CC BY
70
Получение и обратимая агрегация клеток человека, включенных в биосовместимую полисахаридную оболочку
Р.А. Мухамадеева, И.И. Мавлютова, О.В. Бондарь Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
Preparation and reversible aggregation of human cells encased in biocompatible polysaccharide shell
R.A. Mukhamadeeva, I.I. Mavlyutova, O.V. Bondar Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan
Методом динамического рассеяния света исследованы процессы осаждения катионного (хитозана) и анионного (альгиновой кислоты) полисахаридов на поверхности нормальных и опухолевых клеток человека. Предложен способ формирования многослойной полимерной оболочки, образуемой путем электростатической адсорбции полисахаридов на поверхности плазмалеммы клеток. По данным конфокальной микроскопии полимерная оболочка равномерно покрывает клетки и имеет толщину в 1—5 мкм. В условиях эксперимента модификация полисахаридами угнетает жизнеспособность фибробластов кожи человека, но не проявляет цитотоксичности для клеток HeLa. Предложен подход к контролируемой и обратимой агрегации модифицированных клеток путем их кросс-сшивки ионами кальция. Образующиеся при этом многоклеточные агрегаты имеют сферическую форму и размер от 100 до 500 мкм. Предложенные подходы и методы являются альтернативой микроинкапсуляции клеток и представляют интерес для создания трехмерных моделей клеток и технологий их доставки in vivo.
Ключевые слова: микроинкапсуляция клеток; полисахариды; плазматическая мембрана; клеточные сфероиды; тканевая инженерия.
На сегодняшний день трансплантация клеток является перспективным подходом в лечении многих заболеваний и травм [1]. Исследования последних лет показывают, что различные клетки, в частности, фибробласты [2], эпителиальные клетки [3], Шван-новские клетки [4], а также мультипотентные мезенхимные стромальные клетки [5, 6] обладают значительным потенциалом для обеспечения регенерации большинства тканей человека.
Эффективность методов клеточной терапии напрямую зависит от оптимальной локализации и «приживаемости» трансплантируемых клеток. Для повышения эффективности доставки клеток применяют различные подходы, например, включение клеток в биосовместимые гидрогелевые матриксы или микрокапсулы [7]. Предложены способы инкапсуляции стволовых клеток в микросферы на основе альгиновой кислоты и коллагена в качестве систем доставки в поврежденные ткани [8, 9].
Перспективной альтернативой микроинкапсуляции является подход, основанный на послойной модификации клеток тонкой полимерной оболочкой, защищающей клетку от факторов внешней среды и не препятствующей транспорту питательных веществ/ метаболитов [10, 11]. Нами разработаны способы модификации клеток человека в гидрогелевую
e-mail: oxanav.bondar@gmail.com
A deposition of cationic (chitosan) and anionic (alginic acid) polysaccharides onto the surface of normal and cancer human cells was studied with the use of dynamic light scattering. A method for preparation of multilayer polymeric shell by means of electrostatic adsorption of polysaccharides onto cell plasma membrane has been proposed. According to confocal microscopy, the polymeric shell evenly covers the cell and is 1—5 ^m in thickness. Under experimental conditions, the modification with polysaccharides inhibits human skin fibroblasts growth but does not exhibit cytotoxicity to HeLa cells. We developed an approach to controllable and reversible aggregation of modified cells by their cross-linking in the presence of calcium ion. Resulting aggregates have spherical shape and the size of 100—500 ^m. Proposed approaches and methods represent an alternative to cell microencapsulation technique and are of interest for the development of three-dimensional cell models and their delivery in vivo.
Key words: cell microencapsulation; polysaccharides; plasma membrane; cell spheroids; tissue engineering.
оболочку из природных полисахаридов и контролируемой агрегации модифицированных клеток для получения сфероидов в качестве трехмерных моделей культур клеток.
Материал и методы
В работе использовали: хитозан, пропидия йодид, йАР1 (4',6^а1т^то-2-рЬ|епу1^о1е), кальцеин-АМ ^дта-АШпсЬ|, США), альгинат натрия, люцифер желтый Acгos Огдап^.
Клетки аденокарциномы эпителия шейки матки (HeLa) и первичные фибробласты кожи человека культивировали соответственно в средах йМЕМ и а-МЕМ, содержащих 10% сыворотки крови плода коровы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. После достижения монослоя клетки трип-синизировали, отмывали от среды и суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, рН 7,4) в концентрации около 1 млн клеток на 1 мл.
Хитозан и альгинат адсорбировали на поверхности плазматической мембраны, последовательно выдерживая клетки в растворах полимеров и осаждая центрифугированием. Процедуру повторяли 4—6 раз для формирования многослойных оболочек на поверхности клеток. На каждом этапе адсорбции реги-
стрировали электрокинетический потенциал (дзета-потенциал) клеток методом электрофоретического светорассеяния на анализаторе Zetasizer NanoZS (Malvern, США) в U-образной кювете при pH 7,4.
Для анализа цитосовместимости полисахаридной оболочки модифицированные клетки культивировали в стандартных условиях 4 сут. Живые и нежизнеспособные/погибшие клетки окрашивали соответственно кальцеином-AM и пропидия йодидом и визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer A1 (Carl Zeiss, Германия).
Для визуализации полисахаридной оболочки клеток к альгиновой кислоте ковалентно пришивали флуоресцентную метку люцифер желтый с помощью карбодиимидной реакции. Модифицированные клетки фиксировали в растворе параформальдегида; ядра клеток окрашивали DAPI.
Модифицированные полисахаридной оболочкой клетки с альгинатом в верхнем слое агрегировали путем ионотропной кросс-сшивки в присутствии хлорида кальция при комнатной температуре при перемешивании. Образующиеся агрегаты фиксировали в растворе параформальдегида. Фиксированные клетки и агрегаты, нанесенные на предметные стекла в среде заключения, анализировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCP SP2 (Leica Microsystems, США) с использованием иммерсионного объектива.
Диссоциацию агрегатов до исходных модифицированных клеток проводили путем обработки избытком ЕДТА.
Результаты и обсуждение
Для заключения клеток в гидрогелевую оболочку были выбраны биосовместимые полисахариды — хи-тозан и альгиновая кислота (АК), широко используемые для создания биоматериалов [12]. Полимеры осаждали на поверхности клеток HeLa посредством электростатической адсорбции. Процесс модификации контролировали с использованием метода электрофоретического светорассеяния, который позволяет оценивать электрокинетический (дзета-потенциал) клеток человека в суспензии [13, 14].
На первой стадии модификации поликатион хи-тозан электростатически адсорбировали на отрицательно заряженной плазмалемме клеток HeLa. Установлено, адсорбируемый хитозан вызывает нейтрализацию отрицательного заряда клеток (-22,5±0,8 мВ) (рис. 1), а в насыщающей концентрации — перезарядку клеток до значения дзета-потенциала + 9,7 мВ.
В результате последующей адсорбции АК на поверхности клеток последние вновь приобретают отрицательный дзета-потенциал более —40 мВ. Таким образом, последовательное выдерживание клеток в растворах хитозана и АК сопровождалось перезарядкой клеток вследствие формирования модифицирующих слоев полисахаридов (рис. 1). Это свидетельствует об образовании полимерной оболочки вокруг клеток за счет электростатического взаимодействия противоположно заряженных полисахаридов.
Сходное изменение поверхностного заряда клеток наблюдали при модификации фибробластов кожи человека (данные не показаны).
Присутствие полисахаридной оболочки на поверхности клеток после модификации подтверждено
данными лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (рис. 2). Выяснено, что все модифицированные клетки окружены индивидуальными оболочками, толщина которых варьирует в среднем от 1 до 4 мкМ. Результаты указывают на то, что противоположно заряженные полисахариды, электростатически взаимодействуя между собой, образуют относительно толстые покрытия вокруг клетки. В нативных условиях эти покрытия, очевидно, представляют собой тонкий слой полисахаридного гидрогеля.
Нами исследовано влияние полимерной оболочки, полученной после 4 и 6 этапов модификации, на жизнеспособность и пролиферацию клеток HeLa и фибробластов кожи. Для этого исходные и модифицированные клетки культивировали в стандартных условиях и далее окрашивали смесью кальцеин-АМ/пропидия йодид для выявления соответственно жизнеспособных и погибших клеток.
+10-
0
-10-20S
5" -30-
Зі -50м
ч
0 1 2 Количество слоев
Рис. 1. Изменение дзета-потенциала клеток HeLa при последовательной модификации плазматической мембраны хитозаном и альгиновой кислотой
Рис. 2. Клетки HeLa, модифицированные оболочкой из хитозана и меченой альгиновой кислоты. Лазерная сканирующая конфокальная микрофотография.
Окраска ядер: DAPI
3
4
5
6
Рис. 3. Клетки HeLa и фибробласты кожи человека, модифицированные полисахаридной оболочкой, 3 сут. культивирования: А, В - клетки HeLa (4- и 6-слойная оболочка соответственно);
С - фибробласты (4-слойная оболочка). Флуоресцентная микроскопия.
Окраска: кальцеин-АМ, пропидия йодид. Шкала - 50 мкм
На рис. 3 представлены флуоресцентные микрофотографии клеток на 3-й день культивирования. Установлено, что модификация клеток как 4-, так и 6-слойной оболочкой не препятствовала их адгезии и пролиферации. В случае 6-слойной модификации наблюдалось появление небольшого числа погибших клеток (см. рис. 3). По-видимому, в результате последней модификации образуется более плотная оболочка, которая затрудняет высвобождение клеток и их адгезию на поверхности.
Первичные фибробласты проявляли большую чувствительность к модификации, чем клетки HeLa. Так, уже 4-слойная полимерная оболочка вызывала понижение жизнеспособности у значительного числа клеток. При этом большинство клеток оставались заключенными в оболочку и не прикреплялись к поверхности планшета в отличие от контрольных не-модифицированных клеток (не показано).
Результаты показывают, что получаемая полисахаридная оболочка частично снижает жизнеспособность клеток человека, и этот эффект более выражен для первичных клеток. Цитотоксичность полимерной оболочки возможно обусловлена как ее прямым действием на целостность и функционирование плазматической мембраны, так и опосредованным ингибированием транспорта питательных веществ в клетку.
Модифицированные клетки содержат в наружном слое альгиновую кислоту — полисахарид, образованный остатками полиуроновых кислот. Известно, что в присутствии ионов двухвалентных металлов, хелатирующих карбоксильные группы, альгиновая кислота образует гидрогель. Кросс-сшивку альгино-вой кислоты ионами кальция и бария используют для инкапсулирования различных клеток в полимерные микрочастицы [10]. Нами исследована возможность контролируемой агрегации модифицированных клеток путем кросс-сшивки в присутствии Са2+.
Добавление к клеткам HeLa, модифицированным 6-слойной оболочкой, 20—100 мМ Са2+ сопровождалось образованием сферических клеточных агрегатов, размер которых варьировал в диапазоне 100-500 мкм в зависимости от плотности суспензии и концентрации клеток. Типичная микрофотография многоклеточного сфероида, полученного при кросссшивке модифицированных клеток, показана на рис. 4.
Рис. 4. Многоклеточный агрегат, полученный в результате кросс-сшивки модифицированных клеток ионами кальция. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Окраска: полимерная оболочка - люцифер желтый. Окраска ядер: DAPI
При добавлении хелатирующих агентов, таких как ЭДТА, к агрегатам модифицированных клеток, последние полностью диссоциировали; при этом сама процедура обратимой агрегации клеток не уменьшала их жизнеспособность. Предложенный подход представляет собой альтернативу методу микроинкапсуляции клеток и может быть использован в тканевой инженерии для создания трехмерных моделей клеток и технологии их доставки in vivo.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004; 36(IV): 568-84.
2. Woodley D.T., Remington J., Huang Y. et al. Intravenously injected human fibroblasts home to skin wounds, deliver type VII collagen, and promote wound healing. Mol. Ther. 2007; 15ПШ: 628-35.
3. Koizumi N., Inatomi T., Suzuki T. et al. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology 2001; 108: 1569-74.
4. Weidner N., Blesch A., Grill R.J. et al. Nerve growth factor — hypersecreting Schwann cell grafts augment and guide spinal cord axonal growth and remyelinate central nervous system axons in a phenotypically appropriate manner that correlates with expression of L1. J. Comparative Neurology 1999; 413: 495—506.
5. Silva G.V., Litovsky S., Assad J.A.R. et al. Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart function in a canine chronic ischemia model. Circulation 2005; 111: 150—6.
6. Kondo M., Wagers A.J., Manz M.G. et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu. Rev. Immunol. 2003; 21: 759—806.
7. Habib M., Shapira-Schweitzer K., Caspi O. et al. A combined cell therapy and in-situ tissue-engineering approach for myocardial repair. Biomaterials 2011; 32: 7514—23.
Благодарности
Работа софинансировалась в рамках выполнения ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.А18.21.1236) и ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (проект по созданию Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета).
8. Chan B.P., Hui T.Y., Yeung C.W. et al. Self-assembled collagen-human mesenchymal stem cell microspheres for regenerative medicine. Biomaterials 2007; 28: 4652—66.
9. Murua A., Portero A., Orive G. et al. Cell microencapsulation technology: towards clinical application. Control Release 2008; 132: 76—83.
10. Veerabadran N.G., Goli P.L., Stewart-Clark S.S. et al. Nanoencapsulation of stem cells within polyelectrolyte multilayer shells. Macromol. Biosci. 2007; 7: 877—82.
11. Borisenko G.G., Zaitseva M.A., Chuvilin A.N. et al. DNA modification of live cell surface. Nucleic. Acids. Res. 2009; 37QV): e28.
12. Baruch L., Machluf M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on longterm viability. Biopolymers 2006; 82tVI): 570—9.
13. Бондарь О.В., Сайфуллина Д.В., Мавлютова И.И. и др. Мониторинг дзета-потенциала клеток человека при снижении их жизнеспособности и взаимодействии с полимерами. Acta Naturae. 2012; 4ПСХШ): 99—102.
14. Сайфуллина Д.В., Шахмаева И.И., Бондарь О.В. и др. Применение электроаналитических методов для характеристики клеток человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7ПШШ: 86—91.
Поступила 24.09.2012
