CC BY
66
Перспективы клеточных технологий в лечении сахарного диабета
В последние годы особое внимание уделяется поиску этиотропного и патогенетического лечения сахарного диабета 1-го типа (СД 1). Исследования направлены на поиски возможностей замещения утраченной функции островков поджелудочной железы (ПЖЖ), восстановления функции инсулярного аппарата, что может способствовать нормализации регуляции углеводного обмена. В качестве наиболее перспективных подходов рассматриваются трансплантация островков ПЖЖ или ее фрагментов и клеточные технологии. Первая пересадка ПЖЖ была выполнена под руководством W. Kelly в 1967 г. пациенту с диабетической нефропатией. В последующие годы при проведении подобных операций выживаемость больных и функция пересаженного органа оставались крайне низкими. С внедрением современных иммуносупрессивных средств реакций отторжения стало значительно меньше. Между тем до 2000 г. удачных пересадок ПЖЖ было всего около 8%.
В 2000 г. был разработан Эдмонтон-ский протокол трансплантации островков ПЖЖ. Основными особенностями протокола были методика выделения островков из ПЖЖ донора и состав комбинированной иммуносупрессивной терапии. С. Ricordi, один из ведущих ученых в области клеточной трансплантации, первым в мире осуществил серии трансплантаций донорских островков в печень больных СД и внедрил в клиническую практику метод, позволяющий изолировать большое количество клеток островков ПЖЖ человека. В соответствии с указанным протоколом для выделения островков из ПЖЖ донора использовали специальные энзимы. Был ликвидирован этап приготовления культуры островков ПЖЖ. После получения очищенных островков с высоким выходом клеток и до момента трансплантации проходило не более 2 ч. Клетки вводили в воротную вену через катетер, установленный под УЗ-контролем. Комбинация иммуносу-прессивных препаратов в Эдмонтонском протоколе включала сиролимус, такроли-мус и даклизумаб (моноклональные антитела к рецепторам ИЛ-2). Каждый больной получил в среднем 10 000 островков на 1 кг массы тела. Такое количество
островков ПЖЖ для каждого больного получали из 2-3 донорских трупных желез. Сиролимус считают наиболее современным иммуносупрессивным препаратом, играющим ключевую роль в приживлении трансплантированных клеток ПЖЖ. Его иммуносупрессив-ные свойства обусловлены прежде всего блокадой ИЛ-2-индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов. Сиролимус связывается (подобно такролимусу) с белком из семейства FK-связывающих. Затем этот комплекс связывается с протеинкиназой тТОЯ, в результате чего блокируются пути передачи сигнала, останавливающие клеточный цикл в фазе G-1. Главным преимуществом сиролимуса перед другими иммуносу-прессивными препаратами является его способность сохранять функцию почек наряду с поддержанием лучшей (без отторжения) выживаемости трансплантата. Для профилактики отторжения трансплантата предпочтительно использовать инъекционные лекарственные формы, содержащие наночастицы такролимуса, сиролимуса или их комбинацию, для создания подкожного или внутримышечного депо.
Использование инкапсулированных островков, получаемых с помощью современных нанотехнологий, а также ингибиторов каспаз позволяет избежать массовой гибели имплантированных р-клеток и предотвращает аллосенсиби-лизацию при трансплантации.
В исследование по Эдмонтонскому протоколу были включены больные в возрасте от 18 до 65 лет с длительностью СД более 5 лет, индексом массы тела не более 26 кг/м2 и неопределяемой концентрацией С-пептида в крови. Согласно предварительно опубликованным результатам исследования (9 центров из США, Канады, Европы), у 16 (44%) из 36 участников через год после трансплантации островков ПЖЖ отпала необходимость в экзогенно вводимом инсулине, у остальных 20 человек требовалось введение инсулина, но у половины из них при уменьшенной дозе отмечено улучшение контроля углеводного обмена. Случаев смерти, развития злокачественных опухолей или посттрансплантационных лимфопролифера-тивных состояний не было. Побочные эф-
фекты трансплантации, обусловленные иммуносупрессией, включали нейтропе-нию (5 случаев), пневмонию, стоматит, пиелонефрит. В 7 из 77 случаев инфузии островков ПЖЖ возникло интраперито-неальное кровотечение, из них в 4 случаях потребовалось переливание крови и в одном случае - лапаротомия.
Авторы проекта считают трансплантацию островковых клеток ПЖЖ альтернативным методом лечения пациентов с нестабильным течением СД, страдающих от частой тяжелой гипогликемии, у которых все попытки компенсировать СД с помощью инъекций инсулина потерпели неудачу.
Другое направление клеточных технологий, целью которого является восстановление массы р-клеток, - использование стволовых клеток. К стволовым относятся клетки, способные образовывать большое количество более дифференцированных клеток. Различают стволовые клетки эмбриональные (ЭСК), абортивные или фетальные, пуповинной крови и собственно аутологичные стволовые клетки - в основном из красного костного мозга (ККМ) самого пациента.
Альтернативным источником высоко-пролиферативных плюрипотентных клеток, заслуживающим внимания, являются ЭСК. Полученные из эмбриона на стадии бластоцисты, эти клетки in vitro обладают способностью к дифференциации во все три зародышевых листка.
Первый отчет об успешном получении инсулинпродуцирующих клеток из ЭСК мыши был опубликован в 2000 г. Используя систему клеточных ловушек, В. Soria и соавт. получили клоны инсу-линпродуцирующих клеток из недифференцированных ЭСК. Кластеры клеток из этих клонов были имплантированы в селезенку мышей со стрептозотоци-ниндуцированным СД. У этих животных снизились показатели гликемии и нормализовалась масса тела. Тем не менее число инсулинпозитивных клеток было чрезвычайно мало.
Исследования на человеческих ЭСК находятся в начальной стадии. При этом очевидно, что многие принципы, выявленные на ЭСК мышей, не могут быть прямо применимы к человеческим. Более того, в физиологических условиях р-клетки находятся в сложной структуре островка,
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
№4^ 2013
28
что позволяет контролировать инкрецию инсулина с помощью различных механизмов: нервного (например, симпатических нервных волокон), эндокринного (например, глюкагона) и паракринного (например, соматостатина).
Не только ЭСК, но и дифференцированные клетки разного происхождения, включая гепатоциты, клетки селезенки, ККМ и экзокринной части ПЖЖ, способны образовывать инсулин. Однако у дифференцированных клеток эта способность гораздо ниже, чем у ЭСК человека. Кроме того, такие клетки в типичных случаях не содержат других важных компонентов ß-клеток, необходимых для координированной инкреции инсулина, а именно - глюкокиназы и GLUT-2.
В ходе развития эмбриона как печень, так и вентральная закладка ПЖЖ формируются из одной популяции клеток внутри эндодермы эмбриона, отсюда правомерно предположить, что эпителиальные клетки ПЖЖ и печени могут происходить из единой клеточной популяции. Таким образом, стволовые клетки печени могут быть другим привлекательным источником ß-клеток.
L. Yang и соавт. описывают способность высокоочищенных овальных стволовых клеток взрослых крыс дифференцироваться в эндокринные клетки ПЖЖ при выращивании в среде с высоким содержанием глюкозы. Такие дифференцированные клетки способны самостоятельно объединяться в трехмерные островковоподобные кластеры клеток и снижать гликемию у NOD-мышей с комбинированным иммунодефицитом. Многообещающими оказались результаты, полученные при исследовании с использованием взрослых печеночных клеток человека. При применении гена PDX-1 и растворимых факторов был достигнут существенный успех по преобразованию таких клеток в функциональные инсулин-продуцирующие. Трансплантация этих клеток под почечную капсулу иммуноде-фицитных NOD-мышей обусловливала длительную нормализацию гликемии. Недавнее исследование под руководством D. Tang и соавт. продемонстрировало возможность репрограммирования стволовых WB-клеток печени в предшественники эндокринных клеток ПЖЖ с помощью постоянной экспрессии генов Pdx-1 и Pdx-1-VP 16. При трансплантации диабетическим мышам эти клетки становятся функциональными инсулин-продуцирующими и восстанавливают эугликемию.
Важным источником стволовых клеток у взрослых людей служат ККМ. В дополнение к способности поддерживать систему гемопоэза эти клетки могут дифференцироваться как в экто-, так и в эндодермальном направлении.
В исследовании A. lanus и соавт. сообщается, что 1,7-3,0% всех (ß-клеток у мышей-реципиентов были донорского происхождения и обнаруживались в течение 4-6 недель после трансплантации ККМ. С. Moriscot и соавт. также сообщают, что стволовые клетки ККМ человека способны in vitro дифференцироваться в инсулинсекретирующие клетки путем активации некоторых факторов транскрипции. D. Hess и соавт. описали эндогенную регенерацию ПЖЖ после трансплантации стволовых клеток ККМ. Обнаружено, что встраивание и приживление этих клеток к протокам и островкам ПЖЖ сопровождается быстрой пролиферацией клеток ПЖЖ реципиента и неогенезом инсулинпозитивных клеток. Считают, что трансплантированные стволовые клетки ККМ преобразуются в сосудистые эн-дотелиальные клетки, стимулирующие регенерацию ß-клеток в ПЖЖ из клеток реципиента путем выработки пока еще неизвестных факторов роста и дифференциации.
Можно добавить, что гемопоэтиче-ские стволовые клетки взрослых людей способны вызывать повторную устойчивость к аутоантигенам. Хотя гемопоэти-ческие стволовые клетки потенциально можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний, клиническое применение данного подхода ограничивают риски, связанные с аллогенной трансплантацией.
М. Haller и соавт. проводили клинические испытания эффективности применения пуповинной крови для лечения пациентов с СД 1. Окончательные статистические данные исследователи пока не приводят, но отмечают улучшение оцениваемых параметров (HbAlc, С-пептид, результаты теста со смешанной пищей, суточная потребность в инсулине, а также количество лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD25+). Подчеркнута также безопасность введения аутологичной пупо-винной крови.
Альтернативная восстановлению массы (ß-клеток у пациентов с СД стратегия состоит в индукции регенерации их из эндогенных источников. Доказано, что масса ß-клеток динамична и способна адаптивно изменяться в соответствии с различными потребностями организма в инсулине. У людей масса
р-клеток увеличивается примерно на 50% при ожирении; секреция инсулина и масса р-клеток возрастают также у беременных женщин. Аналогичным образом масса р-клеток увеличивается примерно в 2,5 раза к концу беременности у грызунов и быстро снижается в послеродовом периоде. Это происходит вследствие ускорения апоптоза и замедления митоза р-клеток в послеродовом периоде.
Продолжаются дебаты о механизмах поддержания массы р-клеток и численности их популяции у взрослых. Обсуждаются два возможных основных пути. С одной стороны, убедительно доказана возможность митотического деления предсушествующих р-клеток в ПЖЖ взрослых мышей, крыс и людей, доказано также образование у постнатальных мышей новых р-клеток исключительно путем митотического деления существующих. С другой стороны, тесную связь между экзокринными протоками и р-клетками считают доказательством того, что р-клетки могут возникать также из стволовых клеток эпителия протоков ПЖЖ. Однако надежный маркер существования предшественников р-клеток отсутствует, и в качестве суррогатного маркера часто используют процентное содержание образующих инсулин клеток протока. Обнаружено значительное увеличение числа таких клеток у грызунов после частичной резекции ПЖЖ, а также после длительной гипергликемии или лечения глюкагоноподобным пепти-дом-1 ^Р-1). Обнаружена совместная локализация р-клеток и экзокринных протоков в эмбриональной ткани человека и в препаратах ПЖЖ взрослых людей с СД и без такового. Несмотря на очевидную связь между протоко-вым эпителием и р-клетками, остается вероятность того, что этот феномен связан только с эмбриональным развитием ПЖЖ и что наблюдаемое увеличение числа инсулинпозитивных клеток в экзокринных протоках или вблизи них связано больше с увеличением массы р-клеток (без причинной связи с эпителием протока).
В то время как скорость образования новых р-клеток из экзокринных протоков и само их присутствие должны быть еще доказаны, сомнений в том, что деление р-клеток продолжается в течение всей жизни, нет. Однако частота репликации р-клеток в ПЖЖ взрослых людей очень низкая, что затрудняет ее определение. Низкая при нормальных условиях скорость деления р-клеток в случае зна-
№4^ 2013
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |29
чительной потребности в инсулине возрастает. У грызунов скорость деления р-клеток увеличивается в 5-10 раз после частичной резекции ПЖЖ, во время беременности, при хронической инфузии глюкозы и после лечения аналогами GLP-1. Это свидетельствует о значительной пластичности эндокринной части ПЖЖ у грызунов (в обычных условиях у взрослых крыс в сутки делится только 0,07% р-клеток).
В ряде недавних исследований высказано предположение, что р-клетки человека сохраняют способность к ре-
генерации даже на очень поздних этапах жизни.
Инсулинпродуцирующие клетки, полученные из стволовых клеток, и островковые клетки, полученные из ПЖЖ донора, имеют некоторое сходство при трансплантации в рамках терапии СД 1. При этом появляется надежда на адекватный контроль глюкозы крови, вследствие чего удается предотвратить развитие поздних осложнений СД, избежать которых при применяемой в настоящее время лекарственной
терапии практически невозможно. Эти клетки могут быть трансплантированы аналогичным способом, т.е. введены в воротную вену, а возникающие при их использовании проблемы одни и те же: иммунологические барьеры и рецидивы аутоиммунного процесса.
По материалам публикации Т. Никоновой, Е. Пекаревой, Ю. Филиппова // Врач. - 2010. - № 12. - С. 10-13.
ЭТО МШ№ ЗНАТЬ
УЧЕНЫЕ ВЫЯСНИЛИ, ПОЧЕМУ ЛЮДИ БОЛЕЮТ ДИАБЕТОМ
Ученые выяснили, почему люди болеют диабетом. Соответствующая статья опубликована в журнале «FASEB Journal».
В мире диабетом страдают 285 млн человек. Согласно последним прогнозам, к 2020 г. этот диагноз будет поставлен половине американцев. Поиск причин такого стремительного роста заболеваемости диабетом ведется давно, но ситуация все равно до конца не ясна. Отчасти это связано с тем, что сахарный диабет может быть результатом многих патологических механизмов. В постановлении ВОЗ под этим термином объединяются различные патологии, приводящие к хроническому повышению уровня глюкозы в крови. Основными факторами патогенеза считаются разрушение бета-клеток поджелудочной железы, вырабатывающих инсулин (диабет 1-го типа), и изменения молекулярной структуры самого инсулина или инсулиновых рецепторов, приводящие к снижению восприимчивости тканей к инсулину и нарушению утилизации глюкозы клетками (диабет 2-го типа). Вторая причина встречается чаще, и большинство пациентов страдают именно диабетом 2-го типа. Часто патология вызывается комплексом нарушений, что затрудняет диагностику и лечение заболевания.
Недавнее генетическое исследование американских ученых позволяет по-новому взглянуть на эту проблему. Вполне вероятно, что повышенная склонность к ожирению и диабет -следствие «ошибки» эволюции человека, в ходе которой в результате делеции (хромосомной перестройки) был утерян ген СМАН, и наши инсулиновые рецепторы стали хуже реагировать на инсулин. Этим наш вид отличается от всех остальных млекопитающих, у которых этот ген присутствует, а нарушения углеводного обмена развиваются редко.
В описываемой работе, опубликованной в «FASEB Journal», было впервые смоделировано влияние делеции гена СМАН на метаболизм мышей, в норме не страдающих ни ожирением, ни диабетом, сообщает «Информнаука».
Ген СМАН кодирует фермент (гидроксилазу цитидин-монофосфат-И-ацетилнейраминовой кислоты), участвующий в химической модификации остатков сиаловой кислоты. Из остатков построены углеводные цепи большинства глико-протеинов (белков, соединенных с углеводами). А от точного строения этих углеводных «антенн» зависит взаимодействие этих белков с другими молекулами, в том числе инсулино-вых рецепторов на поверхности клетки с инсулином. У всех млекопитающих, кроме человека, в формировании гликопро-
теинов участвуют две модификации сиаловой кислоты - аце-тилсиалат и гликолилсиалат. У люлей из-за отсутствия гена CMAH нарушен синтез гликолилсиалата. По-видимому, если инсулиновые рецепторы имеют оба варианта сиалатов, они эффективнее взаимодействуют с инсулином. В норме человеку «хватает» пониженной эффективности инсулиновых рецепторов, имеющих только ацетилсиалатные антенны. Но при неблагоприятных факторах - нарушении структуры инсулина, переедании и ожирении, снижении продукции инсулина в поджелудочной железе - этого становится недостаточно, и развивается диабет.
Для изучения физиологических последствий нарушения функции СМАН ученые вывели трансгенных мышей с делеци-ей этого гена и выкармливали их высококалорийной пищей. Оказалось, что у таких животных, как и у людей-диабетиков, ткани значительно хуже реагируют на инсулин, что уже является причиной нарушения метаболизма глюкозы. Но, кроме этого, у них еще и серьезно страдают сами бета-клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин. То есть влияние делеции не ограничивается только снижением эффективности рецептора, но и воздействует на саму систему продукции инсулина. Таким образом, отсутствие гликолилсиалата в углеводных цепях гликопротеинов на фоне высококалорийной диеты приводило у мышей к суммарному эффекту снижения синтеза инсулина и утраты восприимчивости клеток к нему. По мнению авторов, это может быть серьезным прорывом в понимании патогенеза диабета 2-го типа у людей, страдающих ожирением.
Поскольку остатки сиаловой кислоты, помимо инсулино-вых рецепторов, образуют углеводные антенны огромного количества других важнейших гликопротеинов в организме животного, отсутствие гликолилсиалата у человека может иметь глубокий эволюционный смысл.
«Это открытие много говорит нам о том, что идет не так при диабете, и где мишень для новых методов лечения, - говорит главный редактор «FASEB Journal» Джеральд Вейсман. - Но оно может оказаться важным и для понимания человеческой эволюции. Если отсутствие данного фермента уникально для людей, возможно, что оно могло дать нам какое-то преимущество в борьбе за выживание по сравнению с вымершими видами. Теперь задача состоит в том, чтобы найти преимущества утраты этого гена. Эволюция часто демонстрирует примеры того, как, потеряв что-то, мы можем выиграть в другом и сохранить наш вид».
// «Газета.Яи»
