Полиморфизм гена нейрональной NO-синтазы (276с/т и -186а/с) в структуре подверженности реализации «Атопического марша» у детей Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ГЕНЕТИКА

УДК 616-056.3-053.2:575.174.015.3:1577.15:546.172.6-31]

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА НЕЙРОНАЛЬНОЙ М-СИНТАЗЫ (276С/Т И -186А/С) В СТРУКТУРЕ ПОДВЕРЖЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ «АТОПИЧЕСКОГО МАРША» У ДЕТЕЙ

В регуляции продукции оксида азота важную роль играют N0-синтазы. Учитывая связь аллельного полиморфизма гена ^08 с кли-нико-функциональными характеристиками бронхиальной астмы (БА) и развитием атопии, можно предположить его участие в формировании атопического дерматита (АД) и реализации «атопического марша». Цель исследования - установить ассоциацию полиморфных вариантов гена нейрональной N0-синтазы с развитием атопического дерматита и реализацией «атопического марша» у детей. Установлено, что аллельные варианты 276С/Т и -186А/С гена нейрональной N0-синтазы принимают участие в развитии АД, однако не являются факторами риска формирования «атопического марша» у детей.

Ключевые слова: N0-синтаза, полимеразная цепная реакция, ген, полиморфизм, «атопический марш».

Широкая распространенность аллергических болезней является актуальной проблемой детского возраста, как в России, так и в других странах мира [1]. Основу развития аллергопатологии составляет «атопический марш», который представляет собой последовательную манифестацию аллергических симптомов и болезней у предрасположенных к атопии лиц [2].

Началом «атопического марша» часто является атопический дерматит (АД), поэтому дерматит рассматривается в качестве фактора высокого риска развития бронхиальной астмы (БА). Приблизительно у 50% детей, больных АД, в дальнейшем развиваются аллергические респираторные болезни: БА и аллергический ринит (АР).

Оксид азота (NO) и его метаболиты являются важными участниками аллергического воспаления, что отражается на изменении их концентрации в сыворотке крови и в выдыхаемом воздухе у больных АД и БА [3, 4]. NO участвует в процессах вазодилата-ции, адекватной воздухонаполняемости легких, влияет на пролиферацию кератиноци-тов, фибробластов, эпителия бронхов, эндотелиоцитов, является нейромедиатором периферических нервов.

В регуляции продукции оксида азота важную роль играют NO-синтазы. Особого внимания заслуживает нейрональная NO-синтаза (nNOS, NOS1). По мнению ряда исследователей, среди генов, кодирующих NO-синтазу, nNOS является наиболее вероятным кандидатом на участие в развитии БА [5, 6]. Ген нейрональной NO-синтазы расположен на 12 хромосоме в районе I2q24.2 - I2q24.3, имеет протяженность 150 кило-баз и содержит 29 экзонов и 28 интронов.

Изучение полиморфизма гена нейрональной NOS при различных болезнях проводилось учеными разных стран. Так, Grasemann Н. и коллеги идентифицировали 8 аллелей с разным числом ААТ повторов (от 9 до 16 повторов) в 20-м интроне гена

Л.М. ОГОРОДОВА И.В. ПЕТРОВА К.Ю. РУКИН

Сибирский государственный медицинский университет

e-mail: naukatomsk@yandex.ru

NOSi и установили, что высокое число ААТ повторов (более 12) связано с низким уровнем выдыхаемого NO. Исследование полиморфизма 5266 C/T гена nNOS у детей, проведенное китайскими учеными, не выявило ассоциации с БА, но большая часть пациентов с генотипом T/T имели повышенный уровень IgE в сыворотке крови. Для этого генотипа также обнаружена ассоциация с сенсибилизацией к Dermatophagoides pteronyssinus (P=0,049). У больных бронхиальной астмой достоверно чаще, чем у здоровых людей (р<0,05), встречается точечная мутация 276 С/Т в 29 экзоне.

Учитывая связь аллельного полиморфизма гена nNOS с клинико-функциональными характеристиками БА и развитием атопии, можно предположить его участие в формировании АД и реализации «атопического марша».

Цель исследования - установить ассоциацию полиморфных вариантов гена нейрональной NO-синтазы с развитием атопического дерматита и реализацией «ато-пического марша» у детей.

Материалы и методы. В исследование были включены больные БА (n=929) в возрасте от 7 до 17 лет и больные АД (n=847) в возрасте от 1 до 17 лет. Группа контроля включала 720 детей. Диагноз БА устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов; степень тяжести заболевания оценивали по критериям проекта GINA. Диагноз АД устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных исследований.

Критерии включения больных бронхиальной астмой:

• Амбулаторные и стационарные пациенты.

• IgE в сыворотке крови > 100 МЕ/мл.

• Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз бронхиальной астмы:

o легкая персистирующая: симптомы чаще 1 раза в неделю, но реже 1 раза в день, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы чаще 2 раз в месяц ОФВ1 или ПСВ не менее 80% от должных значений, вариабельность пиковой скорости выдоха (ПСВ) или объем форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) не более 30%

o персистирующая среднетяжелая: симптомы ежедневно, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы более 1 раза в неделю, ежедневный прием ингаляционных ß2-агонистов короткого действия, ОФВ1 или ПСВ 60-80% от должных значений, вариабельность ПСВ или ОФВ1 более 30%

o тяжелая персистирующая: симптомы ежедневно, частые обострения, частые ночные симптомы БА, ограничения физической активности, ОФВ1 или ПСВ не превышает 60% от должных значений, вариабельность ПСВ или ОФВ1 не менее 30%) (GINA 2006).

Критерии включения больных атопическим дерматитом:

• Амбулаторные и стационарные пациенты.

• IgE в сыворотке крови > 100 МЕ/мл.

• Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз атопического дерматита: легкий АД - индекс SCORAD - 0-20 баллов; средней степени тяжести АД - индекс SCORAD - 21-40 баллов; тяжелый АД - индекс SCORAD - 41 и более баллов) («Атопи-ческий дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2004 г)

Критерии включения в контрольную группу:

• Возраст от 5 до 17 лет.

• Отсутствие аллергических болезней на момент включения и в анамнезе.

• Отсутствие острых респираторных заболеваний в течение 4-х недель до включения в исследование.

• Отрицательные результаты кожных аллергопроб.

• IgE в сыворотке крови <100 МЕ/мл.

ДНК выделяли из цельной крови методом фенол-хлороформной экстракции по стандартной неэнзиматической методике [7, 8]. Генотипирование по полиморфным вариантам 276С/Т и -186А/С проводили в пробирках 0,5 мл типа «Эппендроф», на ам-плификаторе «Терцик» ( ДНК-Технология, Москва). Состав реакционной смеси (50 мкл): 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 16,7 мМ аммоний сульфата, 1,5 мМ хлорид магния, 0,2 мМ каждого dNTP; 0,1% твин-20; 2 ед. Taq полимеразы, 50 - 100 нг геномной ДНК человека. Использовали следующие праймеры:

(-i86A^C)sense 5'-cagggagagccaatcagt-3'; antisense 5'-atgatgtccagactccaggatct-3'; (276 С^Т) sense 5'-actccttgagttttcctgctg cgatg-3'; antisense

5'-ccatgttccagggtttcatgcacac-3';

и рестриктазы: AlwN I и Eco72l соответственно.

Статистический анализ: При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц использовался критерий х2 (р) для таблиц сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Анализ соответствия наблюдаемых частот генотипов равновесию Харди—Вайнберга определяли по критерию х2

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью критерия х2 (х2=Е(Н-О)2/О), где Н - наблюдаемое значение; О - ожидаемое значение; S - символ, обозначающий суммирование по всем сериям эксперимента.. Для сравнения частот аллелей и генотипов между исследованными группами использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы, равном i.

Для сравнения средних значений независимых распределений использовали однофакторный дисперсионный анализ. Расчеты проводили с помощью программ «STATISTICA6» и «Microsoft Excel». Результаты.

Полиморфизм 276С/Т является транзицией, расположенной в 29 экзоне гена nNOS. Распределение генотипов по полиморфному варианту 276С/Т в группе больных АД не соответствовало ожидаемому при РХВ (х2 =6,32 d.f. =1, p=0,0i).

Таблица 1

Частоты генотипов полиморфизма 276С/Т гена nNOS у больных атопическим дерматитом

Группы n Генотипы (наблюдаемые частоты генотипов) Х2* Р* Но Не D Х2** р**

С/С С/Т Т/Т

АД 847 91 (0.107) 441 (0.521) 315 (0.372) 7,34 0,006 0,52± 0,001 0,46± 0,006 0,12 6,32 0,01

Контроль 720 216 (0.300) 330 (0.458) 174 (0.242) 0,46 ± 0,001 0,5± 0,001 -0,08 2,28 0,13

Примечание: X2*, X2** - критерий для оценки различий между частотами генотипов и для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга соответственно. Р* , Р** - уровень значимости при оценке различий частот генотипов и РХВ соответственно. Но, Не- наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность сооветст-венно. D - относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой.

Случаи отклонения распределения от ожидаемого могут отражать специфику популяционно-генетических процессов, которые могут быть связаны как с характеристиками генетико-демографической структуры изученных этнических групп, так и с функциональной значимостью данных локусов - гены NOS, в частности ген NOSi, вовлечены в патогенез многих мультифакториальных заболеваний и полиморфизмы этих генов не могут являться селективно нейтральными вариантами.

Частота аллеля 276С у детей с АД составила около 37%, в то время как у здоровых детей - 53%. Однако, при сравнении частот аллелей точным тестом Фишера различия оказались статистически не достоверными.

У больных АД отмечена тенденция к повышению уровня наблюдаемой гетерозиготности по отношению к ожидаемой при равновесии Харди-Вайнберга (табл. 1). Достоверных различий между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью как внутри каждой группы, так и между больными АД и здоровыми детьми обнаружено не было (р<0,05).

Установлено достоверное различие между частотами генотипов полиморфизма 276С/Т при атопическом дерматите и в группе контроля (х2 =7,34 p=0,006) (табл. 1). Расчет относительного риска показал, что вероятность формирования АД у пациентов, имеющих генотип ТТ достоверно выше (р<0,001), чем при других генотипах полиморфизма 276С/Т гена NOSi (табл.2). Транзиция С ^ Т не приводит к замене аминокислоты в белковом продукте, однако, для данной мутации обнаружена также достоверная

ассоциация с развитием бронхиальной астмы [5]. Коллектив авторов, установивших эту связь, считает, что замена 276С^Т может быть сцеплена с соседней мутацией, которая приводит к изменению в последовательности белка или mRNA.

Таблица 2

Риск формирования атопического дерматита в зависимости от генотипа полиморфизма 276С/Т гена nNOS

Генотип Больные АД, % (n=847) Контроль, % (n=720) OR С195% Р

СС 10,74 30,0 0,41 0,29-0,45 <0,00

СТ 52,06 45,8 1,19 1,03-1,26 0,014

ТТ 37,1 24,2 1,55 1,32-1,80 <0,00

Примечание: ОЯ - отношение шансов; С195% -доверительный интервал; р — достигнутый уровень значимости.

Учитывая высокий риск развития АД при наличии генотипа ТТ (276С/Т), мы проанализировали влияние этого и других генотипов данного полиморфизма на первую манифестацию и характер течения АД, определяемый тяжестью заболевания (табл. 3).

Таблица 3

Распределение генотипов полиморфизма 276С/Т гена nNOS у больных атопическим дерматитом разной степени тяжести

Генотип Легкий и среднетяжелый АД, n=686 Тяжелый АД, n=161 OR С1 95% Р

СС 91 21 0,88 0,63-1,53 0,79 (СТ)

СТ 350 84 1,13 0,87-1,21 0,82 (ТТ)

ТТ 245 56 0,78 0,77-1,23 0,94 (СС)

Примечание: ОЯ - относительный риск; С195% -доверительный интервал; р — достигнутый уровень значимости.

Первые клинические проявления дерматита у большинства детей отмечены в возрасте до 1 года, у единичных больных после 5 лет. Поиск ассоциации исследуемых генотипов полиморфизма 276С/Т гена пКОБ с возрастом дебюта и тяжестью АД не дал достоверных результатов.

Не установлено также различий в структуре сенсибилизации и по уровню общего в крови у пациентов-носителей разных генотипов. Не смотря на это, расчет относительного риска показал, что вероятность формирования АД у пациентов с генотипом ТТ полиморфизма 276С/Т гена пКОБ достоверно выше, чем у детей с другими генотипами (табл. 2). Учитывая, что атопический дерматит является первым проявлением «атопического марша», мы проанализировали наличие связи между бронхообст-руктивным синдромом в анамнезе пациентов и аллельными вариантами 276С/Т гена пКОБ, но частота бронхиальной обструкции не зависела от генетического полиморфизма.

Однонуклеотидная замена в положении 276А/С является трансверсией, расположенной в промоторе гена пКОБ. Мутационные изменения в регуляторной области, как правило, не приводят к дисфункции белкового продукта, но изменяют силу связывания факторов, инициирующих транскрипцию с нуклеотидной последовательностью, как в сторону усиления, так и в сторону ослабления, что, в свою очередь, приводит к понижению или повышению эффективности транскрипции, а, следовательно, и уровня мРНК гена. Наличие гомозиготы по аллелю С в положении -186, вероятно, вызывает нарушение экспрессии гена нейрональной КО-синтазы и, соответственно, нарушение образования КО в кератиноцитах, что приводит к дисбалансу пролифера-

ция/дифференцировка и влечет за собой изменение барьерной функции кожи, способствуя эпикутанной сенсибилизации.

Установлено, что распределение генотипов по полиморфизму -186А/ С гена пКОБ в группе больных АД соответствует ожидаемому при РХВ (х2 =1,22 =1, р=0,27). В то же время, распределение генотипов по данному полиморфизму в контрольной группе не соответствовало ожидаемому при РХВ (х2 =80,19 &£=1, р=0,001) (табл. 4).

Таблица 4

Частоты генотипов полиморфизма -186 А/С гена N081 у больных атопическим дерматитом

Груп пы п Генотипы (наблюдаемые частоты генотипов) Х2* Р* Но Не Б Х2** Р**

А/А А/С С/С

АД 847 399 (0.471) 350 (0.413) 98 (0.116) 13.35 0,001 0,41± 0,001 0,44± 0,008 -0,05 1,22 0,27

Контроль 720 618 (0.858) 48 (0.067) 54 (0.075) 0,33± 0,06 0,38± 0,02 -0,14 80.19 0,001

Примечание: Х2*, Х2** - критерий для оценки различий между частотами генотипов и для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга соответственно. Р* , Р** - уровень значимости при оценке различий частот генотипов и РХВ соответственно. Но, Не- наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность сооветст-венно. Б - относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой.

Установлено достоверное различие между частотами генотипов в группе больных АД и в группе контроля (Х2=13,35, р=0,001) (табл. 4). В природных популяциях давлению отбора подвергаются отдельные генотипы, и приспособленность популяции в целом определяется личным вкладом каждого из них. Если рассматривать заболевание как фактор отбора, влияющий на приспособленность отдельного носителя определенного генотипа, то обнаружение различий в частотах генотипов в группах здоровых и больных представляет большой интерес.

Таблица 5

Риск формирования атопического дерматита в зависимости от генотипа полиморфизма -186А/С гена nN0S

Генотип Больные АД п=847 Контроль п=720 ЯЯ С195% - 95% Р

АА 47,1 % 85,83 % 0,55 0,51-0,59 <0,00

АС 41,3 % 6,66 % 1,20 4,66-8,24 <0,001

СС 11,6 % 7,5 % 1,54 1,12-2,12 <0,007

Примечание: ЯЯ — относительный риск; С195% - 95% -доверительный интервал; р - достигнутый уровень значимости.

Расчет относительного риска показал, что формирование АД связано с аллелем С -186А/С. Так, у детей с генотипом СС риск развития АД оказался более чем в 2 раза выше, чем у детей с генотипом АА (табл. 5). Вероятно, это связано с тем, что у носителей генотипа СС подверженность к формированию сенсибилизации эпидермальными аллергенами достоверно выше, чем у пациентов-носителей других генотипов этого полиморфизма (ЯЯ=1,54; С195%: 1,12-2,12; р<0,007).

При сравнении распределения генотипов полиморфизма -186А/С гена пКОБ у больных АД, разделенных на подгруппы в зависимости от тяжести заболевания, между ними не было обнаружено достоверных различий (табл. 6).

Таблица 6

Распределение генотипов полиморфизма -186А/С гена nN0S у больных атопическим дерматитом разной степени тяжести

Генотип Легкий и среднетяжелый АД, п=686 Тяжелый АД, п=161 ЯЯ С195% Р

АА 343 91 0,68 0,97-1,32 0,57 (АС)

АС 252 63 1,07 0,86-1,32 0,001 (СС)

СС 91 7 0,33 0,15-0,69 0,14 (АА)

Примечание: ОЯ - отношение шансов, С195% - 95% - доверительный интервал, р - достигнутый уровень значимости.

В результате предыдущих исследований установлено, что точечная мутация -186А/С в промоторной области гена nNOS также ассоциирована с развитием БА [9, 10], однако, она лишь опосредованно влияет на вариабельность ОФВ1 и ПСВ. Таким образом, можно сделать вывод, что наличие обструктивных нарушений у больных БА зависит от других генетических и внешнесредовых факторов, а наличие генотипа СС полиморфизма -186А/С гена nNOS в большей мере связано с формированием атопии, чем с развитием обструкции дыхательных путей. Поэтому данный генотип нельзя считать фактором риска для формирования «атопического марша» у детей.

Таким образом, в результате нашего исследования установлено, что аллельные варианты 276С/Т и -186А/С гена нейрональной NO-синтазы принимают участие в развитии АД. Предыдущие исследования показали связь этих аллелей с клинической картиной и патогенезом БА, тем не менее, изученные аллельные варианты гена ней-рональной NO-синтазы не являются факторами риска формирования «атопического марша» у детей.

С другой стороны, ни один ген не функционирует изолированно, каждый тесно взаимодействует напрямую, или посредством своего белкового продукта со многими другими генами и белками, и доля каждого гена в формирование признака неравнозначна. Для успешного определения молекуляных изменений, лежащих в основе аллергических болезней, и развития представлений о механизмах формирования «атопиче-ского марша» важен комплексный подход в оценке роли генетических факторов риска. С этой точки зрения, перспективным является исследование группы генов, объединенных общим патогенетическим механизмом. Поэтому, в дальнейшем планируется изучение сочетаний генотипов полиморфных вариантов генов NO-синтаз, которые принимают участие в формировании как общих, так и специфических механизмов БА и АД.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ ГК №02.120.11.3520-МК от 24.09.09.

Литература

1. Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика: научно-практическая программа Союза педиатров России. М., 2000.

2. Генпе, А.«Аллергия у детей»/А. Генпе, В.А. Ревякина// СПб., ЭЛБИ. 2002.

3. Козырицкая, Д.В. Биологические маркеры атопического воспаления при аллергических заболнваниях как предикторы развития бронхиальной астмы в будущем / Д.В. Козырицкая, Л.М. Огородова, И.А. Деев И.А, А.В. Екимовских // Педиатрия. - 2007. - № 4. - С. 9-13.

4. Петровский, Ф.И. Роль эндогенного оксида азота в регуляции атопического воспаления при бронхиальной астме у детей / Ф.И. Петровский, Л.М. Огородова, В.Ю. Серебров, Е.М. Камалтынова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - С. 57-60.

5. Neuronal NO synthase (NOSI) is a major candidate gene for asthma / H. Grasermann, C.N. Yandava, J.M. Drazen // Clinical and Experimental Allergy. - 1999. - № 4. - P. 39-41.

6. NOS1 Gene Polymorphism Associated with Asthma and Specific Immunoglobulin E Response to Mite Allergens in a Colombian Population / B. Martínez, K. Barrios, C. Vergara [et al.] // Int Arch Allergy Immunol. - 2007. - Vol.144. - P. 105-113.

7. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование./Т. Маниатис,Э. Фрич, Дж. Сэмбрук// М., Мир. 1984.

8. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality / K. Debomoy, N. Lahiri // Bill Schnabel Biochemical Genetics. - Vol.7. - P. 321-328.

9. Огородова, Л.М. Роль полиморфизма генов NO-синтаз в развитии БА у детей / Л.М. Огородова, И.В. Петрова, И.И. Иванчук, И.А. Деев, М.Б. Фрейдин // Педиатрия. - 2007. -№ 4. - С. 14-18.

10. Огородова, Л.М. Ассоциация полиморфизма промоторной области генов NO- синтаз с развитием БА у детей / Л.М. Огородова, И.В. Петрова // Пульмонология. - 2007. - № 4. -С. 52-55.

POLYMORPHISM OF THE NEURONAL NO-SYNTHASE (276S/T AND-186A/C) IN THE STRUCTURE OF THE EXPOSURE TO IMPLEMENTATION OF THE "ATOPIC MARCH" IN CHILDREN

L.M. OGORODOVA I.V. PETROVA K.Y. RUKIN

Siberian State Medical University

e-mail:

naukatomsk@yandex.ru

In the regulation of nitric oxide production an important role belongs to NO-synthase. After estimation of the relationship of allelic polymorphism of nNOS with clinical and functional characteristics of asthma and atopy development, we can assume, that it is a part in the formation of AD and implementation of the "atopic march". The purpose of the study - to establish an association of polymorphic variants of the gene of the neuronal NO-synthase with the development of atopic dermatitis and implementation of "atopic march" in children. It is established that the allelic variants 276C/T and -186A/C gene neuronal NO-synthase involved in the development of AD, but are not risk factors for formation of the "atopic march" in children.

Key words: NO-synthase, PCR, gene, polymorphism, "atopic march".