CC BY
37
■ И I II II
■m
Новости клеточных технологий
микроглиальных элементов. Более того, ММСК экспресси руют молекулу SDF1, которая служит фактором хемотаксиса для клеток миелоидного ряда. Возможно, именно экспрессия этих факторов in situ приводит к пост операционному вое палению и разрушению трансплантатов.
Хотя гистологические и иммуногистохимические данные (клетки выявлялись антителами к GFP) свидетельствовали о полном отторжении трансплантата, в нервной ткани были обнаружены BrdU и BBZ (другие 2 метки ММСК), что позволя ло предположить выживание части ММСК и их созревание. Оказалось, что при трансплантации ММСК в сформиро вавшийся мозг происходит перенос их маркеров в клетки хозяина. В качестве контроля были использованы нежиз неспособные ММСК, прошедшие несколько циклов быстрой заморозки разморозки, либо подвергнутые микроволновому облучению, а затем трансплантированные в гиппокамп и стриатум интактных крыс. И, действительно, в течение 12 недель после трансплантации меченные BrDU и BBZ клетки широко распространились по обоим регионам трансплан тации. Их фенотипические характеристики полностью соот ветствовали характеристикам клеток, обнаруженных после трансплантаций жизнеспособных ММСК - это были нейроны реципиента. Таким образом, происходил перенос маркеров из трансплантированных ММСК в клетки предшественники нейронов хозяина, которые в дальнейшем дифференциро вались. И хотя стриатум, в отличие от гиппокампа, не явля
ется нейрогенной областью, в последнее время появились данные об отдельных прогениторных клетках, присутствующих в нём. Возможно, именно с этим связана схожесть картин в обоих районах трансплантации.
Таким образом, это исследование противоречит как дан ным о пластичности ММСК при их инфузиях в интактный либо повреждённый мозг, а также данным об их иммунопривиле гированности. Возможно, в ранних экспериментах исследо ватели ошибочно определяли выживание и пластичность ММСК, основываясь на обнаружении в тканях реципиента маркеров BrdU и BBZ. На самом деле, при трансплантации аллогенные ММСК отторгаются посредством воспалительной реакции, в которой участвуют клетки микроглии реципиента, а маркеры остаются в тканях в результате переноса. Явление переноса маркеров отрицает феномен трансдифференци ровки ММСК ln vivo в условиях подходящего микроокруже ния. Результаты этого исследования ставят под сомнение перспективу использования аллогенных ММСК в качестве источника нейронов при трансплантациях нервной ткани, а также авторы статьи призывают к осторожности при даль нейшем использовании BrdU и BBZ в качестве маркеров трансплантированных мезенхимных стволовых клеток. Вмес те с тем, использование этих маркёров может быть причиной артефактов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bang O.Y., Lee J.S., Lee Р.Н., Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann. Neurol. 2005; 57(6): 874 82.
2. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000 ;61 (4): 364 70.
3. Sanchez Ramos J., Song S, Cardozo Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp. Neurol. 2000; 164(2): 247 56.
4. Сергеев B.C. Иммунологические свойства мультипотентных
мезенхимных стромальных клеток. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2005; 2: 39 42.
5. Munoz Elias G., Marcus A.J., Coyne T.M. et al. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long term survival. J. Neurosci. 2004; 24(19): 4585 95.
6. Doetsch F., Caille .I, Lim D.A. et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 1999; 97(6): 703 16.
7. Gage F.H., Kempermann G., Palmer T.D. et al. Multipotent progenitor cells in the adult dentate gyrus. J. Neurobiol. 1998; 36(2): 249 66.
Подготовила AC. Григорян По материалам Stem Cells Published online July 27, 2006
Первое потомство, полученное с использованием «искусственных» сперматозоидов, выделенных из эмбриональных стволовых клеток
Эксперименты по выделению и характеристике поло вых клеток из эмбриональных стволовых (ЭСК) позволят исследовать биологические процессы в гаметах и гамето генез, а также стать одним из способов лечения бесплодия в будущем (1]. До недавнего времени было показано фор мирование из ЭСК овоцитов (2] и сперматозоидов (3, 4]. Однако ни одна группа до сих пор не показала функциональ ность выделенных гамет, то есть их способность давать нор мальное потомство. Полученные путем оплодотворения «искусственными» гаметами бластоцисты не имплантиро вали животным.
Недавно группа Karim Nayernia из Georg August University (ОцШпдеп, Germany) впервые показала способность сперма тозоидов, выделенных из ЭСК мыши, к оплодотворению и развитию взрослых животных из полученных зародышей. Работа опубликована в журнале Developmental Cell.
Для определения функциональной активности полученных клеток ученые использовали две генетические конструкции с промоторами генов, характерных для премейотических гап лоидных мужских половых клеток. Под их контролем запус калась экспрессия флуоресцентных белков - зеленого и красного соответственно. Благодаря таким генетическим меткам, исследователи могли выделить сперматогониальные клетки в культуре ЭСК. Эти гены вносили в ЭСК в культуре и культивировали до 2 месяцев. В процессе культивирования использовался коктейль растворимых факторов, которые способствовали выживанию и самообновлению мышиных половых клеток. После культивирования в такой среде до 60% клеток, экспрессирующих трансген (а значит, комми тированных по пути развития мужских половых клеток), сор тировались и переносились в базовую среду без факторов дифференцировки. Через два месяца клетки подвергали
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 1У< 4 (6), 2006
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
повторной сортировке на основе экспрессии обоих трансге нов. Таким путем исследователям удалось вывести 2 спер матогониальных линии SSC7 и SSC12.
Клетки были способны формировать эмбриоидные тельца и экспрессировали белки, характерные для сперматогониев. Для определения функциональной активности полученных кле точных линий их пересаживали в семенник мышам (второй служил в качестве контрольного), которым предварительно была проведена абляция половых клеток. У 2 из 10 проана лизированных животных в просвете семенного канальца, а также в его стенке, были обнаружены картины нормального сперматогенеза. Однако подвижность полученных клеток была значительно снижена по сравнению с положительным контролем. Происхождение постмейотических клеток в про свете канальца подтверждалось активной флуоресценцией трансгенных белков. У пяти мышей было зафиксировано об разование тератом после трансплантации.
Внутрицитоплазматическая инъекция клеток получен ных линий в неоплодотворенный овоцит мышей дикого типа приводила к последующему выбросу полярного тельца и формированию пронуклеусов. Двухклеточные эмбрионы, полученные таким образом, имплантировали в яйцевод псевдо беременной самки. Из 65 перенесенных эмбрио нов родилось 12 мышат. По сравнению с мышатами дикого
типа, мышата, полученные искусственным путем, были либо меньше, либо больше по размеру и погибали в течение 5 месяцев. Клетки, несущие трансген, были обнаружены в се менниках некоторых из потомков.
Несмотря на низкую эффективность переноса, рожде ние слабых и дефектных детенышей, образование тератом после трансплантации клеток, авторы впервые продемонст рировали возможность рождения потомства, полученного после оплодотворения in vitro «искусственно» полученными гаметами из ЭСК. Таким образом исследователи доказали, что мужские гаметы, полученные из ЭСК, полностью функ циональны. При усовершенствовании методики получения половых клеток из ЭСК и увеличении эффективности опло дотворения и рождения здоровых детенышей, откроются новые перспективы использования данной технологии в биологии и медицине. Прежде всего, разработанная систе ма может служить прекрасной моделью изучения диффе ренцировки гамет. Возможность выделения гамет из ЭСК может решить проблему некоторых форм бесплодия. Кроме того, выделение функциональных мужских и женских гамет из одной линии ЭСК позволит полностью автономно поддер живать и обновлять эту линию через создание новых блас тоцист. Тем не менее, развитие таких технологий одновременно порождает и ряд этических вопросов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Лопатина T.B. Искусственный гаметогенез: дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в гаметы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 2: 32 4.
2. Hubner К., Fuhrmann G., Christenson L.K. et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 2003; 300(5623): 1251 6.
3. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100(20): 1 1457 62.
4. Lacham Kaplan 0., Chy H., Trounson A. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem (ES) cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 2006; 24(2): 266 73.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам Dev. Cell 2006;11(1 ):125-32
Nanog фактор репрограммирования ядра взрослой соматической клетки
Изучение и развитие технологии переноса ядра взрослой соматической клетки млекопитающих в энуклеированный овоцит позволило заключить, что генетические и эпигене тические изменения, приобретаемые клеткой в процессе дифференцировки, могут быть полностью «репрограмми рованы». При этом происходит активация «эмбриональных» генов и ингибирование генов, отвечающих за дифференци ровку. Оказалось, что репрограммирование взрослого ядра может быть также достигнуто и слиянием с эмбриональной стволовой клеткой (ЭСК) (2, 3]. Таким образом, взрослая со матическая клетка может вернуться в эмбриональное плю рипотентное состояние и дать начало новому эмбриону.
Остаётся загадкой, какие именно факторы, содержащиеся в овоците и в ЭСК, могут обусловливать феномен генетичес кого и эпигенетического репрограммирования «взрослого» ядра? Группа Austin Smith показала, что одним из таких фак торов является ген Nanog. Результаты работы опубликованы в недавнем номере журнала Nature.
Ген Nanog был изолирован и описан Ian Chambers из Эдинбургского университета (4). Он получил такое название по имени страны вечной юности Тир Нан Ог из кельтской мифологии. При взаимодействии с двумя другими важней шими факторами Oct3/4, и SOX 2, Nanog поддерживает «стволовость» через активацию генов, участвующих в про
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
цессе деления ЭСК, и инактивацию генов, запускающих процессы развития и дифференцировки (5).
Для проверки гипотезы значения Nanog для репрограм мирования ядра и приобретения клеткой свойств плюрипотен тности исследователи создавали гибриды нейральных ство ловых клеток (НСК) с ЭСК, оверэкспрессирующих ген Nanog (ЭСК N), сливая их In vitro. Причём избыточная экспрессия трансгена с Nanog в ЭСК не влияла на частоту слияния. Такой вариант слияния приводил к формированию гибридных коло ний, имеющих характеристики ЭСК. Оказалось, что частота формирования колоний была в 200 раз выше, чем в обычных НСК ЭСК гибридах и сравнима с таковой при слиянии ЭСК ЭСК. Клетки таких колоний теряли экспрессию генов НСК и не росли в «нейрональной» селективной среде. Колонии демон стрировали признаки репрограммирования НСК ядра и плю рипотентности экспрессию типичных для ЭСК генов, потерю ядерного маркёра НСК, спонтанную дифференцировку эмб риоидных телец в сокращающиеся миоциты и т.д. Слияние НСК (НСК N), избыточно продуцирующих Nanog, с обычными ЭСК приводило к возникновению эмбриональных колоний в 8 раз чаще, чем в контрольных слияниях НСК ЭСК.
Гиперэкспрессия Nanog в трансгенных ЭСК приводила так же к значительному увеличению выхода колоний при их слия нии с эмбриональными фибробластами и тимоцитами. Таким
А
