CC BY
50
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 29 2012
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 29 2012
УДК 591.557:599.322.2
ПОЛИМОРФИЗМ ПОПУЛЯЦИЙ КРАПЧАТОГО СУСЛИКА (SPERMOPHILUS SUSLIKUS GULD.) В ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ АРЕАЛА: ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНТИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
© С. С. БАКАЕВА, С. В. ТИТОВ Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского,
кафедра зоологии и экологии e-mail: bakaewa.ss@yandex.ru
Бакаева С. С., Титов С. В. - Полиморфизм популяций крапчатого суслика (Spermophilus suslicus Guld.) в восточной части ареала: предварительные молекулярно-генетические данные // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2012. № 29. С. 185-189. - При помощи молекулярно-генетических маркеров митохондриальной, ядерной и микросателлитной ДНК изучено генетическое разнообразие особей в 8 географически обособленных популяциях крапчатого суслика в восточной части ареала (Поволжье). Показано, что центральные из этих популяций характеризуются большим генетическим разнообразием и изменчивостью, а сама область их местоположения может быть признана центром морфо-генетического разнообразия этого вида в регионе. По результатам исследований предполагается, что наблюдаемая в настоящее время депрессия численности S. suslicus является следствием не только ухудшения биотопических условий, но и результатом естественной пульсации ареала.
Ключевые слова: полиморфизм популяций, молекулярно-генетический анализ, мито-хондриальная, ядерная и микросателлитная ДНК, крапчатый суслик, Поволжье.
Bakaeva S. S., Titov S. V. - Polymorphism of spotted ground squirrel (Spermophilus suslicus Guld.) in the east part of area: preliminary molecular genetic data // Izv Penz. gos. pedagog. univ. im.i V.G.Belinsky. 2012. №00. P. 185-189. - By means of molecular genetic markers of mitochondrional, nuclear and microsattelite DNA genetic variety of individuals in 8 geographically isolated populations of Spotted ground squirrel in the east part of area (Volga region) has been studied. It has been shown, that central populations are described by the great genetic variety and variability, and the place, where they are arranged, could be recognized as the center of morpho-genetic diversity of this species in that region. The results of the studies allow suggesting, that observed depression of S. suslicus quantity is caused by not only degradation of biotopic condition, but also by the natural area pulsation.
Keywords: polymorphism populations, molecular-genetic analysis; mitochondrial, nuclear and microsatellite DNA, spotted ground squirrel, Volga region.
Под популяционным полиморфизмом понимают разнообразие популяций по признакам или маркерам различной природы в пределах ареала. Один из видов популяционного полиморфизма является генетическое разнообразие особей, которое представляет собой важный компонент характеристики, как отдельной природной популяции, так и группы популяций или вида в целом [1]. Генетическое разнообразие особей имеет большое значение для экологической пластичности популяций и позволяет ей адаптироваться к изменяющимся во времени и пространстве условиям.
Начиная с 80-х годов прошлого века в восточной части ареала (Поволжье) отмечается устойчивое падение численности и уменьшение числа поселений крапчатого суслика [3]. По результатам исследований,
проведенных в 2008-2009 гг., было обнаружено только 28 поселений крапчатого суслика, по сравнению с 105, выявленных в 90-е годы. При этом плотность поселений нигде не превышала 5 ос/га, а на некоторых регионах (Татарстан, Пензенская и Тамбовская обл.) 5. suslicus не был обнаружен вовсе [4]. Наблюдающееся в последнее время сокращение числа популяций крапчатого суслика в Поволжье позволяет предположить, что одной из причин, приведшим к этому, было изменение генетического разнообразия.
Теоретическим основанием для проводимых исследований послужили два общеизвестных положения: во-первых, популяция устойчива, т.е. способна противостоять деструктивным процессам, при условии высокого генетического разнообразия и, во-
вторых, популяция стабильна, т.е. имеет постоянную численность, несмотря на действующие лимитирующие факторы, при условии эффективной численности.
Очевидно, что оба этих условия способствуют сохранению популяции в пространстве и времени. И если они не выполняются, то популяция входит в депрессивное состояние, вплоть до полного своего исчезновения.
Целью исследования было изучение уровня генетического полиморфизма особей в популяциях крапчатого суслика в восточной части ареала (Поволжье) с использованием различных по диагностическим возможностям молекулярно-генетических маркеров.
Исследованные
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для работы послужили полевые сборы, произведенные в период экспедиционных выездов 2006-2010 гг. в Ульяновской, Саратовской областях, Республиках Мордовия и Чувашия. В процессе работы была исследована генетическая структура 8 популяций крапчатого суслика. Обобщенная выборка составила 141 особь (табл. 1). В дальнейшем в молекулярно-генетическом анализе были использованы выборки только из 4 географически разобщенных популяций: Батыревской, Тимерсянской, Смышляев-ской и Николаевской.
Таблица 1
[и крапчатого суслика
Поселение N Адрес поселения
«Тимерсяны» 11 с.Нижние Тимерсяны, Цильнинский р-н, Ульяновская обл., 54°
«Смышляевка» 72 окр. с. Смышляевка, Кузоватовский р-н, Ульяновская обл., 53°
«Чириково» 1 окр-ти с. Чириково, Кузоватовский р-н, Ульяновская обл., 53°
«Заречное» 1 окр-ти с. Заречное, Кузоватовский р-н, Ульяновская обл., 53°
«Николаевка» 38 окр-ти пос. Николаевка, Николаевский р-н, Ульяновская обл., 53°
«Урено-Карлинское» 6 окр-ти с. Урено-Карлинское, Корсунский р-н, Ульяновская обл., 54°
«Бестужевка» 3 окр-ти с. Бестужевка, Кузоватовский р-н, Ульяновская обл., 53°
«Батырево» 9 окр-ти пос. Батырево, Батыревский р-н, Ульяновская обл., 55°
ВСЕГО: 141
Молекулярно-генетические исследования проведены на базе молекулярно-генетической лаборатории кафедры зоологии и экологии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского.
ДНК выделяли из образцов печени, когтевых фаланг пальцев, хранившихся в 96%-ном этаноле. Небольшие кусочки ткани (около 50 мг) измельчали скальпелем, растирали до гомогенного состояния в 1.5-мл пробирке, инкубировали в течение 0.5—1.0 ч в 0.5 мл буфера STE и после центрифугирования выделяли ДНК из клеточного осадка по стандартной методике, включающей обработку додецилсульфатом натрия (SDS) и протеиназой К при 50° C в течение 6-12 часов с последующей фенольной экстракцией [5].
Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ
Трис-HCl (pH 8.9), 20 мМ сульфата аммония, 20 мкМ ЭДТА, 170 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (200 мкМ каждого из них), 2 мМ хлористого магния,
0.6 мкМ каждого из праймеров, 0.1-0.2 мкг ДНК и 2 ед. акт. Taq-полимеразы. Реакцию проводили при условиях - 94° С - 1 мин, 60° С - 1 мин (отжиг), 72° С -1-3 мин (30 циклов).
В работе были использованы 4 молекулярногенетических маркера: контрольный регион мтДНК (С-регион, D-loop), наследующийся только по материнской линии, маркер ядерной ДНК - интрон 6 протоонкогена p53, ответственного за апоптоз, а также 2 фрагмента микросателлитной ДНК.
В анализе были использованы специфические для сусликов праймеры для амплификации фрагментов мт- и я-ДНК [2] (табл. 2).
Таблица 2
Праймеры, использованные в анализе митохондриальной и ядерной ДНК сусликов
Маркер Праймеры Т отж Последовательность 5-3' фрагмент, п.н.
мтДНК (С-регион) MDL 1 H00651 60 TCCACCTTCAACTCCCAAAGC TAACTGCAGAAGGCT AGGACCAAACCT ~1100
интрон 6 гена p53 Sp53 6D Sp536R 60 GACTGGAAGGGATTGTCATTG CACTGGCCT AACATATGTGAG до 200
зоология ►►►►>
Для изучения уровня гетерозиготности популяций проводили анализ микросателлитной ДНК по 2 системам: STRI 1, (ОЛЛЛ)п(ЛООО)т-повтор и ST 7 (ООТ)п(ОТ)т-повтор (табл. 3). Амплификацию участков микросателлитной ДНК проводили в такой же по составу реакционной смеси при режиме - 94° С - 30 с, 58-62° С - 30 с (отжиг), 72° С - 30 с (35 циклов).
Индивидуальность фрагментов ДНК особей, полученных в ходе PCR, определялись по различиям масс этих фрагментов или особенностями полипеп-
тидного спектра гидролизата после рестрикционного анализа (мт-ДНК). Эти различия устанавливались в ходе электрофоретического разделения в 6% полиакриламидном геле (в случае микросателлитного анализа - в 8% геле) с последующим окрашиванием гелей в растворе бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолетовом свете. PCR-фрагменты мт-ДНК гидролизовали эндонуклеазой Rsa 1 в течение 2-4 ч при 37 °С, добавляя фермент (2-4 ед. акт.) непосредственно к аликвотам амплификационных смесей (5-10 мкл).
Таблица 3
Праймеры, использованные для анализа микросателлитной ДНК (STR-повторы)
Система праймеров То отж Последовательность 5' - 3' Микросателлитный повтор Аллельное разнообразие
STRI 1 D STRI 1 R 62 GGAGGAGGCTCATGAGACAG CT AAAAATAAAGTCT ATT AAGGCTT (GAAA)n(AGGG)m 11
ST 7 D ST 7 R 58 CT AAAGTCAGAGACCTGTCT TGT AGATACCATCTCCTGAC (GGT)n(GT)m 29
По результатам молекулярно-генетического анализа для каждой особи был составлен генетический паспорт, информация с которого были использована в дальнейшей работе. Генетическая структура популяций описывалась по 4 статическим и динамическим показателям:
1) Доля аллелей в поселении. Оценивали в конкретный временной срез или суммарно по годам как показатель генетического разнообразия.
2) Уровень гетерозиготности. Учитывалась как для каждого генетического маркера и отдельно по годам, так и в совокупности для всего анализируемого генотипа (генофонда) и суммарно за весь период наблюдений над популяциями. Показатель вычисляли в ходе проведения простейших статистических процедур и при использовании программы Arlequin ver. 3.1 (1995-2006).
3) Соответствие наблюдаемого соотношения генотипов с теоретически ожидаемым (соотношение Харди-Вайндберга). Использовалось с целью выяснения общей популяционной ситуации в поселениях и выявления действия внутренних автономных генетических процессов или проявления деструктивных факторов. Вычислялся в ходе проведения простейших
статистических процедур (%2-тест) и при использовании программы Arlequin ver. 3.1.
4) Частота митотипов ДНК. Показатель позволил проследить материнские линии в популяции, выявить из них наиболее успешные и развивающиеся.
Достоверность различий параметрических показателей оценивалась по критерию Стьюдента при пороговом значении p<0.05, а непараметрических - с помощью ^2-теста. При обработке многомерных показателей был использован пакет программ Statistica for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ митохондриальной ДНК. Анализ митохондриальной ДНК у особей из 8 проанализированных популяций выявил мономорфность всех их по это молекулярно-генетическому маркеру. Был выявлен митотип D1, характерный для крапчатых сусликов в Поволжье [2].
Анализ ядерной ДНК. При анализе 6 интрона гена р53 было обнаружено 2 различные по массе аллели этого гена (рис. 1). Разница в весах аллельных фрагментов обуславливается различной длиной ID-повтора (поли Т-хвоста).
Рис. 1. Выявленные у крапчатого суслика 2 аллели Ы^2) гена р53 (А) и различия в длине Ю-повтора в аллелях (Б).
Анализ частот генотипов по двум аллелям р53 показал, что в 3 из 4 популяций отсутствуют гомозиготы по аллели 82. При сравнении популяций достоверные различия были выявлены по всем парам сравнения, кроме пары Тимерсяны-Батырево (рис. 2). Что, возможно, связано с равной частотой встречи в популяции гомозиготы 81/81, а также некоторой географической близостью этих популяций. При сравнении наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов р53 не было выявлено достоверных различий между ними ни в одной из популяций. Это указывает на прохождении в этих популяциях автономных генетических процессов в соответствии с законом Харди-Вайнберга.
Рис. 2. Наблюдаемые частоты генотипов гена р53 в популяциях крапчатого суслика Батырево, Тимерсяны, Николаевка, Смышляевка.
Таким образом, анализ генетической структуры популяций по ядерному гену р53 свидетельствует, что во всех проанализированных популяциях внутренние автономные генетические процессы идут в соответствии с теоретически ожидаемыми. Не смотря на это,
есть негативные факты, указывающие на нестабильность и дефективность генетической структуры популяций крапчатого суслика. Это, например, сильная генетическая однородность населения в пределах популяций и достоверно значимые различия географических популяций, свидетельствующие об их сильной изоляции.
Анализ микросателлитной ДНК. Анализ ми-кросателлитной ДНК (STR 1) показал, что в 4 популяциях были обнаружены 14 аллелей, отличающихся количеством повторяющихся микросателлитных последовательностей (GAAA или AGGG), а число зафиксированных в популяциях аллелей колеблется от 3 до 11. При этом есть специфические аллели, встречающиеся только в одной популяции, аллели, встречающиеся в двух популяциях и неспецифические, отмеченные во всех проанализированных популяциях.
Аналогичные результаты были получены при анализе локуса микросателлитного повтора ST 7. В 4 популяциях были обнаружены 8 аллелей. При этом, как и в случае с микросателлитным повтором STR 1, в проанализированных популяциях были выявлены специфические аллели, встречающиеся только в одной популяции, аллели, встречающиеся в двух популяциях и неспецифические, отмеченные во всех проанализированных популяциях.
При сравнении популяций по частотам генотипов, также как и в случае с р53, достоверные различия были выявлены по всем парам сравнения, кроме пары популяций Тимерсяны-Батырево. Это, возможно, связано с низким полиморфизмом популяций по этому маркеру, а также определенной географической близостью этих популяций.
Анализ внутренних автономных генетических процессов показал, что в южных популяциях крапчатого суслика налицо действие деструктивных процессов, проявляющееся в несоответствии наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов (рис. 3). В северных же популяциях такой ситуации не отмечено.
Рис. 3. Полиморфизм (А) микросателлитного локуса STR 1 и различия (Б) наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов в популяциях крапчатого суслика: 1 - Батырево, 2 - Тимерсяны, 3 - Смышляевка, 4 - Николаевка.
зоология ►►►►>
Таким образом, анализ генетической структуры популяций по микросателлитному маркеру ДНК 8ТИ 1 свидетельствует, что внутренние автономные генетические процессы идут в соответствии с теоретически ожидаемыми тенденциями только в северных популяциях. На первый взгляд это кажется не совсем понятным, поскольку, напротив, именно в южных популяциях наблюдалась наиболее высокая численность. Однако при изучении годовой динамики численности в этих поселениях, становится ясным, что даже такая высокая устойчивость популяции, связанная с генетическим разнообразием, не способна сохранить популяцию при падении численности ниже эффективного ее уровня. Как показывают исследования критическая плотность для крапчатого суслика в Поволжье составляет 0.15 ос/га [4]. Падение численности ниже этого уровня, как правило, ведет к исчезновению поселений.
Проведенные генетические исследования популяций крапчатого суслика показали, что центральные из них характеризуются большим генетическим разнообразием и изменчивостью, а сама область их местоположения может быть признана центром морфогенетического разнообразия этого вида. Такой статус популяций подтверждается проведенные исследования генетического разнообразия по результатам как анализа микросателлитной, так и ядерной ДНК. В целом, результаты генетических исследований свидетельствуют о депрессивном современном состоянии популяций крапчатого суслика в восточной части ареала. При этом полученные данные позволяют предположить, что наблюдаемая в настоящее время депрессия численности 5. зтИот является следствием не только ухудшения биотопических условий, но и результатом естественной пульсации ареала. Обнаруженная на территории Ульяновской обл. и юге Чувашии зона повышенной генетической гетероген-
ности популяций крапчатого суслика является областью переживания видом неблагоприятных условий. Данный вывод нашел замечательное подтверждение в наших недавно полученных данных (2010-2012 гг.). Исследования ареала крапчатого суслика показали, что именно в этом районе наблюдается постепенное повышение численности сусликов в существующих популяций, восстановление былых поселений и возникновение новых.
Благодарности. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 12-04-97062р_ поволжье_а) и в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (№ 14.B37.21.0189).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: Академкнига, 2003. 431 с.
2. Ермаков О. А., Сурин В. Л., Титов С. В., Тагиев А. Ф., Лукьяненко А. В., Формозов Н. А. Изучение гибридизации четырех видов сусликов (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) молекулярно-генетическими методами // Генетика. 2002. Т.38. №7. С. 950-964.
3. Титов С. В. Современное распространение и изменение численности крапчатого суслика в восточной части ареала // Зоол. журн. 2001. Т. 80. № 2. С. 230-235.
4. Титов С. В., Бакаева С. С. Современное состояние популяций крапчатого суслика (Spermophilus suslicus Güld., 1770) в восточной части ареала: популяционные и молекулярно-генетические данные // Современные проблемы зоо- и филогеографии млекопитающих. Мат. конфер. М.: ТНИ КМК, 2009. С. 99.
5. Arrigi F. E., Bergendahl G., Mandel M. Isolation and characterization of DNA from fixed cells and tissues // Exp. Cell. Res. 1968. Vol. 50. P. 47-53.
