CC BY
52
пластичность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при трансплантации в ишемически поврежденную нервную ткань in vitro
О.А. Рыбачук123, В.М. Кирик 3, П.А. Побережный 3, Г.М. Бутенко 3, Т.А. Пивнева 123 1 Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, Украина 2Государственная Ключевая лаборатория молекулярной и клеточной биологии, Киев, Украина 3 Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
Plasticity of bone marrow-derived stromal cells at grafting onto neural tissue after ischemic injury in vitro
О.А. Rybachuk 1 2 3, V.M. Кугук 3, P.A. Poberezhnyi3, G.M. Butenko 3, ТА. Pivneva 1 2 3
1 Bogomoletz Institute of Physiology NAN Ukraine, Кev, Ukraine
2 State Key Laboratory of Molecular and Cell Biology, Кev, Ukraine
3 State Institute of Genetic and Regenerative Medicine NAMS Ukraine, Кev, Ukraine
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) оказывают положительный эффект на состояние нервной ткани при трансплантации животным с ишемическим повреждением мозга . Вероятнее всего, такой эффект вызван высвобождением трофических факторов, хотя возможность замены погибших нервных клеток ММСК КМ не исключается . Цель данного исследования — выявить способность ММСК дифференцироваться в клетки нервной ткани, а также их нейропротективный эффект при прямом контакте с нервной тканью, поврежденной ишемией . Нейропротективный эффект ММСК КМ изучали на in vitro модели органотипической ткани гиппокампа, чтобы избежать влияния иммунологических процессов после трансплантации в условиях in vivo . Ишемическое повреждение вызывали путем кислородно-глюкозной депривации Потенциал дифференцировки трансплантированных ММСК КМ в нейральном направлении оценивали на протяжении 14 сут . после ишемического повреждения . ММСК КМ на 7 сут . после кислородно-глюкозной депривации и трансплантации дифференцировались в клетки микроглии, а на 14 сут . — как в клетки микроглии, так и в зрелые олиго-дендроциты . Полученные в работе данные позволяют предположить, что трансплантированные ММСК реагируют на сигналы микроокружения поврежденной ткани реципиента, которые, в свою очередь, могут запускать и регулировать как дифференцировку клеток, так и определять направление их миграции
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, органотипическая культура гиппокампа, кислородно-глюкозная депривация, трансплантация, иммуногистохимия
Bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells (BM-MMSCs) are able to confer beneficial effects after transplantation into neural tissue with ischemic injury . This effect is probably caused by the release of trophic factors, although the possibilities of replacement of dead neural cells by BM-MMSCs are not excluded . The aim of this study was to identify the ability of BM-MMScs to differentiate into cells of the nervous tissues and their neuroprotective effect in direct contact with nervous tissue damaged by ischemia Therefore, we investigated this interaction by in vitro model of organotypic hippocampal tissue to avoid affecting the immunological processes in the conditions after transplantation in vivo . Ischemic injury induced by oxygen-glucose deprivation The potential of differentiation of transplanted multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells to neural direction was assessed for 14 days after the ischemic injury . At the 7th day after the oxygen-glucose deprivation and transplantation the multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells differentiated into microglial cells, and on the 14th day — as in microglial cells and in mature oligodendrocytes These findings suggest that the transplanted stem cells respond to signals from the microenvironment of the injured tissue of the recipient, which in turn may trigger and regulate cell differentiation as well as to determine the direction of migration
Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, organotypic culture of hippocampi, oxygen-glucose deprivation, transplantation, immunohistochemical staining
Введение
Использование клеточных технологий в настоящее время является одним из актуальных направлений в биоинженерии. Значительное количество повреждений организма человека может быть успешно устранено с помощью трансплантации стволовых и прогениторных клеток, таких как мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [1, 2].
В настоящее время ММСК чаще всего рассматривают как клетки, обладающие выраженным пролиферативным потенциалом и способностью к дифференцировке в клетки различной тканевой принадлежности, включая костную, хрящевую, жировую, волокнистые соединительные, мышечную и др . Имеющиеся данные свидетельствуют также о том, что ММСК костного мозга (ММСК-КМ) отличаются очень широкой пластичностью и способны давать начало некоторым элементам нервной ткани, гепа-
е-таП: oks-ribachuk@yandex . ги
тоцитам, кардиомиоцитам, эпителиальным клеткам легких [3, 4].
Костный мозг человека и млекопитающих является наилучшим источником получения ММСК-КМ [3]. Незначительная часть ММСК-КМ обладают способностью дифференцироваться в нейроны и глию . Дифференцированные из ММСК-КМ нервные клетки экспрессируют нейрональные и глиальные специфические маркеры (MAP2, NGF, нестин, GFAP, виментин, NeuN, р-тубулин-Ш, NSE, NF-M, Gal-C, NCAM, BDNF, глутамат), а также отвечают на действие определенных стимулов как функционально зрелые нейроны [5, 6]. В одной из работ было показано, что при индукции ММСК-КМ 5-азацитидином они дифференцировались в клетки нейронального фенотипа — р-тубулин-III- и NeuN-положительные, а также GFAP-положительные клетки, то есть астро-циты [5]
ММСК-КМ, трансплантированные новорожденным мышам в боковой желудочек мозга, мигрировали через передний мозг и мозжечок и дифференцировались в клетки с нейральным фенотипом, не нарушая цитоархитектонику головного мозга реципиента . Интересно отметить, что ММСК-КМ размещались также в зонах, в которых происходит активный постнатальный нейрогенез, а именно в островках Каллеха (вентральная часть переднего мозга) и субэпендимальном слое обонятельной луковицы . Данная информация еще раз указывает на то, что ММСК-КМ могут дифференцироваться в клетки, обладающие нейральным фенотипом [6].
Важным свойством клеток стромы костного мозга является их способность к миграции Как показывают результаты последних исследований, трансплантированные ММСК-КМ взрослых особей способны мигрировать из системного кровотока в головной мозг, где они могут трансдифференцироваться в нейроны, клетки микроглии и астроглии [7].
Кроме того, обнаружено, что ММСК обладают репаративными свойствами и могут мигрировать в зоны воспаления и «стресса» . Взаимодействие с клеточным окружением и внеклеточным матрик-сом ММСК осуществляют через экспрессируемые ими молекулы адгезии Именно благодаря свойствам молекул адгезии осуществляется направленная миграция ММСК в поврежденные участки тканей [8].
Существенную роль в восстановлении тканей или органа играют факторы роста, которые синтезируются ММСК (NGF, TGF, FGF-2, IGF). Факторы роста модулируют активность клеток путем паракринной, аутокринной или эндокринной регуляций. После связывания с рецепторами поверхности мембраны факторы роста инициируют сигнальный каскад регу-ляторных белков в клетке, что проявляется в изменении биологической активности [9].
Известно, что ММСК-КМ могут генерировать ци-токины (LIF, SCF, M-CSF, Flt-3, IL-6, IL-7, IL-8, IL—11, IL—12, IL-14, IL—15) для поддержания жизнедеятельности и пролиферации прогениторных клеток [10].
В экспериментах на животных показаны положительные результаты лечения ишемического инсульта с помощью ММСК [7], функциональное восстановление после эмболического инсульта в бассейне средней артерии мозга крыс при внутривенной инфу-зии ММСК [11-13], уменьшение неврологического дефицита на моделях краниоцеребральной травмы, болезнях Паркинсона, Альцгеймера и Гентингтона [14-19].
В связи с вышесказанным, мы предполагаем, что ММСК-КМ могут быть успешно использованы при лечении различных патологий, в том числе и при нейродегенеративных заболеваниях
Для настоящего исследования была выбрана in vitro модель — органотипическая культура гиппокам-па . Преимущество такой модели состоит с том, что нервная ткань в условиях длительного культивирования способна сохранять цитоархитектонику, типоспе-цифичность клеток, межклеточные связи и другие особенности, присущие живой ткани, и в тоже время является более удобной для экспериментальных манипуляций, чем модель in vivo [20]. Более того, модель in vitro является доступным экспериментальным инструментом для точного контроля, длительного мониторинга нормальных и патологических процессов, которые присущи разным тканям организма, и, в частности, нервной ткани [21].
Цель работы — выявить способность ММСК дифференцироваться в клетки нервной ткани, а также их нейропротективный эффект при прямом контакте с нервной тканью, поврежденной ишемией
Материал и методы
Содержание и использование лабораторных животных соответствовало Общим принципам работы с животными, одобренным 1-м Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2001) и согласованным с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, Франция, 1986) .
Получение и культивирование органотипических срезов гиппокампа [органотипической культуры гиппокампа, ОКГJ
Гиппокампы выделяли из мозга мышей линии FVB (P8-9). При помощи автоматического чоппера (McIllwain, Великобритания) получали срезы перпендикулярно длинной оси гиппокампа толщиной 350-375 мкм . Срезы (n = 96) культивировали на полупроницаемых мембранах, которые помещались между газовой (смесь атмосферного воздуха с 5% СО2) и жидкой средой при +370С . Среда культивирования содержала 50% МЕМ (Gibco-BRL, США), 2,5 мМ Tris (Fluka, США), 12,5 мМ Hepes (Gibco-BRL, США), 25% солевого раствора HBSS (Gibco-BRL, США), 15 мМ D-Glucose (Sigma, США), 2 мМ NaHCO3 (Gibco, Англия); 100 мг/мл пенициллина; 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, Англия); 25% лошадиной сыворотки (PAA, Англия), pH = 7,2 . В течение 5—7 сут . культивирования срезы гиппокампа полностью очищались от поврежденных клеток, распластывались и их толщина уменьшалась с 350—375 мкм до 250—300 мкм [21].
Кислородно-глюкозная депривация -модель ишемического повреждения головного мозга
Ишемическое повреждение нервной ткани моделировали путем кратковременной кислородно-глюкозная депривация (КГД). Срезы гиппокампа на 10 мин помещали в специальную камеру, в которой кислород был замещен на азот, а в среде культивирования глюкозу заменяли на сахарозу Далее срезы возвращали к прежним условиям культивирования на 2 ч — реоксигенация Известно, что для моделирования ишемического повреждения используют КГД разной длительности [22]. Долговременная де-привация, а именно 30, 60 мин и более вызывает значительные и необратимые повреждения ткани [23—30]. Показано, что при 30 мин . КГД, в первую очередь, повреждения проявляются в зоне СА1, а при КГД длительностью 60 мин . и более наблюдается равномерное повреждение всего слоя нейронов [23, 25] В исследованиях in vitro также показано, что кратковременная (10 мин . ) КГД не ведет к немедленному повреждению нейронов [31—34], но индуцирует в них отстроченные деструктивные изменения . Можно предположить, что на уровне организма схожие процессы происходят в зоне полутени при инсульте мозга Установлено, что кратковременная КГД ведет к изменению синаптической пластичности
(утолщение постсинаптической плотности, увеличение числа множественных и перфорированных синапсов), индукции сигнальних каскадов и изменению метаболизма клеток, которые в дальнейшем могут вызвать гибель нейронов [32, 35].
Выделение и культивирование ММСК-КМ
Клетки костного мозга выделяли механическим методом из бедренной кости 3 мес . мышей линии FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J, трансгенных по GFP, высевали из расчета по 4х105 кл/см2 и культивировали в течение 2 нед , меняя питательную среду каждые 3—4 сут . Культивирование проводили в СО2-инкубаторе в условиях увлажненного воздуха с 5% СО2 при температуре 37оС [36]. Среда культивирования содержала RPMI-1640:DMEM (1:1) (Sigma, США), 15% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) (Sigma, США), 2 mM ¿-глутамина (Sigma, США).
Первый пассаж проводили при 80% конфлюэнт-ности монослоя клеток Клетки снимали с подложки с помощью 0,05% раствора трипсина (Sigma, США) и пересаживали их в новые флаконы с плотностью 1,5х104 кл/см2 .
ММСК-КМ культивировали в двух вариантах: 1 — стандартные условия культивирования, описанные выше, 2 — в среде культивирования постепенно уменьшали содержание ФТС с 15% до 5%: 0 пассаж (первичная культура) — 15% ФТС, 1 пассаж — 10% ФТС, 2 пассаж - 5% ФТС .
Иммунофенотипирование ММСК-КМ
Фенотипирование культур клеток по маркерам CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 проводили с использованием моноклональных антител к мембранным антигенам мыши, меченных флуорохромами, согласно рекомендациям фирмы-производителя (Becton Dickinson, США) . 2х105 клеток в 50 мкл суспензии инкубировали 30 мин с моноклональными антителами (титр 0,5 мкг/106 клеток) при температуре + 4°С . Клетки дважды отмывали путем центрифугирования при 200 g в течение 5 мин в 1 мл буфера CellWash («Becton Dickinson», США) и непосредственно перед анализом суспензию пропускали через фильтры с диаметром пор 70 мкм . Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуори-метре-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США) при помощи программы BD FACS Diva 6 . 1. 2 . Для настройки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без добавления антител (unstained control); образцы с каждым из антител отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител за исключением одного из них (fluorescence minus one control) .
Долю жизнеспособных клеток в суспензии определяли методом проточной цитометрии после инкубирования суспензии клеток с 7-аминоактиномицином D (7-AAD) (Sigma, США) .
Процент жизнеспособных клеток составлял 93,6±0,5% . Количество GFP-позитивных клеток среди жизнеспособных в данной фракции (n = 3) составляло 97,7±0,8%
Уровень экспрессии поверхностных маркеров измеряли в процентах и статистически рассчитывали с использованием U-критерия Мауна — Уитни .
Полученная перед трансплантацией культура клеток по фенотипу и способности к направленной муль-
тилинейной дифференцировке соответствовала минимальным критериям ММСК [37, 38]. ММСК-КМ были исследованы на способность к направленной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях
После моделирования ишемического повреждения органотипических срезов гиппокампа (кратковременная КГД — 10 мин . ) и 2 ч . реоксигенации проводили трансплантацию (нанесение на поверхность полупроницаемой мембраны, где расположены культивируемые срезы гиппокампа) ММСК-КМ второго пассажа в количестве 2,5х105 клеток в каждый ин-серт (n = 12; в одном инсерте 4 среза): 6 инсертов — ММСК-КМ с 15% ФТС, 6 инсертов — ММСК-КМ с 5% ФТС Контролем служили органотипические срезы гиппокампа без КГД (n = 48), на которые также трансплантировали ММСК-КМ . Через 2 сут . срезы гиппокампа отмывали средой культивирования от клеточных дебрисов и мертвых клеток
Оценка срезов гиппокампа после КГД и сокультивирования с ММСК-КМ с помощьюпропидиумом йодида
Для выявления поврежденных клеток использовали метод окраски культивированных срезов про-пидиумом йодида (PI) — стойким флуоресцентным красителем, который проникает в клетки с поврежденной мембраной . После попадания в клетку краситель связывается с молекулой ДНК и преобретает красную флуоресценцию [23, 25]. Р1 в концентрации 2 мкл/мл добавляли в среду культивирования за 24 ч . до проведения КГД .
После проведения КГД культивированные срезы возвращали в среду, которая содержала PI (2 мкл/мл). При помощи флуоресцентного микроскопа наблюдали за срезами гиппокампа, а именно за зоной СА1, через 2, 4, 6, 12, 24, 48 и 72 ч . после моделирования ишемического повреждения и сокультивирования с ММСК-КМ . Количество PI-положительных клеток в зоне СА1 срезов гиппокампа после КГД и трансплантации ММСК-КМ подсчитывали в пределах зоны фиксированного размера — 0,4 мм2 . Все результаты представлены в виде М±1Т1 . Статистическую значимость различий между величинами оценивали по t-критерию Стью-дента, при этом различия считали статистически достоверными при р<0,05, р<0,01, р<0,001.
Иммуногистохимический анализ срезов гиппокампа после ишемического повреждения и трансплантации ММСК-КМ
На 3, 7, 14 сут . после КГД и трансплантации ММСК-КМ проводили двойное иммуногистохимиче-ское окрашивание культивированных срезов гиппо-кампа
Для идентификации нейронов и клеток глии использовали антитела к GFAP (1:1500, Dakocytomation, Дания); NeuN (1:1000, Chemicon, США) (1:700, Novus Biologicals, США); Iba-1 (1:750, Wako, Япония); olig-2 (1:500, Chemicon, США); Nestin (1:300, Chemicon, США) .
Органотипические срезы гиппокампа фиксировали 4% раствором параформальдегида, отмывали 0,1 М фосфатным буфером (ФБ), блокировали в растворе, содержащем 0,3% Triton X-100; 0,5% бычий сывороточный альбумин на 0,1 М ФБ и в
течение 24 ч. инкубировали со смесью первичных антител.
Далее срезы промывали ФБ и наносили на них смесь вторичных антимышиных AlexaFluor-555, антикозьих AlexaFluor-488 и антикроличьих AlexaFluor-647 антител (1:1000, Invitrogen, США) . Через 1 ч . срезы отмывали в ФБ и покрывали средой для микроскопии Immuno-MOUNT (Thermo scientific, США) .
Окрашенные срезы гиппокампа анализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа FluoView™ FV1000 (Olympus Inc . , США) . Количество NeuN-положительных ядер в зоне СА1 в контрольных срезах (n = 7), срезах после КГД (n = 7) и срезах после КГД и трансплантации ММСК-КМ (15% FBS - n = 12; 5% FBS - n = 8), подсчитывали в пределах зоны фиксированного размера — 0,4 мм2 . Все результаты представлены в виде M±m . Статистическую значимость различий между величинами оценивали по t-критерию Стьюдента, при этом различия считали статистически достоверными при р<0,05, р<0,01, р<0,001.
Результаты и обсуждение
Для иммуногистохимического исследования мы выбрали гиппокамп — структуру головного мозга, ответственную за обучение, память и пространственную ориентацию, которая вместе с корой головного мозга и стриатумом является чрезвычайно чувствительной к повреждающим факторам, а именно, недостатку кислорода и глюкозы [39, 40]. Известно, что гиппокамп является одной из наиболее уязвимых областей мозга при ишемическом повреждении с избирательным поражением пирамидных нейронов в str . pyramidale зоны CA1 [41]. Показано, что глия принимает активное участие, как в контроле нейронной активности, так и в синаптической передаче в норме и при разных патологических состояниях [42] Микроскопический анализ структуры органоти-пической культуры гиппокампа показал, что в ткани гиппокампа сохраняется топография клеточных слоев и зон, характерная для гиппокампа в естественных условиях, а тела нейронов в слое str . pyramidale зоны СА1 имеют традиционную пирамидную форму и располагаются в середине среза (4—8 слоёв) (рис . 1) [43, 44]. Клетки глии равномерно распределялись во всех слоях зоны СА1 гиппокампа, в тоже же время на границе полупроницаемой мембраны размещался слой глиальных клеток с многочисленными тонкими отростками, которые обеспечивали фиксацию культивированных срезов на мембране и осуществляли трофическую и защитную функции В органотипической культуре гиппокампа сохраняются все типы клеток, которые встречаются в гиппо-кампе в природных условиях — пирамидные и гранулярные нейроны, интернейроны и глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, микроглия) [43, 44].
После экспериментально вызванной ишемии в культивированных срезах гиппокампа наблюдалось повреждение пирамидных нейронов зоны СА1 гип-покампа и активация глиальных клеток . Степень иммунореактивности нейронов и глиальных клеток, а также их локализация в зоне СА1 гиппокампа существенно зависели от длительности постишемиче-ского периода (рис 1)
Жизнеспособность органотипических срезов гиппокампа оценивали методом окраски пропидиумом
йодида (Пй, Р1) через 2, 4, 6, 12, 24, 48 и 72 ч . после кратковременной КГД и трансплантации ММСК-КМ (рис 2)
Уже через 2 ч . после КГД наблюдалось увеличение количества поврежденных клеток по сравнению с контролем, где количество Р1-положительных клеток практически не менялось в течение всего периода наблюдения . Через 2, 4, 6 и 12 ч . после КГД количество Р1-положительных клеток составляло 14,33±0,64 (п = 4; р<0,01); 20,67±5,90 (п = 4); 19,67±1,28 (п = 4; р<0,01); 21,25±5,94 (п = 5) соответственно (рис 2)
Через 24 ч . после КГД количество поврежденных клеток было максимальным — 51,40±7,59 (п = 7; р<0,05), а через 48 и 72 ч уменьшалось и оставалось практически без изменений — 32,40±2,08 (п = 5; р<0,01) и 33,60±2,29 (п = 5; р<0,01), соответственно (рис 2)
Исходя из этих данных, можно утверждать, что повреждение нервных клеток при кратковременной КГД довольно медленно развивается во времени и определяется количеством поврежденных и мертвых клеток в зоне СА1 культивируемых срезов гиппокампа . Такая депривация является менее деструктивной для клеток в течение длительного времени и дает возможность детально анализировать особенности реакции нервной ткани на дефицит кислорода и глюкозы, а также предусматривает изучение действия возможных нейропротекторов
На 3, 7 и 14 сут . после КГД все структуры нейро-пиля СА1 зоны гиппокампа были изменены . Уже на 3 сут . культивирования после ишемического повреждения наблюдали реактивный микроглиоз и гибель пирамидных нейронов (рис . 1А—В). На 14 сут . после КГД количество пирамидных нейронов в зоне СА1 уменьшалось приблизительно в два раза по сравнению с показателями на 3 сут . после КГД (рис . 1). Из-за гибели большого количества нейронов снижалась компактность ткани: оставшиеся неповрежденные нейроны располагались неравномерно, между ними появлялись пустоты и увеличивалось межклеточное пространство (рис . 1Ё—З) . Для исследования реакции астроцитов на ишемическое повреждение ткани гиппокампа было проведено иммуногистохимиче-ское окрашивание с использованием антител к GFAP . В контрольных срезах СА1 зоны гиппокампа мы не наблюдали повышение GFAP иммунореактивности — астроциты имели хорошо разветвленную сеть тонких отростков и не гипертрофированную сому . На 7 сут . после КГД, иммунореактивность GFAP значительно увеличивалась во всех слоях зоны СА1 гиппокампа (рис. 1Д) . Как известно из литературы, основной показатель реактивного астроглиоза проявляется в гипертрофии сомы клетки и отростков, увеличении иммунореактивности GFAP, виментина и реэкспре-сии нестина [45]. Степень реэкспресии нестина и активирование астроцитов после ишемического повреждения гиппокампа анализировали по результатам двойного окрашивания антителами к GFAP и нестину . На 7 сут . после КГД наблюдали увеличение как GFAP иммунореактивности так и реэкспресии нестина в астроцитах (рис . 1 Г—Е) . Гипертрофия астро-цитов проявлялась не только в утолщении и сокращении длины многочисленных коротких отростков, но и в увеличении площади сомы клеток [46, 47]. Уровень иммунореактивности микроглии на 14 сут . оставался таким же высоким, как и на 3 сут после ишемического повреждения (рис . 1А—В, Ё—З) .
Рис. 1. Культивированные срезы гиппокампа после КГД, зона СА1: А—В — 3 сут.; Г—Е — 7 сут.;
Ё—З — 14 сут. после КГД. Вставка — контроль. Двойное иммуногистохимическое окрашивание с антителами к:
A, Ё — NeuN (маркер ядер нейронов, зеленый цвет]; Б, Ж — Iba-1 (маркер микрогли, красный цвет]; Г — Nestin-положительные клетки (зеленый цвет); Д — GFAP (маркер астроцитов, красный цвет);
B, Е, З — колокализация маркеров. Бар — 50 мкм
Таким образом, полученные данные демонстрируют, что КГД вызывает гибель нейронов и значительно увеличивает активацию глиальных клеток .
Через 2 ч . реоксигенации после КГД GFP-положительные ММСК-КМ второго пассажа трансплантировали на культивированные органотопиче-ские срезы гиппокампа
При фенотипировании ММСК-КМ второго пассажа были выявлены особенности экспрессии ряда поверхностных маркеров (рис . 3). Высокий уровень экспрессии маркеров Сй44, Сй73 и Сй90 является типичным для клеток с мультипотент-ными свойствами. Однако экспрессия на клетках Сй45 и СР117 также сохранялась . Как известно, культура клеток костного мозга мышей гетеро-генна по клеточному составу и СР45 также вы-
является на клетках на ранних пассажах [37, 38]. После трансплантации ММСК-КМ (15% FBS и 5% FBS), наблюдали уменьшение количества PI-положительных клеток в ОКГ по сравнению со срезами гиппокампа после КГД без трансплантации ММСК-КМ на протяжении всего периода сокультивирования (рис . 2).
Наибольший нейропротекторный эффект трансплантации ММСК-КМ наблюдали через 24 ч . Количество PI-положительных клеток в ОКГ составило 19,00±1,54 (n = 3; р<0,05) для ММСК-КМ (15% FBS) и 22,5±4,0 (n = 4; р<0,05) для ММСК-КМ (5% FBS), что значительно меньше, чем в срезах гиппокампа на тот же период после КГД без трансплантации ММСК-КМ (51,40±7,59, n = 7; р<0,05) (рис . 2).
Согласно результатам иммуногистохимическо-го анализа на 3 сут . после трансплантации GFP-положительные ММСК-КМ сохраняли свою жизнеспособность, встраивались в нейропиль гиппокампа, но не изменяли свою морфологию, как в контроле, так и после КГД (рис . 4А-В) .
Двойное иммуногистохимическое окрашивание на GFP (маркер трансплантированных ММСК), NeuN (нейроны), GFAP (астроциты), Iba-1 (микроглия), olig-2 (олигодендроциты) на 3 сут . после трансплантации не выявило колокализацию вторичных маркеров . Это указывает на то, что трансплантированные клетки еще не дифференцировались ни в один из типов клеток нервной ткани (рис . 4А-В).
На 7 сут . после трансплантации у GFP-положительных ММСК-КМ в контроле наблюдались немногочисленные короткие отростки . ММСК-КМ, трансплантированные на культивированные срезы после КГД, на 7 сут . меняли свою структуру — у клеток сформировались как тонкие, так и толстые короткие отростки, отходящие от сомы клетки . При проведении двойного иммуногистохимического окрашивания маркерами микроглии (Iba-1) и GFP-положительных клеток в зоне СА1 гиппокампа отмечали колокали-зацию вторичных маркеров Полученные результаты указывают на то, что GFP-положительные ММСК-КМ не только сохранили жизнеспособность на 7-е сут после трансплантации, но и интегрировались в ткань реципиента, мигрировали в область повреждения и дифференцировались в зрелые клетки микро-глии (рис . 4Г-Е, отмечены стрелками).
На 14 сут . после трансплантации ММСК-КМ дифференцировались в клетки микроглии, а также и в олигодендроциты, как в контроле, так и после КГД . Важно отметить, что GFP-положительные ММСК-КМ приобретали фенотип зрелых олигодендроцитов . А именно, эти клетки были овальной формы с множественными отростками, характерными для данного фенотипа клеток (рис . 4Ё-З) . Следует отметить, что трансплантированные ММСК-КМ, находящиеся за пределами культивированного среза, не меняли
свою морфологию и сохраняли округлую форму без отростков .
Дифференцировка ММСК-КМ как в олигодендроциты, так и в микроглию на 7 сут . в контроле не наблюдалась . Можно предположить, что клетки ишемизированной ткани синтезируют определенный пул трофических факторов, ускоряющих процесс дифференцировки ММСК-КМ [48, 49].
Таким образом, было показано, что GFP-положительные ММСК-КМ, трансплантированные на ОКГ в условиях ишемии, дифференцировались в олигодендроциты и клетки микроглии на более ранних этапах, чем в контроле . Следует отметить, что дифференцировка ММСК-КМ в клетки глии наблюдалась только у ММСК, которые культивировались в среде с 5% содержанием ФТС . Ранее было показано, что ММСК-КМ, которые культивировали в среде, не содержащей сыворотки, имели больший потенциал к выживанию при сокультивировании со срезами гиппокампа, чем ММСК-КМ, культивированные в стандартной среде [50]. Также в культуре ММСК-КМ, которую культивировали в среде без сыворотки, наблюдали фракцию клеток, которые проявляли свойства нейральных стволовых клеток [51]. ММСК, предварительно культивированные в среде с 15% ФТС, после трансплантации как на контрольные, так и на ишемизированные срезы не дифференцировались ни в какой из типов клеток нервной ткани и сохраняли свою округлую форму на протяжении всего периода культивирования .
Данные результаты указывают на то, что трансплантированные ММСК могут реагировать на сигналы микроокружения ткани реципиента, которые регулируют дифференцировку клеток и определяют направление миграции [7, 52, 53]. Согласно анализу иммуногистохимического окрашивания дифференцировка GFP-положительных ММСК-КМ в астроглию и нейроны не наблюдалась, хотя были единичные клетки, которые морфологически соответствовали нейрональному фенотипу
Рис. 2. Относительное количество PI-положительных клеток в срезах гиппокампа (зона СА1) через 2, 4, 6, 12,
24, 48 и 72 ч. после КГД и трансплантации ММСК-КМ.
*различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,05;
**различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,01;
#различия при сравнении с КГД статистически значимы при р<0,05;
##различия при сравнении с КГД статистически значимы при р<0,01;
### различия при сравнении с КГД статистически значимы при р<0,001
а
б
СО 44
10" 10 10" СР44 РЕ-А
21,7%
С073 РЕ-А
ТТ| I I I I С11С | г
10" ю* ю5 Сй90 РЕ-А
ю' ю" ш ю"
С0117 РЕ-Су7-А
Ттп[—
10' 10" 10" 103 СЭ117 РЕ-Су7-А
Рис. 3.
Экспрессия поверхностных маркеров CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 ММСК-КМ мыши (второй пассаж): А — в среде с 15% ФТС; Б — в среде с 5% ФТС. Красный контур — фоновый уровень флюоресценции клеток, синий цвет — уровень флюоресценции в образце с добавлением моноклональных антител.
Проточная цитофлуориметрия
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 79
А
*
¿л ~ » ..
• - ■ " ■ Г* ' -
Рис. 4. Культивированные срезы гиппокампа после КГД и трансплантации ММСК-КМ: А—В — 3 сут.; Г—Е — 7 сут.; Ё—З — 14 сут. Двойное иммуногистохимическое окрашивание: А, Г, Ё — GFP-положительные ММСК-КМ (зеленый цвет]; Б — Nestin-положительные клетки (красный цвет); Д — 1Ьа-1-положительные клетки микроглии (красный цвет]; Ж — оНд-2-положительные ядра олигодендроцитов (красный цвет); В, Е, З — колокализация маркеров, отмечены стрелками. Бары: А-В; Ё-З — 50 мкм, Г-Е — 30 мкм
При проведении иммуногистохимического анализа ОКГ на 14 сут . после КГД наблюдали повреждение пирамидных нейронов зоны СА1 гиппокампа вместе с активацией глиальных клеток . Количество пирамидных нейронов stг . ругат^а1е зоны СА1 гиппокампа визуально уменьшилось в два раза на 14 сут культивирования после ишемического повреждения по сравнению с контрольными срезами (рис . 5А-Е). На срезах ОКГ видно, что выжившие нейроны размещены неравномерно и утрачивают компактность размещения Между нейронами наблюдается появление пустот и увеличение межклеточного пространства (рис. 5Г-Е).
В контрольных срезах зоны СА1 гиппокампа на 14 сут культивирования не наблюдалось уменьшения количества нейронов (рис. 5А) и повышения глиальной иммунореактивности — астроциты имели разветвленную сетку тонких отростков и негипертрофированную сому (рис . 5Б).
Иммуногистохимическая оценка органотипической культуры гиппокампа после КГД и трансплантации
ММСК-КМ (15% ФТС и 5% ФТС), показала, что в нервной ткани зоны СА1 гиппокампа сохраняется характерная топография клеточных слоев, нейроны этой зоны имеют характерную пирамидную форму (рис . 5Ё, З, И, К) . Также следует отметить, что после трансплантации ММСК-КМ уменьшается уровень активации глиальных клеток (рис . 5Ж, З, й, К) .
Наиболее показательными количественные изменения нейронов в ОКГ были на 14 сут . после КГД . Количество №и^положительных клеток в зоне СА1 срезов гиппокампа после КГД и трансплантации ММСК-КМ подсчитывали в пределах зоны фиксированного размера — 0,4 мм2 . В контрольных срезах на 14 сут после культивирования количество нейронов составляло 454±30,45 (п = 7), в срезах после моделирования ишемического повреждения — 197,10±22,19 (п = 7, р<0,001) . На 14-е сут . после КГД и трансплантации ММСК-КМ (15% ФТС) и ММСК-КМ (5% ФТС) - 273,40±10,18 (п = 8; р<0,05) и 301,00±7,57 (п = 12; р<0,01) соответственно (рис . 6).
Рис. 5. Культуры гиппокампа (14 сут.), зона СА1: А—В — контроль (без ишемического повреждения); Г—Е — после кислородно-глюкозной депривации; Ё—З — после кислородно-глюкозной депривации + ММСК-КМ (15% ФТС); И—К — после кислородно-глюкозной депривации + ММСК-КМ (5% ФТС). Двойное иммуногистохимическое окрашивание: А, Г, Ё, И — NeuN-положительные ядра нейронов (зеленый цвет); Б, Д, Ж, Й — GFAP-положительные клетки (красный цвет); В, Е, З, К — колокализация маркеров. Бар — 50 мкм
600 -1
500 -\
ш
0
1 400
JS ф
о ш
300 -
200 -
100 -
ш —i—
□ Контроль
КГД
□ КГД+ММСК-КМ 15% FBS
КГД+ММСК-КМ 5% FBS
Рис. 6.
Относительное количество NeuN-положительных ядер нейронов зоны СА1 культуры гиппокампа после КГД и трансплантации ММСК-КМ (14 сут.). ***различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,001; #различия при сравнении с КГД статистически значимы при р<0,05; ##различия при сравнении с КГД статистически значимы при р<0,01
Полученные результаты указывают, что после трансплантации ММСК-КМ уменьшается количество поврежденных и мертвых клеток в ишемизиро-ванной нервной ткани . Потому, можно утверждать, что трансплантация ММСК-КМ в некоторой степени препятствует деструктивным изменениям нервной ткани в данной модели ОКГ и ММСК-КМ выступают в роли мозможных нейропротекторных объектов .
Исходя из литературных данных и наших результатов, можно предположить, что трансплантация
ММСК может занять одну из ведущих позиций в лечении последствий ишемического повреждения головного мозга . В данный момент направление использования клеточных технологий в клинике находится на этапе разностороннего экспериментального изучения Возможно, в будущем полученные позитивные результаты будут подтверждены и в клинических исследованиях эффективности такого метода лечения последствий ишемического повреждения головного мозга
ЛИТЕРАТУРА:
I. Dunnett S . , Rosser A . Clinical translation of cell transplantation in the brain . Curr . Opin . Organ Transplant . 2011; 16(6): 632-9 .
2 . Miller R ., Bai L . Translating stem cell therapies to the clinic . Neurosci Lett . 2012; 519(2): 87-92 .
3 . Зозуля Ю . , Лисяний Н . Нейрогенная дифференцировка стволовых клеток . Киев: Экспресс-Полиграф; 2005 .
4 . Сухих Г ., Малайцев В ., Богданова И . Стволовые клетки . От фундаментальных исследований к клинике . Вест . МЕДСИ 2008; 1(1): 38-44 .
5 . Zemel'ko V ., Kozhukharova I ., Kovaleva Z . et . al . BDNF secretion in human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow, endometrium and adipose tissue . Tsitologiia 2014; 56(3): 204-11.
6 . Gage F . Mammalian neural stem cells, Science 2000; 287(5457): 1427-38 .
7 . Alexanian A . Epigenetic modifiers promote efficient generation of neural-like cells from bone marrow-derived mesenchymal cells grown in neural environment . J . Cell Biochem . 2007; 100(2): 362-71.
8 Breyer A , Estharabadi N , Oki M et al Multipotent adult progenitor cell isolation and culture procedures . Exp . Hematol . 2006; 34: 1596-601.
9 . Khaldoyanidi S ., Pines T . Directing stem cell homing . Cell Stem cell 2008; 2(3): 198-200 .
10 Kohyama J , Abe H , Shimazaki T et al Brain from bone: Efficient «meta-differentiation» of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with noggin or a demethylating agent Differentiation 2001; 68(4/5): 235-44.
II. Wang J . , Wan H . Mesenchymal stromal cells as a therapeutic treatment for ischemic stroke Neuroscience bull 2014; 30: 524-35 .
12 Kuroda S , Houkin K Translational challenge for bone marrow stromal cell therapy after stroke Front Neurol Neuroscience 2013; 32: 62-8 .
13 . Kim Y . , Noh M ., Cho K . Hypoxia/Reoxygenation-preconditioned human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells rescue ischemic rat cortical neurons by enhancing trophic factor release Mol Neurobiol . 2014; 8: 113-26 .
14 Zilka N , Zilkova M , Kazmerova Z et al Mesenchymal stem cells rescue the Alzheimer's disease cell model from cell death induced by misfolded truncated tau . Neurosci . 2011; 13(193): 330-7 .
15 Dey N , Bombard M , Roland B et al Genetically engineered mesenchymal stem cells reduce behavioral deficits in the YAC 128 mouse model of Huntington's disease . Behav . Brain Res . 2010; 214(2): 193-200 .
16 Kin T , Fortino V , Pelez D Progress of mesenchymal stem cell therapy for neural and retinal diseases . World J . Stem Cells 2014; 6: 111-9 .
17 . Popa-Wagner A ., Buga A ., Doeppner T . Stem cell therapies in preclinical models of stroke associated with aging . Front . Cell . Neurosci . 2014; 8: 347-57 .
18 . Ikegame Y ., Yamashita K ., Nakashima S . Fate of graft cells: what should be clarified for development of mesenchymal stem cell therapy for ischemic stroke? Front . Cell . Neurosci . 2014; 8: 322-30 .
19 . Chen J ., Venkat P . , Zacharek A . et al . Neuroprotective therapy for stroke . Neurorestorative therapy for stroke . Front . Hum . Neurosci . 2014; 8: 391-403 .
20 . Daviaud N . , Garbayo E ., Schiller P . et al . Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies . Exp . Neurol . 2013; 248: 429-40 .
21. Stoppini L ., Buchs P ., Muller D . A simple method for organotypic cultures of nervous tissue J Neurosci Methods 1991; 37(2): 173-82 .
22 . Lipton P . Ischemic cell death in brain neurons . Physiol . Rev . 1999; 79(4): 1431-568 .
23 . Jung Y ., Park S ., Park J . et . al . Glucose/oxygen deprivation induces the alteration of synapsin I and phosphosynapsin Brain Res 2004; 996(1): 47-54 .
24 Li Y , Chopp M , Jiang N et al In situ detection of DNA fragmentation after focal cerebral ischemia in mice Mol Brain Res 1995; 28(1): 164-8 .
25 . Strasser U . , Fischer G . Quantitative measurement of neuronal degeneration in organotypic hippocampal cultures after combined oxygen/glucose deprivation . J . Neurosci . Methods 1995; 57(2): 177-86 .
26 . Brana C ., Benham C ., Sundstrom L . Calpain activation and inhibition in organotypic rat hippocampal slice cultures deprived of oxygen and glucose . Eur . J . Neurosci . 1999; 11(7): 2375-84 .
27 Cimarosti H , Rodnight R , Tavares A et al An investigation of the neuroprotective effect of lithium in organotypic slice cultures of rat hippocampus exposed to oxygen and glucose deprivation Neurosci Lett . 2001; 315(1-2): 33-6 .
28 Graulich J , Hoffmann u , Maier R et al Acute neuronal injury after hypoxia is influenced by the reoxygenation mode in juvenile hippocampal slice cultures . Brain Res . Dev . Brain Res . 2002; 137(1): 35-42
29 Gwag B , Lobner D , Koh J et al Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro . Neurosci . 1995; 68(3): 615-9 .
30 Pringle A , Schmidt W , Deans J et al 7-Hydroxylated epiandrosterone (7-OH-EPIA) reduces ischaemia-induced neuronal damage both in vivo and in vitro Eur J Neurosci 2003; 18(1): 117-214 .
31. Jourdain P ., Nikonenko I ., Alberi S . et . al . Remodeling of hippocampal synaptic networks by a brief anoxia-hypoglycemia J Neurosci . 2002; 22(8): 3108-16 .
32 . Crepel V ., Hammond С ., Krnjevi K . et al . Anoxia-induced LTP of isolated NMDA receptor-mediated synaptic responses . J . Neurophysiol . 1993; 69(5): 1774-8 .
33 . Melani R ., Rebaudo R ., Balestrino M . et al . Involvement of S-100 protein in anoxic long-term potentiation . Brain Res . 1999; 840(1-2): 171-4.
34 . Bancila V ., Nikonenko I ., Dunant Y . et . al . Zinc inhibits glutamate release via activation of pre-synaptic K channels and reduces ischaemic damage in rat hippocampus . J . Neurochem . 2004; 90(5): 1243-50 .
35 Nikonenko I , Jourdain P , Muller D Presynaptic remodeling contributes to activity-dependent synaptogenesis J Neurosci 2003; 23(24): 8498-505
36 . Harting M ., Jimenez F ., Cox С . Isolation of mesenchymal stem Cells (MSCs) from green fluorescent protein positive (GFP + ) transgenic rodents: the grass is not always green(er) . Stem Cells Dev . 2009; 18(1): 127-35 .
37 . Ooi Y. , Ramasamy R ., Vidyadaran S . Mouse bone marrow mesenchymal stem cells acquire CD45-CD106+ immunophenotype only at later passages Med J Malaysia 2008; 63(Suppl A): 65-6
38 Dominici M , Le Blanc K , Mueller I et al , Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International society for cellular therapy position statement Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7 .
39 . Виноградова О . С . Гиппокамп и память . М .: Наука; 1975 .
40 Peeters C , Hoelen D , Groenendaal F et al Deferoxamine, allopurinol and oxypurinol are not neuroprotective after oxygen/glucose deprivation in an organotypic hippocampal model, lacking functional endothelial cells . Brain Res . 2003; 963(1-2): 72-80 .
41.Winkelmann E ., Charcansky A ., Faccioni-Heuser M . An ultrastructural analysis of cellular death in the CA1 field in the rat hippocampus after transient forebrain ischemia followed by 2, 4 and 10 days of reperfusion . Anat . Embryol . (Berl) . 2006; 211(5): 423-34 .
42 Kettenmann H , Ransom B Neuroglia 2nd ed Oxford: University Press; 2005 .
43 Bahr B Long-term hippocampal slices: a model system for investigating synaptic mechanisms and pathologic processes J Neurosci . Res . 1995; 42(3): 294-305 .
44 Laake J , Haug F , Wieloch T et al A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence . Brain Res . Protocols 1999; 4: 173-84 .
45 Cho J , Shin Y , Park J et al Characterization of nestin expression in astrocytes in the rat hippocampal CA1 region following transient forebrain ischemia . Anat . Cell Biol . 2013; 46: 131-40 .
46 Wagner D C , Scheibe J , Glocke I et al Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury . Acta Neurobiol . Exp . (Wars) 2013; 73(1): 79-87 .
47 . Sukumari-Ramesh S ., Alleyne C ., Dhandapani K . Astrocyte-specific expression of surviving after intracerebral hemorrhage in mice: a possible role in reactive gliosis? J . Neurotrauma 2012; 19(18): 2798-804 .
48 Kokaia Z , Lindvall O Neurogenesis after ischemic brain insults Curr. Opin . Neurobiol . 2003; 13(1): 127-32 .
49 . Savitz S . , Rosenbaum D ., Dinsmore J . et al . Cell transplantation for stroke Ann Neurol 2002; 52(3): 266-75
50 Sarnowska A , Braun H , Sauerzweig S et al The neuroprotective effect of bone marrow stem cells is not dependent on direct cell contact with hypoxic injured tissue Exp Neurol 2009; 215(2): 317-27 .
51. Sauerzweig S ., Munsch T ., Le mann V . et . al . A population of serumdeprivation-induced bone marrow stem cells (SD-BMSC) expresses marker typical for embryonic and neural stem cells Exp cell res . 2009; 315: 50-66 .
52 Secco M , Zucconi E , Vieira N et al Multipotent stem cells from umbilical cord: cord is richer than blood! Stem Cell 2008; 26(2): 146-50
53 . Kolf C ., Cho E ., Tuan R . Mesenchymal stromal cells . Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation . Arthritis Res . Ther . 2007; 9(1): 204-14.
Поступила: 20.03.2014
