CC BY
60
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 29 2012
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 29 2012
УДК 61:577.1
ПОЛУЧЕНИЕ БЕСКЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА СУХОЖИЛИЯ ТЕЛЕНКА С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ПРОТЕЗА ПЕРЕДНЕЙ КРЕСТООБРАЗНОЙ СВЯЗКИ
© Л. В. ЖИВАЕВА1, А. А. ВЕНЕДИКТОВ2, Д. В. НИКИШИН3, М. Т. ГЕНГИН1, С. В. ЕВДОКИМОВ4 пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского,
кафедра биохимии e-mail: lyubasha8891@mail.ru 2Общество с ограниченной ответственностью «Кардиоплант» e-mail: cardioplant.penza@yandex.ru 3Медицинский институт Пензенского государственного университета 4ЗАО НПП «МедИнж»
Живаева Л. В., Венедиктов А. А., Никишин Д. В., Генгин М. Т., Евдокимов С. В. - Получение бесклеточно-го материала сухожилия теленка для создания протеза передней крестообразной связки // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2012. № 29. С. 280-283. - В работе проведена серия экспериментов по получению бесклеточ-ного материала сухожилия теленка с целью создания из него биологического эндопротеза передней крестообразной связки. В ходе исследования разработана методика получения бесклеточного материала с сохранной коллагеновоэластической структурой ксеносухожилия, рассмотрена динамика состояния его клеточных элементов на каждой из стадий химико-ферментативной обработки.
Ключевые слова: протез, химико-ферментативный метод, клеточные элементы.
Jivaeva L. W., Venedictov A. A., Nikishin D. V., Gengin M. T., Evdokimov S. V. - Obtaining of acellular material tendons calf for the creation of a prosthesis of the anterior cruciate ligament // Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V. G. Belinskogo. 2012. № 29. P. 280-283. - In the work of a series of experiments on receipt of acellular material tendons calf with a view to the creation of his biological endoprosthesis front of a cross. In the course of the study developed a methodology for acellular material with good collagen-elastic structure ксеносухожилия, we consider the dynamics of the state of the cellular elements at each of the stages of the chemical-enzymatic processing.
Keywords: prosthesis, chemical-enzymatic method, cellular elements.
ВВЕДЕНИЕ
Передняя крестообразная связка (ПКС) является одной из самых травмируемых связок коленного сустава человека. Ежегодно на каждые 100 000 человек приходится около 30 случаев травмы передней крестообразной связки [10, 11, 14, 17]. Чаще травмированию подвергаются мужчины и женщины, занимающиеся такими видами спорта, как сноуборд, горные лыжи, американский футбол, баскетбол, гимнастика, хоккей и т.д. Имеются данные о том, что число повреждений ПКС у женщин выше, чем у мужчин, что связано с различной силой мышц бедра, различным углом квадрицепса и гормональным профилем [10, 17].
Лечение поврежденной ПКС заключается в ее пластической реконструкции. В настоящее время операции по восстановлению связки проводятся с использованием артроскопии - метода эндоскопического выполнения операций на суставах [4, 5, 12, 13].
В качестве протезов для ПКС используются самые различные материалы: аутотрансплантаты, аллотрансплантаты, синтетические материалы [1, 2, 8, 18, 19].
В качестве аутотрансплантатов выступают связки надколенника и подколенные сухожилия организма самого пациента. Такие трансплантаты обладают высокой биосовместимостью, неиммуногенностью, однако такие операции приводят к дополнительному травмированию пациента, увеличению срока реабилитации и восстановления пациента в послеоперационном периоде, а также увеличению времени самой операции [1, 2, 7].
Аллотрансплантатами являются связки, взятые от донора (трупные связки). В этом случае пациент не подвергается дополнительному травмированию, однако метод сопряжен с высоким риском заражения пациента вирусными заболеваниями (СПИД, гепатит), отторжением трансплантата и возникновением гнойных
инфекций, а также целым рядом проблем, касающихся этической стороны и оформления сопроводительных документов. [8, 9].
Что касается синтетических материалов (лавсан, полипропилен и др.), проявляющих высокие прочностные характеристики, то они обладают плохой биосовместимостью с организмом и в большинстве случаев отторгаются [16, 17, 18, 19].
Было выяснено, что ксенотрансплантаты (трансплантаты, взятые от животных) использовались в конце 20 в. для реконструкции ПКС, однако не имели успеха из-за несовершенной методики обработки материала животного: оставшиеся в материале клеточные элементы донора вызывали иммунный ответ, что приводило к отторжению протеза.
Исходя из вышеизложенного, появилась идея создания протеза передней крестообразной связки из ткани животного, прошедшей адекватную обработку и, как следствие, не вызывающую отторжение трансплантата.
Был проанализирован запатентованный метод химико-ферментативной обработки животных тканей (Патент на изобретение № 2197818). Суть метода состоит в том, что ферментом разрушаются клеточные элементы донора, как основные носители антигенно-сти, а в результате солевых вытяжек остатки клеток выводятся из материала. Однако напрямую использовать данный метод обработки ткани применительно к сухожилию не является возможным, т.к. сухожилие имеет плотную структуру волокон, что затрудняет прохождение фермента вглубь материала.
Целью настоящего исследования стала модификация химико-ферментативного метода для обработки сухожилия теленка, которое станет в дальнейшем основой для протеза ПКС.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Забор материала сухожилия производился в течение 20 минут после забоя животного. Материал помещался в физиологический раствор и транспортировался в течение не более двух часов в лабораторию для первичной очистки и дальнейшей обработки. Для того, чтобы получить бесклеточный материал сухожилия, его образцы подвергались химико-ферментативной обработке модифицированным методом при различных режимах: изменяли температуру при обработке, уровень рН, время обработки и концентрацию про-теолитического фермента. Ферментативная обработка проводилась в пяти группах, каждая из которых содержала пять образцов сухожилия. Все образцы обрабатывались гипертоническими растворами соли и протеолитическим ферментом по определенной схеме.
На последующем этапе работы проводилось гистологическое исследование полученных образцов на наличие клеточных элементов и состояние коллагеново-эластической структуры. Для этого производили поперечный срез края, второй трети и середины сухожилия. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. С каждого образца изготавливались три гистологических среза. При помощи микроскопа
Leica и цифровой фотонасадки Nikon разрешением 7 мегапикселей с каждого гистологического среза было получено по три репрезентативных фотографии, на которых подсчитывалось количество оставшихся после химико-ферментативной обработки клеточных элементов. В качестве контроля служила группа образцов сухожилия, не прошедших химико-ферментативную обработку.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
На микрофотографиях необработанного (нативного) материала отчетливо наблюдалось 107 клеточных элементов в одном поле зрения. Наибольшее их количество отмечалось в интиме сосудов сухожилия (рис. 1).
Рис. 1. Необработанное сухожилие.
Образцы первой группы обрабатывались низкой концентрацией фермента по сравнению с остальными образцами четырех групп. Гистологические срезы показали, что протеолитический фермент проходит лишь через периферийные и срединные слои сухожилия и разрушает клеточные элементы. В этих областях количество клеток в крае и второй трети материала сухожилия составило 4-5. Что же касается глубинных слоев, то здесь прохождение фермента изначально было затруднено, что, связано с плотной структурой ткани, количество клеточных элементов было больше, чем в срединных и периферийных слоях и составляло 87 клеточных элементов в одном поле зрения (Рис. 2). По сравнению с нативным материалом общее число клеток уменьшилось примерно на 16 %.
Во второй и третьей группе образцов, обработанных более высокой концентрацией фермента по сравнению с первой группой, наблюдалось более полное проникновение фермента вглубь материала, что вело за собой разрушение большего количества клеточных элементов. Оно составило 53 клетки в одном поле зрения. В периферийных слоях насчитывалось 2-3 клеточных элемента. Основная часть клеток наблюдалась в интиме сосудов. По сравнению с нативными образцами сухожилия их число снизилось на 50 %.
ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского • Естественные науки • № 29 2012 г.
Рис. 2. Сухожилие после обработки химико-ферментативным
меТ0д0м. М<здификация № 1. Рис. 4. Сухожилие после обработки химико-ферментативным
методом. Модификация № 4.
Рис. 3. Сухожилие после обработки химико-ферментативным методом. Модификация № 2, 3.
Образцы четвертой группы подвергались обработке при концентрации фермента, большей, чем в 3 группе, время обработки также было увеличено. На гистологических срезах выявлено, что клеточные элементы в крае и второй трети периферийных слоев сухожилия располагались преимущественно вокруг сосудов островками. В глубинных слоях материала обнаружено 2-3 клетки в одном поле зрения. Общее количество клеточных элементов по сравнению с нативным материалом уменьшилось на 97 %.
Пятую группу образцов обрабатывали по схеме, аналогичной в четвертой группе, однако образцы дополнительно подвергались гипотоническому шоку. Гистологические срезы пятой группы показали, что в крае и второй трети сухожилия в периферийных и срединных слоях клеточные элементы отсутствовали, в срезе центральной части сухожилия в глубинных слоях их количество составило 1-2 в одном поле зрения. Следует отметить, что количество клеток в интиме также уменьшилось по сравнению с предыдущими группами и составило не более 10 % по сравнению с таковыми в нативном материале, что считается допустимым для биопротезов [6]. Число клеточных элементов
Рис. 5 - Количество клеточных элементов после различных типов обработки ткани сухожилия.
в сравнении с необработанным материалом снизилось на 98 %.
Полученные результаты можно представить в виде гистограммы (Рис. 5)
Процесс химико-ферментативной обработки материала состоит из трех последовательных стадий: стадии предварительной обработки гипертоническими растворами солей, ферментативной обработки и повторной обработки гипертоническими растворами солей.
На следующем этапе исследования была проведена работа по изучению состояния клеточных элементов на каждой из стадий обработки сухожилия модифицированным химико-ферментативным методом.
Результаты гистологических исследований образцов, полученных на каждой из стадий обработки сухожилия, показали следующее. В нативном материале наблюдалось большое количество клеточных элементов - 107 в одном поле зрения. Было выявлено, что на стадии предварительной обработки гипертоническими растворами солей в материале сухожилия теленка по сравнению с нативным материалом количество клеточных элементов не изменилось, однако наблюдалось их частичное разрушение. После ферментативной обработки материала число клеток снижалось,
по всем полям зрения просматривались элементы разрушенных клеток. На гистологических срезах, полученных после повторной обработки сухожилия гипертоническими растворами солей, выявлено уже отсутствие элементов разрушенных клеток. Причем коллагеново-эластическая структура, составляющая основу сухожилия, сохранилась после всех обработок.
Таким образом, в ходе выполненной работы был получен бесклеточный материал сухожилия. По результатам гистологических исследований данный материал был признан годным для дальнейшей работы по созданию из него протеза передней крестообразной связки.
Дальнейшие работы будут направлены на придание полученному материалу большей прочности после его обработки различными сшивающими агентами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Афанасьев Д. С., Скороглядов А. В., Копенкин С. С., Бут-Гусаим А. Б., Зинченко А. В., Розаев В. Ю. Сравнительный анализ использования аутотрансплантата из связки надколенника и учетверенного сухожильного трансплантата m semitendinosus и m gracilis для пластики ПКС // VIII конгресс Российского артроскопи-ческого общества: программа и тезисы. СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье», 2009. 104 с.
2. Батпенов Н. Д., Баймагамбетов Ш. А., Раймагамбетов Е. К. Реконструкция передней крестообразной связки свободным аутосухожилием связки надколенника // VIII конгресс Российского артроскопического общества: программа и тезисы. СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье», 2009. 104 с.
3. Галапнонов В. Т. Иммунология // М: Изд-во МГУ, 1998. 480 с.
4. Головаха М., Орлянский В. Руководство по артроско-пии коленного сустава // Днепропетровск: Изд-во «Порош», 2008. 152 с.
5. Иванов Ю. Н., Мурга В. В., Рассказов Л. В., Румянцева Г. Н. Опыт артроскопического лечения заболеваний и травм коленного сустава у детей // VIII конгресс Российского артроскопического общества: программа и
тезисы. СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье», 2009. 104 с.
6. Константинов Б. А., Черепенин Л. П., Иванов А. С.. Хирургия тетрады Фалло // М.: ИПО «Полигран», 1995. 224 с.
7. Кузнецов И. А. Артроскопическая аутопластика передней крестообразной связки с использованием сухожилия полусухожильной мышцы // Сборник материалов зимнего Всероссийского симпозиума «Коленный и плечевой сустав - XXI век». Москва, 2000. С. 95-97.
8. Кузнецов И. А., Волоховский H. H., Рябинин М. В. Применение аллотрансплонтатов при артроскопиче-ской реконструкции ПКС коленного сустава // Сборник материалов 2 конгресса РАО 1997. С. 23.
9. Кузьмина Ю. О., Королев А. В., Дедов С. Ю. Анализ осложнений, возникающих после артроскопической пластики передней крестообразной связки аллотрансплантатом из связки надколенника // Скорая медицинская помощь. Специальный выпуск. С .-Пб., 2003. C. 44-45.
10. Ренстрём. Спортивные травмы. Клиническая практика предупреждения и лечения // Олимпийская литература. Киев, 2003. 472 с.
11. Тимченко Д. О. Отдаленные результаты оперативного лечения посттравматической нестабильности коленного сустава у спортсменов (ошибки, осложнения и их коррекция) // Автореферат дисс. ... канд. Мед. наук. Москва, 2007. 23 c.
12. Трачук А. П., Тихилов Р. М., Соленый Г. П. и др. Ар-троскопическая диагностика и лечение больных с острым гемартрозом коленного сустава // Сборник материалов Третьего Конгресса Российского Артро-скопического Общества. Москва, 2000. С. 45-55.
13. Чехович Г. Г. Диагностико-оперативная артроскопия при некоторых повреждениях и заболеваниях коленного сустава // Ортопедия, травматология и протезирование. М.: 1999. С.114-115.
14. Шапошников Ю. Г. Травматология и ортопедия // Руководство для врачей. М.: «Медицина», 1997. Т. 3. 627 с.
15. Bum C. Grundlagen des Kniebandersatzes durch Kohlenstoff // Unfallheilkunde. 1980. V. 83. P. 208-213.
