CC BY
85
© Москвичева Я.Б., Петровский С.В., Г инак А.И., 2014
®
УДК 547.144.615.281 ББК 24.7
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Москвичева Яна Борисовна
Аспирант кафедры молекулярной биотехнологии
Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) moskvichev.36@mail.ru
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Петровский Станислав Викторович
Аспирант кафедры молекулярной биотехнологии
Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) s.v.petrovsky@spbniivs.ru
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Гинак Анатолий Иосифович
Доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) mbt@lti-gti.ru
Московский проспект, 26, 190013 г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Аннотация. Изучали взаимодействие окисленных циклических декстранов-цик-лодекстрина (далее - ЦД) с белком - бактериальной стрептокиназой. При максимальном молярном трехсоткратном избытке ЦД молекулярная масса коньюгата стрепто-киназы с циклодекстрином достигает 65 кД, причем с одной макромолекулярной стреп-токиназы связывается 14 остатков ЦД.
Включение аденозина в конъюгат стрептокиназы с ЦД приводит к образованию тройного комплекса, где один остаток циклодекстрина поглощает одну молекулу аденозина.
Ключевые слова: циклодекстрин, стрептокиназа, аденозин, химическая модификация, гель-хроматография, окисление олигосахаридов, комплексы.
Известно, что стрептокиназа [К.Ф.3.4.99.22] - бактериальный белок, обладающий тромболитической активностью [6].
Ранее подробно описан процесс химической модификации стрептокиназы окисленным декстраном [2].
В некоторых случаях тромболитической терапии целесообразно сочетать такой курс
лечения с применением вазодилятаторов. Так, аденозин оказывает отчетливое сосудорасширяющее действие. Аденозин участвует в обменных процессах, усиливает ресинтез АТФ в миокарде при ишемии, оказывает коронаро-расширяющее действие, что позволяет рекомендовать аденозин в качестве гипотензивного антиаритмического средства [5].
Представляло интерес осуществить такую модификацию стрептокиназы, которая бы позволила сочетать в препарате тромболити-ческую активность и гипотензивное действие.
В качестве модифицирующего агента мы выбрали окисленный олигосахарид. Взаимодействие белков с окисленными декстранами -хорошо изученный процесс [3]. Здесь мы выбрали в качестве олигосахарида у-циклодекст-рин, являющийся циклическим олигосахаридом с молекулярной массой равной 1298 Да. Циклодекстрины способны включать в свою внутреннюю полость малые молекулы.
Нами использован метод иммобилизации при включении в у-циклодекстрин аденозина (Ад). Предварительно у-циклодекстрин (у-ЦД) окисляли периодатом калия и затем химически связывали с белком стрептокиназой (СК) в условиях, аналогичных тем, в которых была изучена химическая модификация стрептоки-назы окисленным декстраном [1].
В водном растворе СК представляет глобулу с радиусом Стокса равным 31,1 Ао. Концентрацию белка СК в растворе определяли по оптической плотности в ультрафиолетовой области спектра, используя приведенные значения удельного коэффициента поглощения
е Т"™ =8,8 и е 0'277 = 0,98 [4]. Спектральные
. А280
характеристики растворов исследовали с помощью спектрофотометра НйасЫ и-2900 производства Японии.
В качестве олигомера-модификатора использовали у-ЦД фирмы «РЬатаІес. Jnc.»
Количество ковалентных связей в конъюгатах, образованных между стрептокиназой и окисленным у-циклодекстрином, определяли по убыли свободных аминогрупп в конъюгатах по сравнению с нативным белком.
у-циклодекстрин окисляли периодатом калия. Реакцию проводили в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Количество пери-одата калия, необходимое для окисления ЦД, рассчитывали по уравнению реакции: у-ЦД + Ю4 ® у-ЦД (окисленный) +
+ ГО3 - НСОО - Н2О
3 + 2
Активация ЦД заключалась в окислении его глюкопиранозных звеньев с образованием свободных альдегидных групп с помощью
калия йоднокислого мета. Перед проведением реакции химического связывания активированного ЦД со СК проводили его очистку от избытка ионов окислителя JО- и образовавшихся ионов JО3.
Для этой цели использовали слабоосновный анионит типа АРА. Анионит предварительно переводили в ацетатную форму с помощью
0,5 М раствора уксусной кислоты.
Определение содержания альдегидных групп в окисленном ЦД, а также в восстановленных препаратах основано на реакции этих групп с солянокислым гидроксиламином. При этом взаимодействии выделяется соляная кислота, которую оттитровывают стандартным раствором №ОН и по количеству щелочи, пошедшей на титрование, рассчитывают содержание альдегидных групп [1].
Контроль за степенью модификации СК осуществляли с помощью метода гель-хроматографии. Хроматографию проводили на стеклянной колонке объемом 100 мл, заполненной гелем Сефадекс G-200 в качестве неподвижной фазы.
В качестве элюента на колонку подавался физиологический раствор со скоростью 5 мл/час. Под действием потока подвижной фазы вещества, нанесенные на колонку, перемещаются вдоль нее с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициенту распределения (Кау) хроматографируемых веществ, причем чем меньше размер молекулы, тем больше К
Для калибровки колонки использовали набор фирмы Serva со стандартизованными белками известной молекулярной массы (Мм).
Коэффициент распределения определяли по формуле:
Каю V - V ,
У т У 0
где V - максимальный объем удерживания, соответствующий веществу полностью включенному в гранулы геля (фенилаланин, Vm=100 мл); V1 - объем удерживания исследуемого вещества; V0 - свободный объем данной колонки, определяемый веществом, полностью исключенным из гранул геля (голубой декстран, V0 =40 мл);
В таблице 1 приведены результаты калибровки колонки с Сефадексом G-200. На
рисунке 1 приведена зависимость Кау от величины ^ (Мм).
За степень окисления у-ЦД принимали величину, численно равную количеству пар альдегидных групп, приходящихся на 100 элементарных звеньев а^-глюкозы.
Определение количества свободных аминогрупп и степени модификации белка (а) проводили спектрофотометрически с помощью 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (ТНБС). Калибровочную прямую строили по растворам глицина. Степень модификации рассчитывали на основе 3-5 измерений оптической плотности растворов с различными концентрациями белка. Результаты измерений а рассчитывали как долю аминогрупп, вступивших в реакцию образования ковалентных
связей с олигомерной матрицей от общего числа свободных аминогрупп исходной СК.
При определении концентрации вещества в растворе спектрофотометрическими методами погрешность определения составляла < 5 %.
Содержание альдегидных групп по результатам иодометрического титрования определяется с погрешностью 10 %. Погрешность определения степени модификации СК с помощью ТНБС составляет 3-5 %.
Погрешность определения молекулярных масс по данным гель-хроматографии составила 15 %.
Модификацию стрептокиназы окисленным очищенным ЦД проводили в 0,5 М содовом буферном растворе при рН 9,5 в течение
Таблица 1
Объемы удерживания и коэффициенты распределения веществ с известной молекулярной массой на колонке с Сефадексом G-200 в 0,9 % ^О,
объем геля V = 100 мл
№ Наименование Молекулярная масса (Мм), Да Объем удерживания, мл ^ (Мм)
1 Г олубой декстран 2 000 000 40 - -
2 Бычий сывороточный альбумин 66 000 65 0,42 4,8
3 С тр ептокиназа 47 300 69 0,49 4,7
4 Химо трипс иноге н 25 000 77 0,62 4,4
5 Цитохром С 12 400 84 0,73 4,1
6 Фенилаланин 165 100 - -
0,2 I 1 ! —|—Н— ! ! 1— ! ! I 1 — ! I 1 ——1—! I 1 ! —Ч
3,8 4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 5,2 ^(Мм)
Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения белков (К ) с известной молекулярной массой
от величины ^ (Мм)
1 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании. В результате взаимодействия е-аминогрупп лизиновых остатков белка с альдегидными группами окисленного у-ЦД образуется высокомолекулярный продукт СК-ЦД, содержащий неустойчивые двойные С=^связи (основание Шиффа).
Для восстановление двойных связей С=N вносили в реакционную смесь двукратный молярный избыток боргидрида № или К. При этом происходит стабилизация двойных связей с превращением их в одинарные, а непрореагировавших (избыточных) альдегидных групп декстрана в спиртовые.
Очистку, деминерализацию и концентрирование модифицированного раствора СК проводили на ультрафильтрационной установке Vivaflow 200, используя мембранный модуль 5 кДа HYS.
Деминерализацию проводили 4 раза десятикратным объемом очищенной воды. Контроль за степенью очистки вели спектрофотометрически по оптической плотности ^235) при длине волны 1 = 235 нм, добиваясь ее значения ниже 0,25 в кювете 1 см.
Для исследования связывания СК с окисленным г-циклодекстрином использовали препарат у-ЦД со степенью окисления 10,1 %. В таблице 2 приведены исходные соотношения СК и окисленного у-ЦД в реакционной среде и характеристика полученного продук-
та модифицированной СК. В последнем столбце приведены рассчитанные молекулярные массы модифицированной СК. При максимальном молярном трехсоткратном избытке у-ЦД в реакционной среде молекулярная масса конъюгата достигает 65 кД, причем на одну макромолекулу СК оказывается присоединенным до 14 остатков у-ЦД. Объемы удерживания полученных продуктов систематически снижаются при увеличении степени модификации СК, но это снижение не очень сильно выражено.
Получение тройного комплекса СК-ЦД-Ад проводили с модифицированной СК, полученной при десятикратном массовом избытке у-ЦД (см. табл. 2, строка 1).
Полученную на первом этапе модифицированную СК-ЦД после очистки высушивали лиофильно. Включение Ад в полученный препарат модифицированной СК проводили, растворяя 100 мг препарата СК-ЦД в 10 мл 0,01 М №2С03 при рН = 11,05. Затем в полученный раствор внесли 0,2 ммоль (54,3 мг) аденозина. Смесь выдерживали 1 час при температуре 20 ± 2 оС и хроматографировали на колонке с сефадексом G-10. 100 мг препарата СК-ЦД соответствует 1,53 • 10-3 ммоль модифицированной СК, причем ЦД в этом препарате содержится 0,02 ммоль. Таким образом избыток Ад по отношению к количеству ЦД в растворе составляет 0,2 ммоль
Таблица 2
Условия химической модификации стрептокиназы окисленным
у-циклодекстрином
№ п/п Исходное соотношение СК и у-ЦД в реакционной среде СК : ЦД Объем удержания (Гмл), мл Соотношения в конечном продукте СК : ЦД, моль/моль Степень модифи- кации (а), % КаV Рассчитанная молекулярная масса
Мм (Мм)
мг/мг моль/моль
1 1 10 1 364 66 1 14 44 0,43 65 472 4,82
2 1 5 1 182 66 1 14 44 0,43 65 472 4,82
3 1 1 1 36 68 1 8 25 0,45 57 684 4,76
4 1 0,5 1 18 68 1 6 19 0,49 55 088 4,74
5 1 0 1 0 69 1 0 0 0,49 47 300 4,70
Примечание. СК - стрептокиназа; у-ЦД - циклодекстрин; V - объем удерживания модифицированной СК.
Ад на 0,02 ммоль ЦД, входящего в структуру СК-ЦД.
Колонка с Сефадексом G-10 диаметром 1,3 см и высотой 15 см содержала 64 мл набухшего геля G-10. Скорость элюции составляла 26,5 мл/час ■ см2. Объем удерживания голубого декстрана составлял 27 мл, тирозина - 60 мл. На колонку с Сефадексом G-10 нанесли 10 мл приготовленного ранее раствора СК-ЦД-Ад в содовом буфере. Собрали высокомолекулярную фракцию, соответствующую объему удерживания голубого декстра-на, в объеме 30 мл.
Если предположить, что потери модифицированной СК при хроматографии на колонке с Сефадексом G-10 отстутствовали, то ее концентрация составила в собранной фракции
0,51 ■ 10-4 ммоль/мл.
Спектр поглощения СК в указанной концентрации показан на рисунке 2 (1). Спектр у-ЦД приведен на рисунке 2 (2). На рисунке 2 (3) приведен спектр Ад. Видно, что в зоне максимума поглощения Ад при длине волны 1=259 нм СК и полиглюкин практически не вносят заметный вклад в оптическую плотность.
Таким образом, замерив оптическую плотность раствора модифицированной СК и Ад можно при длине волны 1=259 нм определить концентрацию Ад в растворе высокомолекулярной фракции, то есть рассчитать количественно Ад, включенного в модифицированную СК. Предварительно определив оптическую плотность контрольного раствора Ад, расчетным путем нашли, что соотношение Ад и СК-ЦД в полученном растворе соответствует одному молю Ад, включенному в один моль ЦД (см. табл. 3).
(1)
(2)
(3)
Рис. 2. Спектральные характеристики модифицированной стрептокиназы (1), у-ЦД (2) и аденозина (3)
Таблица 3
Характеристика модельной смеси модифицированной СК в присутствии Ад в соотношении СК-ЦД 0,003 ммоль/л : Ад 0,044 ммоль/л (1:14)
Название вещества Концентрация вещества С, моль/л Оптическая плотность D * Оптическая плотность D **
Стрептокиназа 0,003 0,050 0,050
Аденозин 0,044 0,695 0,695
Стрептокиназа + аденозин 0,003 : 0,044 0,735 0,685
у-ЦД 0,044 *** 0 0
Примечание. D* - оптическая плотность при 1 =259 нм; D** - оптическая плотность с учетом плотности стрептокиназы при 1 =259 нм; *** - концентрация у-ЦД (рассчитано из молекулярной массы 1 звена).
В заключение можно отметить, что циклодекстрин, связанный с белком стрептоки-назой в результате взаимодействия окисленных глюкопиранозных звеньев с аминогруппами белка, сохраняет способность поглощать малые молекулы в свою внутреннюю полость.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. А. с. 1371004 СССР. Способ получения иммобилизованной стрептокиназы / Москвичев Б. В., Таратина Т. М., Иванова Г. П. [и др.] (СССР).
2. Москвичев, Б. В. Иммобилизованные ферменты в медицине и медицинской промышленности / Б. В. Москвичев, М. С. Поляк. - М. : Медбиоэ-кономика, 1983. - С. 51-71.
3. Пат. 1622986 Российская Федерация, Способ получения препарата Терридеказа, обладающего протеолитической активностью для парентерального введения / Москвичев Б. В., Иванова Г. П., Таратина Т. М., Безъязычная Т. С., Гринберг Г.Е. ; заявитель и патентообладатель ВНИТИ Антибиотиков и ферментов медицинского назначения. -Приоритет - прекратил действие 24.12.1994 ; опубл. 1997, Бюл. №> 11.
4. Conformational properties of streptokinase-differential scanning calorimetric investigations / K. Welfle et al. // International Journal Biological - Macromolecules 14. - 1992. - P. 19-22.
5. Munoz, A. Arch. Intern. Physiol. Cardiovascular Pharmacotherapy International Symposium / A. Munoz et al. // Int. Symp. - 1985. - J№ 45 - Р. 37-39.
6. Yoshinori, M. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods / M. Yoshinori, H. K. Wong, B. Jiang // Food Research International. - 2005. -Vol. 38. - Iss. 3. - P 243-250.
REFERENCES
1. Moskvichev B.V, Taratina T.M., Ivanova G.P., etc. (USSR). Sposob polucheniya immobilizovannoy streptokinazy [The Way of Manufacturing the Immobilized Streptokinase]. A. s. 1371004 USSR.
2. Moskvichev B.V., Polyak M.S. Immobilizovannye fermenty v meditsine i meditsinskoy promyshlennosti [The Immobilized Enzymes in Medicine and Medical Industry]. Moscow, Medbioekonomika Pabl., 1983, pp. 51-71.
3. Moskvichev B.V, Ivanov G.P., Taratina T.M., etc. Sposob polucheniya preparata Terridekaza, obladayushchego proteolicheskoy aktivnostyu dlya parenteralnogo vvedeniya [The Way of Receiving the Terridekaz Substance Possessing the Proteolytic Activity for Parenteral Introduction]. Pat. RF 1622986. 1997, byul. no. 11.
4. Welfle K., e. a. Conformational properties of streptokinase-differential scanning calorimetric investigations. International Journal Biological -Macromolecules 14, 1992, pp. 19-22.
5. Munoz A., e. a. Arch. Intern. Physiol. Cardiovascular Pharmacotherapy International Symposium. Int. Symp., 1985, no. 45, pp 37-39.
6. Yoshinori M. Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods. Food Research International, 2005, vol. 38, iss. 3, pp. 243-250.
MULTIFUNCTIONAL MODIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
Moskvicheva Yana Borisovna
Postgraduate Student, Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) moskvichev.36@mail.ru
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Petrovskiy Stanislav Viktorovich
Postgraduate Student, Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) s.v.petrovsky@spbniivs.ru
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Ginak Anatoliy Iosifovich
Doctor of Chemical Sciences, Professor,
Head of the Department of Molecular Biotechnology,
Saint Petersburg State Technological Institute (Technical University) mbt@lti-gti.ru
Moskovskiy Prospect, 26, 190013 Saint Petersburg, Russian Federation
Abstract. The article studies the interracting of oxidized cyclic cyclodextrin dextrans (CD) with the protein - bacterial streptokinase. The oxidation was carried out with potassium periodate; free aldehyde groups were formed in CD molecule during this process. Excess of potassium periodate was removed on a column using ion - exchange resin (anionite APA with acetate ion). Reaction between streptokinase and oxidized cyclic dextran was monitored by gel-permation chromatography (sephadex G-200). The mass of complex of streptokinase with exciding cyclodextrin goes up to 65 kDa (the ratio by moles is 1-3). One streptokinase macromolecule is bound to 14 molecules of CD. It was shown that the chemical reaction between streptokinase and cyclodextrin proceeded in a way which is similar to its reaction with oxidized linear dextrans.
It was found that protein-bound CD retained the ability to absorb small molecules like adenosine in its inner shell. The complex of streptokinase with CD absorbs the molecule of adenosine and forms a new complex with adenosine intercalated in cyclodextrin part of the new complex.
Key words: cyclodextrin, streptokinase, adenosine, chemical modification, gel-chromatography, oxidation of oligosaccharides, complex.
