснюватися денатурацією термолабільних протеїнів у неочищеному препараті досліджуваної а-амілази (рис. 6).
120
и
CJ
О
И
ч
•>н
м
100
80
60
40
20-
0
І -І Контроль
^■60 °С І І 70 °С
Активність
а-амілази
Концентрація протеїну
Рис. 6. Термостабільність а-амілази з Bacillus sp. BKL40.
Значення подано як відносні величини щодо відповідних максимальних значень.
Наведено дані типового експерименту
Вплив хелаторів
Застосування більшості відомих а-амі-лаз потребує додавання іонів кальцію, які стабілізують структуру цих ензимів [11]. Залежність активності та стабільності а-амі-лаз від іонів кальцію є небажаною у разі використання їх у складі мийних засобів, оскільки останні часто містять сполуки, що здатні хелатувати метали [12]. Окрім цього іони Са2+, додані під час процесу розрідження крохмалю за участю а-амілази, слід видаляти з продуктів гідролізу за допомогою іонообмінників [10], аби перешкодити формуванню і накопиченню кристалів оксалату кальцію у продуктах та складових частинах ензимерів [7]. Тому на сучасному етапі наукових досліджень у цій царині значний інтерес становить виявлення нових продуцентів термостабільних а-амілаз, здатних функціонувати в умовах лужних значень рН без додавання іонів кальцію.
Більшість відомих Са2+-вмісних а-амілаз надзвичайно чутливі до дії ЕДТА [24, 42, 43] та ЕГТА [25]. На відміну від них а-амілаза з Bacillus sp. BKL40 не інгібувалася з додаванням 1 і 10 мМ цих хелаторів (рис. 7).
Контроль 1 мМ 10 мМ
Концентрація хелаторів, мМ
Рис. 7. Вплив хелаторів на активність а-амілази з Bacillus sp. BKL40 (n = 3)
Ефект катіонів двовалентних металів
Ми досліджували вплив катіонів різних двовалентних металів з метою виявити кофактори, які впливають на активність а-амі-лази з Bacillus sp. BKL40 (табл.). Активність ензиму не змінювалась у присутності 1 мМ всіх досліджуваних катіонів і, зокрема, з додаванням кальцію, на відміну від активності а-амілаз, отриманих з інших продуцентів [6, 11, 24].
Недоліком Са2+-вмісних а-амілаз є зниження їхньої активності у присутності певних катіонів через конкурентну взаємодію між доданими катіонами та зв’язаними з протеїновими молекулами [44]. Так, зокрема, а-амілаза Bacillus sp. SMIA-2 інгібува-
лась у разі додавання 1 мМ Co2+, Cu2+ і Ba2+ [39], а а-амілаза з Bacillus sp. KSM-1378 — з додаванням 1 mM Ni2+, Cd2+, Zn2+ і Hg2+ [45]. Відсутність ефекторного впливу іонів двовалентних металів на активність досліджуваної нами а-амілази може свідчити про відсутність іонів кальцію у структурі її молекули. На сьогодні вже відомі а-амілази, наприклад а-амілаза з Bacillus sp. К8М-К38 [46], які не містять іонів кальцію у своїй структурі, а тому потенційно можуть бути використані як компоненти мийних засобів.
У результаті проведених досліджень оп-тимізовано умови культивування Bacillus sp. BKL40 для одержання найвищого виходу а-амілази, стабільної за підвищених температур і лужних значень рН. Найбільшої продукції а-амілази досягали, використовуючи низькі концентрації крохмалю в середовищі культивування. Продукцію ензиму стимулювали, додаючи у середовище культивування пептон і дріжджовий екстракт; найбільший вихід ензиму спостерігався, коли застосовували 0,3%-й пептон і 0,2%-й дріжджовий екстракт. а-Амілаза з Bacillus sp. BKL40 мала значну термостабільність і повністю зберігала свою активність після 30 хв інкубації при 60-70 0С. Досліджувана а-амілаза виявляла високу активність за лужних значень рН (9,0-11,0) і зберігала її навіть після 24 год інкубації за цих значень рН. Ензим не інгібувався з додаванням 1 і 10 мМ ЕГТА та ЕДТА і не активувався іонами кальцію. Одержані результати уможливлюють припущення щодо відсутності іонів кальцію у структурі досліджуваної а-аміла-зи, що дає переваги цьому ензиму порівняно з більшістю схожих термо- і алкалостабіль-них, проте Са2+-вмісних а-амілаз.
Вплив катіонів двовалентних металів на активність а-амілази з Bacillus sp. BKL40
Л
ОмЕн
s * И
sis
о
Катіони двовалентних металів (1 мМ)
Конт- роль Са2+ Fe2+ Ba2+ Ni2+ Zn2+ Cu2+ Co2+ Mg2+ Mn2+
4,95 5,61 5,42 5,81 5,02 5,05 4,62 5,19 5,55 5,54
ЛІТЕРАТУРА
1. Pandey A., Nigam P., Soccol C. R. et al. Advances in microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2000. — V. 31,N 2.— P. 135-152.
2. Van der Maarel M. J. E. C., van der Veen B., Uitdehaag J. C. M. et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family // J. Biotechnol. — 2002. — V. 94. — P. 137-155.
3. Vihinen M., Mantsala P. Microbial amylolytic enzymes // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. — 1989. — V. 24, N4. — P. 329-418.
4. Somers W., Visser J., Rombouts F. M., Riet K. Developments in downstream processing of (poly)saccharide converting enzymes // J. Biotechnol. — 1989. — V. 11, N2-3. — P. 199-222.
5. Kandra L. a-Amylases of medical and industrial importance // J. Mol. Structure (Theochem). — 2003. — V. 666-667. — P. 487-498.
6. Kim T. U., Gu B. G., Jeong J .Y. et al. Purification and characterization of a mal-totetraose-forming alkaline a-amylase from an alkalophilic Bacillus strain GM8901 // Appl. Environ. Microbiol. — 1995. — V. 61, N8. — P. 3105-3112.
7. Haki G. D., Rakshit S. K. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review // Bioresour. Technol. — 2003. — V. 89, N1. — P. 17-34.
8. Lin L. L., Chyau C. C., Hsu W. H. Production and properties of a raw starch-degrading amylase from the thermophilic and alka-lophilic Bacillus sp. TS-23 // Biotechnol. Appl. Biochem. — 1998. — V. 28, N1. — P. 61-68.
9. Saxena R. K., Dutt K., Agarwal L., Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5 // Bioresour. Technol. — 2007. — V. 98, N 2. — P. 260-265.
10. Uma Maheswar Rao J. L., Satyanarayana T. Enhanced secretion and low temperature stabilization of a hyperthermostable and Ca2+-independent a-amylase of Geobacillus ther-moleovorans by surfactants // Lett. Appl. Microbiol. — 2003. — V. 36. — P. 191-196.
11. Vallee B. L., Stein E. A., Sumerwell W. N., Fisher E. H. Metal content of amylases of various origins // J. Biol. Chem. — 1959. — V. 234. — P. 2901-2905.
12. Nielsen J. E., Borchert T. V. Protein engineering of bacterial a-amylases // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. — V. 1543, N2. — P. 253-274.
13. Gupta R., Gigras P., Mohapatra H. et al. Microbial a-amylases: a biotechnological perspective // Process Biochem. — 2003. — V. 38, N11. — P. 1599-1616.
14. Priest F. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus // Bacteriol. Rev. — 1977. — V. 41, N3. — P. 711-753.
15. Dey G., Mitra A., Banerjee R., Maiti B. R. Enhanced production of amylase by optimization of nutritional constituents using response surface methodology // Biochem. Eng. — 2001. — V. 7. — P. 227-231.
16. Кубрак О. І., Лущак В. І. Скринінг штамів Bacillus sp. — продуцентів термостабільної амілази // Мікробіол. журн. — 2007. — Т. 69, №5. — С. 26-34.
17. Konsoula Z., Liakopoulou-Kyriakides M. Hydrolysis of starches by the action of an а-amylase from Bacillus subtilis // Process Biochem. — 2004. — V. 39, N11. — P. 1745-1749.
18. Fuwa H. A new method for microdetermination of amylase activity by use of amylose as the substrate // J. Biochem. — 1954. — V. 41, N5. — P. 583-603.
19. Xiao Z., Storms R., Tzang A. A quantitative starch-iodine method for measuring alphaamylase and glucoamylase activities // Anal. Biochem. — 2006. — V. 351, N 1. — P. 146-148.
20. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. — 1976. — V. 72. — P. 248-254.
21. Mendu D. R., Ratnam B. V. V., Purnima A., Ayyanna C. Affinity chromatography of а-amylase from Bacillus licheniformis // Enz. Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N7. — P. 712-717.
22. Haq I., Ashraf H., Iqbal J., Qadeer M. A. Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using an economical medium // Bioresour. Technol. — 2003. — V. 87, N1. — P.57-61.
23. Tanyildizi M. S., Ozer D., Elibol M. Optimization of а-amylase production by Bacillus sp. using response surface methodology // Process Biochem. — 2005. — V. 40, N7. — P. 2291-2296.
24. Goyal N., Gupta J. K., Sony S. K. A novel raw starch digesting thermostable а-amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch // Enz. Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N7. — P. 723-734.
25. Ezeji T., Bahl H. Purification, characterization, and synergistic action of phytate-resis-tant а-amylase and а-glucosidase from Geobacillus thermodenitrificans HR010 // J. Biotechnol. — 2006. — V. 125, N1. — P. 27-38.
26. Lin L. L., Tsau M. R., Chu W. S. General characteristics of thermostable amylopullu-lanases and amylases from the alkalophilic
Bacillus sp. TS-23 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1994. — V. 42, N 1. — P. 51-56.
27. Bajpai P., Bajpai P. High-temperature alkaline a-amylase from Bacillus licheniformis TCRDC-B13 // Biotechnol. Bioeng. — 1989. — V. 33. — P. 72-78.
28. Mitsuiki S., Mukae K., Sakai M. et al. Comparative characterization of raw starch hydrolyzing a-amylases from various Bacillus strains // Enzyme Microb. Technol. — 2005. — V. 37, N4. — P. 410-416.
29. Hewitt C. J., Solomons G. L. The production of a-amylase (E.C.3.2.1.1) by Bacillus amy-loliquefaciens, in a complex and a totally defined synthetic culture medium // J. Ind. Microbiol. — 1996. — V. 17, N2. — P. 96-99.
30. Hillier P., Wase D. A. J., Emery A. N. Production of a-amylase (E.C.3.2.1.1) by Bacillus amyloliquefaciens in batch and continuous culture using a defined synthetic medium // Biotechnol. Lett. — 1996. — V. 18, N7. — P. 795-800.
31. Soni S. K., Kaur A, Gupta J. K. A solid state fermentation based bacterial a-amylase and fungal glucoamylase system and its suitability in the hydrolysis of wheat starch // Process Biochem. — 2003. — V. 39, N2. — P. 185-192.
32. Santos E., Martins M. L. L. Effect of the medium composition on formation of amylase by Bacillus sp. // Braz. Arch. Biol. Technol. — 2003. — V. 46, N 1. — P. 129-134.
33. Teodoro C. E. D., Martins M. L. L. Culture conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp. // Braz. J. Microbiol. -2000. — V. 31. — P. 298-302.
34. Dettori-Campus B. G., Priest F. G., Stark J. R. Hydrolysis of starch granules by the amylase from Bacillus stearothermophilus NCA 26 // Process Biochem. — 1992. — V. 27, N1. — P. 17-21.
35. Narang S., Satyanarayana T. Thermostable a-amylase production by an extreme ther-mophile Bacillus thermoleovorans // Lett. Appl. Microbiol. — 2001. — V. 32, N1. — P. 31-35.
36. Alam S., Hong J., Weigand W. A. Effect of yeast extract on a-amylase synthesis by Bacillus amyloliquefaciens // Biotechnol. Bioeng. — 1989. — V. 33, N6. — P. 780-785.
37. Hamilton L. M., Kelly C. T., Fogarty W. M. Purification and properties of the raw starch degrading a-amylase of Bacillus sp. IMD 434 // Biotechnol. Lett. — 1999. — V. 21, N2. — P. 111-115.
38. Bessler C., Schmitt J., Maurer K-H., Schmid R. D. Directed evolution of bacterial a-amy-lase: Toward enhanced pH-performance and higher specific activity // Prot. Sci. — 2003. — V. 12, N 10. — P. 2141-2149.
39. Cordeiro C. A. M., Martins M. L. L., Luciano A B. Production and properties of a-amylase from thermophilic Bacillus sp. // Braz. J. Microbiol. — 2002. — V. 33, N1. — P. 57-61.
40. Crabb W., Mitchinson E. C. Enzymes involved in the processing of starch to sugars // Trends Biotechnol. — 1997. — V. 5. — P. 349-352.
41. Mamo G., Gashe B. A., Gessesse A A highly thermostable amylase from a newly isolated thermophilic Bacillus sp. WN11 // J. Appl. Microbiol. — 1999. — V. 86, N4. — P. 557-560.
42. Shaw J. F., Lin F. P., Chen S. C., Chen H. C. Purification and properties of an extracellular a-amylase from Thermus sp. // Bot. Bull. Acad. Sin. — 1995. — V. 36. — P. 195-200.
43. Nielsen A. D., Pusey M. L., Fuglsang C. C., Westh P. A proposed mechanism for the thermal denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus a-amylase — the effect of calcium ions // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — V. 1652, N1. — P. 52-63.
44. Levenque E., Janecek S., Haye B., Belarbi A. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes // Enzyme Microbiol. Technol. — 2000. — V. 26, N1. — P. 3-14.
45. Igarashi K., Hatada Y., Hagihara H. et al. Enzymatic properties of a novel liquefying a-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences // Appl. Environ. Microbiol. — 1998. — V. 64, N9. — P. 3282-3289.
46. Nonaka T., Fujihashi M., Kita A., Hagihara H. et al. Crystal structure of calcium-free a-amylase from Bacillus sp. strain KSM-K38 (AmyK38) and its sodium binding sites // J. Biol. Chem. — 2003. — V. 278, N27. — P. 24818-24824.
ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА а-АМИЛАЗЫ ИЗ Bacillus sp. BKL40
О. И. Кубрак, В. И. Лущак
Прикарпатский национальный университет им. В. Стефаныка, Ивано-Франковск
E-mail: lushchak@pu.if.ua
Изолирован штамм Bacillus sp. BKL40, способный секретировать в среду культивирования а-амилазу, стабильную в условиях высоких температур и щелочных значений рН. Оптимизацией условий культивирования штамма-продуцента достигнута наивысшая продукция энзима. Синтез а-амилазы не зависел от наличия крахмала в среде культивирования и стимулировался добавлением пептона (0,3%) и дрожжевого экстракта (0,2%). Энзим полностью сохранял амилолитическую активность после 30 мин инкубации при 60 и 70 0С. а-Амилаза проявляла высокую активность в широком диапазоне значений рН — от 6,0 до
11,0 и сохраняла активность даже после 24 ч инкубации при щелочных значениях рН. Изучаемая а-амилаза не активировалась ионами кальция и других двухвалентных металлов (1 мМ), а также не ингибировалась ЭДТА и ЭГТА (1 и10 мМ), что может свидетельствовать об отсутствии ионов кальция в структуре ее молекулы.
Ключевые слова: а-амилаза, Bacillus sp., алкало-стабильность, термостабильность, продукция.
PRODUCTION AND PROPERTIES OF a-AMYLASE FROM Bacillus sp. BKL40
O. I. Kubrak, V. I. Lushchak
Vassyl Stefanyk Precarpathian National University, Ivano-Frankivsk
E-mail: lushchak@pu.if.ua
Strain BKL40 was identified as a producer of thermostable alkaline a-amylase. Maximum production of this a-amylase was achieved by optimizing culture conditions. Production of a-amy-lase seemed to be independent on the presence of starch in the culture medium and was stimulated by peptone (0.3%, w/v) and yeast extract (0.2%, w/v). The enzyme was thermostable and retained amylolytic activity after 30 min of incubation at 60 and 70 0C. High activity was maintained over a broad pH range from 6.0 to 11.0 and the enzyme remained active after alkaline incubation for 24 h. Bacillus sp. BKL40 a-amylase was not stimulated by calcium and other bivalent metal cations at 1mM and was not inhibited by EGTA or EDTA at 1-10 mM, suggesting that this a-amylase does not contain calcium ions in its active site.
Key words: a-amylase, Bacillus sp., alkalostability, thermostability, production.
