CC BY
281
Перспективы использования генной и клеточной терапий для лечения мышечных дистрофий
А.Н. Сукач
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, отдел криобиохимии Харьков, Украина
В обзоре обсуждаются современные подходы к лечению мышечных дистрофий - гетерогенной группы нервномышечных заболеваний, которые проявляются в виде прогрессирующей слабости мышц, а также их частичной потери, что во многих случаях приводит к смерти. Эффективных медикаментозных способов лечения дистрофий в настоящее время нет. Однако существует несколько исследуемых терапевтических вариантов лечения мышечных дистрофий, включающих генную терапию и трансплантацию миогенных клеток-предшественников - клеточную терапию. В статье обсуждаются достижения и трудности на пути внедрения генной терапии в клиническую практику лечения мышечных дистрофий. Особое внимание уделено клеточной терапии, перспективному направлению регенеративной медицины, дающему надежду на излечение многих ранее не излечимых как наследственных, так и приобретенных заболеваний. Обсуждаются потенциальные источники соматических и эмбриональных стволовых/прогениторных клеток человека, которые могут использоваться как в качестве объектов приложения генно-инженерных методов, так и для клеточной терапии мышечных дистрофий. Обсуждаются проблемы, стоящие на пути успешного внедрения в клиническую практику лечения мышечных дистрофий стволовых/проге-ниторных клеток человека.
Ключевые слова: миодистрофия, стволовые клетки, генотерапия, клеточная терапия
Введение
Мышечная дистрофия - это группа наследственных заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей мышечной слабостью и потерей мышечных тканей. В настоящее время все дистрофии считаются заболеваниями неизлечимыми. В некоторых случаях болезнь приводит к смерти. Мышечные дистрофии различаются по группам поврежденных мышц, возрасту, при котором начинается болезнь, и скорости ее прогрессирования. Молекулярной причиной, лежащей в основе многих дистрофий, являются мутации в генах, кодирующих компоненты дистрофин-гликопротеинового комплекса, который связывает миофибрильный цитоскелет с внеклеточным матриксом [1-3].
Наиболее часто встречается и наиболее тяжело протекает мышечная дистрофия Дюшенна (МДД). МДД поражает мальчиков с частотой, равной 1 на 3500. Она проявляется в 1-2-летнем возрасте и характеризуется потерей независимого передвижения уже к 10 годам. Больные МДД, как правило, умирают в возрасте 15-25 лет от сердечной или легочной недостаточности вследствие атрофии дыхательных и сердечной мышц. Сходными симптомами и причиной возникновения характеризуется мышечная дистрофия Беккера (МДБ), однако протекает это заболевание в менее тяжелой форме. Обе болезни являются следствием мутаций в гене дистрофина, который локализован на коротком плече Х-хромосомы и является самым большим из известных ге-
нов человека. Он содержит 79 экзонов и составляет приблизительно 0,1 % всего генома человека [4-6]. Этот ген кодирует мышечный белок дистрофин с молекулярным весом 427 кДа, который является основным структурным белком, стабилизирующим сарколемму мышечного волокна. Своим Ы-концом он связывается с актином - главным компонентом внутриклеточного цитоскелета, а С-концом - с группой дистрофин ассоциированных дистро- и саркогликанов -белков сарколеммы, и через них - с основным белком внеклеточного матрикса - ламинином (рис. 1).
Рис. 1. Схема структурной роли дистрофина в стабилизации сарколеммы мышечного волокна
Мутации в гене дистрофина приводят к полному отсутствию или сильному снижению уровня дистрофина в случае МДД, либо к образованию частично функционального дистрофина в случае МДБ. Отсутствие или функциональная недостаточность этого белка приводит к нарушению целостности клеточной мембраны и является причиной запуска процессов дегенерации мышечного волокна. Результатом этого процесса является повышение проницаемости мембран и возникновение в них физических разрывов, что приводит к выходу ферментов из мышц в сыворотку крови [повышение в сыворотке крови активности креатинкиназы является биохимическим маркером МДД и МДБ). На начальных стадиях заболевания дегенерация мышечных волокон компенсируется активной регенерацией фибрилл, благодаря делению и слиянию мышечных сателлитных клеток. Однако с возрастом этот процесс становится менее эффективным, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости [7].
В настоящее время при отсутствии эффективных медикаментозных способов возлагаются большие надежды на использование для лечения мышечных дистрофий методов генной и клеточной терапий. Задачей этих способов лечения является восстановление синтеза дистрофина в мышечных клетках, что достигается либо путем встраивания в клетки нормального гена дистрофина, либо коррекцией мутаций в самом гене или в иРНК [8].
Генная терапия мышечных дистрофий
Основное различие генной и клеточной терапий заключается в способе доставки нормального гена дистрофина в мышечную клетку. Генно-инженерные подходы доставки гена используют, как правило, вирусные векторы. В экспериментах на мышах была продемонстрирована достаточно эффективная и долговременная трансфекция скелетных и сердечной мышц, а также мышц диафрагмы после введения аденовирусных, ретровирусных или лентивирусных векторов, доставляющих функциональный ген дистрофина или минидистрофина [9-12].
Вместе с тем, использование вирусных носителей, особенно в экспериментах in vivo, наталкивается на существенные методические трудности. К ним, например, относятся недостаточная пакующая способность ретровирусов и необходимость наличия клеток-хелперов. Наибольшим препятствием использования вирусных векторов для доставки генетических конструкций является выраженный иммунный ответ реципиента на вирусные антигены. Несмотря на огромный объем работ по модификации генома вируса-носителя и сокращению его размера до минимально возможного, иммунный ответ, тем не менее, сохраняется и делает бессмысленным повторное введение генно-инженерных конструкций. В результате оказывается невозможно достичь такого уровня трансфекции, при котором наступает эффект лечения. Большинство исследователей полагает, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20% [по последним данным - даже 40%) всех мышечных волокон, включая мышцы сердца и диафрагмы. При этом основными критериями эффективности трансфекции являются появление дистрофин-положительных мышечных волокон, нормализация уровня креатинкиназы в сыворотке крови, изменение физиологических параметров [силы мышц и др.).
Существуют также невирусные способы доставки к ДНК гена дистрофина, которые включают в себя баллистическую трансфекцию, методы электропорации [электрошока), введение генетических конструкций в составе липосом, либо упакованных с помощью олигопептидов, молекулярных конъюгатов или полимерных носителей [9, 13, 14]. Эти способы не вызывают такого иммунного ответа, как вирусные векторы, однако способность к трансформации у большинства из них ниже.
Несмотря на довольно интенсивные исследования на животных моделях, до настоящего времени клинические испытания генно-инженерных методов лечения дистрофий на больных людях практически не проводились.
Следует также упомянуть о существовании еще одного подхода к лечению дистрофий - активации синтеза в мышечных клетках репрессированного в процессе онтогенеза аутосомного гомолога гена дистрофина - гена утрофина [15]. Известно, что в эмбриогенезе человека приблизительно до семи недель развития дистрофин не экспрессируется, и его функцию в мышцах выполняет белок утрофин [16]. Между 7 и 19 неделями развития экспрессируются оба белка, после чего происходит замещение мышечного утрофина на дистрофин. Эти белки похожи своими N- и С-концевыми доменами, играющими решающую роль в функции дистрофи-на, тогда как функционально малозначимый центральный rod
domain присутствует в утрофине в сильно укороченном виде. Если достичь дерепрессии гена утрофина у больных мышечной дистрофией, то продукт его экспрессии белок утрофин мог бы компенсировать недостаток дистрофина в мышцах [17]. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что in vivo трансфекция mdx мышей геном утрофина приводит к экспрессии этого белка в скелетных мышцах и диафрагме [18-20]. Эти результаты указывают на принципиальную возможность коррекции недостатка дистрофина в мышечных волокнах с помощью утрофина.
Клеточная терапия мышечных дистрофий
Перспективным направлением клеточной терапии мышечных дистрофий представляется трансплантация как стволовых клеток [СК), способных к самовозобновлению и дифференциации во множество клеточных линий организма, так и миогенных прогениторных клеток. При этом рассматриваются возможности использования для трансплантации как взрослых, так и эмбриональных стволовых/прогенитор-ных клеток.
«Взрослые» стволовые клетки. «Взрослые» СК впервые были обнаружены в строме костного мозга [КМ) советским ученым А.Я. Фриденштейном [21]. В настоящее время помимо КМ [22-24] СК обнаружены в большинстве тканей и органов взрослых организмов, включая центральную нервную систему [25-27], кожу [28], сердечную мышцу [29] и скелетную мышцу [30-34]. Для клеточной терапии мышечных дистрофий рассматривается перспектива использования взрослых СК КМ, различных «взрослых» мышечных предшественников, а также клеток пуповинной крови.
Стволовые клетки костного мозга. В КМ, основываясь на адгезивных свойствах in vitro, различают два типа СК: адгезивные стромальные мезенхимальные СК и неадгезивные гемопоэтические СК. Мезенхимальные СК могут дифференцироваться в клетки кости, хряща, жировой ткани и мышц как in vitro, так и in vivo. Миогенные клетки могут быть получены in vitro при действии на адгезивные мезенхимальные клетки 5-азацитидина (5-azacytidine), который активирует мышечный переключатель MyoD [35]. Субпопуляция мезенхимальных СК также была идентифицирована в мо-нонуклеарных клетках КМ - это CD45+/glycophorin+ клетки [36]. После ex vivo экспансии эти мультипотентные взрослые прогениторные клетки могут быть трансплантированы в необлученный организм мышей, где они приживаются и развиваются в гемопоэтические линии, эпителиальные клетки, клетки печени, легких, кишечного эпителия. При введении в раннюю бластоцисту эти клетки дифференцировались в мышечные. И хотя их способность становиться предшественниками скелетной мышцы при внутривенном введении продемонстрирована не была, свойство этих мультипотент-ных взрослых прогениторных клеток активно пролиферировать без очевидного старения и потери мультипотенции делает их привлекательным кандидатом для клеточной терапии.
Более перспективными для клеточной терапии мышечных дистрофий являются неадгезивные гемопоэтические СК, которые, помимо гемопоэза, участвуют в формировании нервной ткани [37, 38], печени [39], сердечной мышцы [29] и скелетных мышц. Было показано, что эти миогенные прогениторы могут мигрировать и участвовать в регенерации поврежденной мышечной ткани после трансплантации КМ [40]. В этом исследовании также было продемонстрировано, что в репарации поврежденных кардиотоксином мышечных клеток могут участвовать не только клетки КМ, введенные непосредственно в мышцу, но также и введенные внутривенно. В обоих случаях донорские клетки сливались с мышечными волокнами реципиента. Эксперименты по внутривенному введению донорских клеток КМ mdx мышам
также продемонстрировали, что трансплантированные клетки попадают из кровеносной системы в мышечную ткань и сливаются с волокнами дистрофических мышц mdx мышей [30, 41, 42]. Однако, во всех этих экспериментах репарация дистрофических мышц трансплантированными клетками КМ никогда не превышала 1 %. Это можно объяснить как слабым захватом клеток КМ, так и неспособностью стволовых клеток КМ адекватно реагировать на клеточные сигналы реципиента.
Несмотря на то, что использование клеток КМ для лечения модели МДД у животных оказалось неэффективным, существует мнение некоторых исследователей, что трансплантация КМ для лечения мышечной дистрофии у людей будет более эффективной. Способность СК КМ человека участвовать в репарации мышечных волокон была продемонстрирована ЭиББОп! с соавторами [43]. Они представили иммуногистохимический и ПБИ анализ мышц мальчика, которому в возрасте 1 года для лечения тяжелого Х-свя-занного иммунодефицита, диагностированного вместе с МДД, была проведена трансплантация КМ. При этом, в 12 лет МДД имела умеренное протекание, а в мышцах больного через 13 лет после трансплантации было обнаружено присутствие диплоидных донорских ядер (0,5-0,9% мышечных волокон), что указывает на способность экзогенных клеток КМ человека сливаться со скелетными мышечными волокнами реципиента и сохраняться на протяжении, по крайней мере, 13 лет.
Таким образом, несмотря на возможность взрослых ге-мопоэтических СК сливаться с дистрофическими скелетными мышечными волокнами, частота таких случаев слишком низка для того, чтобы быть эффективным способом лечения мышечных дистрофий.
Клетки пуповинной крови. Очень близки по свойствам клеткам КМ клетки пуповинной крови. В их составе также присутствуют как кроветворные, так и мезенхимальные СК [44]. Применение этих клеток лишено морально-этических ограничений, их легко получать, количество СК в пуповинной крови значительно больше, пролиферативный потенциал выше, они не отягощены грузом генетических мутаций, накопленных взрослыми соматическими СК КМ. Клетки пуповинной крови менее иммунологически зрелые. Эксперименты, проведенные на мышах [45], продемонстрировали, что миогенные прогениторы (предшественники) присутствуют в пуповинной крови человека и способны мигрировать и дифференцироваться в миоциты. Однако, как и в случае СК КМ, до сих пор отсутствуют доказательства эффективного терапевтического действия клеток пуповинной крови при их использовании для лечения мышечных дистрофий. Как и для всех остальных потенциальных источников клеток для лечения мышечных дистрофий, существуют методические проблемы, связанные с выделением из пуповинной крови популяции миогенных предшественников и их дальнейшей экспансией в условиях п VI'Ыо.
Мышечные стволовые клетки. Первыми идентифицированными «взрослыми» мышечными прогениторными клетками были сателлитные клетки (СатК) мышц - коммити-рованные, покоящиеся мышечные предшественники, которые располагаются между сарколеммой мышечных волокон и их базальной мембраной [46, 47]. Активированные СатК делятся на дочерние клетки и дифференцируются в одноядерные миобласты, которые затем либо сливаются между собой и образуют новые мышечные волокна, либо сливаются с существующими мышечными волокнами [48, 49] (рис. 2). Результаты исследований роста мышц и их регенерации дают основание предположить, что активированные СатК, возможно, пополняют свой пул путем асимметричного деления [50]. Мышечные СатК возникают в процессе позднего
эмбрионального миогенеза и, вероятно, отличаются по происхождению от других миогенных предшественников. Есть несколько гипотез, объясняющих их происхождение. В частности, было обнаружено, что СатК развиваются из спинной аорты эмбрионов c-met-/- мышей [51]. Скорее всего, мышечные СатК представляют собой субпопуляцию не дифференцировавшихся в процессе эмбрионального миогенеза миобластов, которые остались связанными с поверхностью развивающихся мышечных волокон [см. рис. 2). СатК гете-рогенны по экспрессии CD34 и myf-5. Также существует популяция этих клеток, не экспрессирующая никаких маркеров [52]. Сразу после активации СатК быстро вступают в клеточный цикл и проходят миогенез, аналогичный эмбриональной миогенной программе. In vivo активированные СатК ограничены мышечной линией, однако in vitro помимо мышц показано их участие в адипо- и остеогенезе [53].
Рис. 2. Сигнальные факторы и клеточные события, вовлеченные в эмбриональное формирование скелетной мышцы. РахЗ экспрессия в клетках-предшественниках вносит вклад в миогенную экспансию клеток. После индукции первичными миогенными факторами Му(5 и/или Муой мезодермальные сомитные клетки коммитируются в миогенные линии (миобласты). Позже действие вторичных миогенных регуляторных факторов (миогенин и МЙР4) индуцирует окончательную дифференциацию миобластов в миоциты, которые в дальнейшем сливаются, образуя многоядерные мышечные волокна. Во время более поздней фазы эмбрионального миогенеза субпопуляция миобластов, происходящая из сателлитных клеток, сливается с существующими мышечными волокнами, что позволяет им расти. Некоторые сателлитные клетки остаются связанными с мышечными волокнами в покоящемся недифференцированном состоянии. Эмбриональное происхождение сателлитных клеток остается еще не доказанным, однако Рах7 экспрессия является необходимой для спецификации/экспансии популяции сателлитных клеток [54]
СаЖ были одним из первых типов клеток, используемых в клеточной терапии мышечных дистрофий. СатК которые выращиваются in vitro, представляют собой мононуклеар-ные клетки, коммитированные по миогенному пути [миоб-ласты). Эксперименты по внутримышечной трансплантации миобластов, изолированных из мышей дикого типа, mdx мышам продемонстрировали экспрессию дистрофина in vivo [55, 56]. Эти исследования послужили основанием проведения клинических испытаний миобластов с целью лечения MДД [56-60]. Для этого донорские СаЖ были изолированы в результате биопсии мышц у близких родственников больных детей. Затем эти клетки выращивались в условиях
in vitro, после чего 80-100 миллионов донорских миобластов было введено в мышцы детей путем множественных инъекций. Контрлатеральные мышцы были инъецированы как контроль плацебо. Однако, иммуногистохимические и RT-PCR исследования мышц больных, которые проводились на протяжении года, показали, что трансплантация миобластов таким способом была неэффективна. Несмотря на то, что пересаженные миобласты действительно сохранялись и продуцировали дистрофин в мышечных волокнах пациентов с МДД, частота, при которой это встречалось, была очень низкой (<1%). Поэтому неудивительно, что не было зарегистрировано никакого функционального или клинического выздоровления. Эксперименты на мышах по использованию миобластов для лечения МДД также показали, что уже через 24 часа после трансплантации 90% гетерологичных миобластов погибает или исчезает из места трансплантации, 5% находятся в покоящемся состоянии, 5% сливаются с пораженными мышечными волокнами, но только в половине из них (2,5%) наблюдается синтез дистрофина [62, 63]. При этом трансплантация миобластов характеризуется минимальной миграцией клеток после инъекции и иммунным отторжением [64, 65], которое является одной из причин низкой степени выживания клеток. После внутримышечной инъекции пациентам с МДД высокого количества миобластов, полученных у здоровых близких родственников, правильно подобранная иммуносупрессия позволяет уже через месяц увеличить количество мышечных волокон, синтезирующих дистрофин до 10% [66]. Эти исследования указывают, с одной стороны, на важность использования адекватной иммуносупрессии при трансплантации миобластов, а с другой - на необходимость оптимизации метода трансплантации клеток, что включает наряду с определением оптимального количества клеток, частоту их введения и место трансплантации.
Следует заметить, что, по мнению некоторых исследователей, способность мышцы восстанавливаться после повреждения является заключительным этапом миогенеза, начало которого закладывается в процессе эмбриогенеза и включает в себя стадию индукции миогенных регуляторных факторов и позиционных стимулов, диктующих направление клеточной дифференциации, пролиферацию и окончательную дифференциацию во взрослую мышцу [67], что указывает на ограниченный миогенный потенциал мышечных СатК. Поэтому, несмотря на достаточно активные исследования, направленные на оптимизацию метода трансплантации миобластов для лечения мышечных дистрофий, многие исследователи все же склоняются к использованию для этих целей более примитивных предшественников мышечных клеток. Они справедливо считают, что эти миогенные СК будут не только сливаться с существующими мышечными волокнами реципиента, но также будут способны пролиферировать, дифференцироваться в нужном направлении и формировать новые миосимпласты. Как полагают, более примитивными мышечными предшественниками по сравнению с СатК являются мультипотентные мышечные стволовые клетки [ММСК] [34, 68-70], мышечные SP клетки [30, 31 ], мышечные СК ге-мопоэтического происхождения, и СК мышц, устойчивые к большим дозам радиации.
Мультипотентные мышечные стволовые клетки. ММСК экспрессируют как миогенные маркеры [положительные на desmin, myogenin и myoD), так и маркеры стволовых клеток [flk-1, sca-1, CD34). Они не экспрессируют c-kit, CD45 или другие маркеры клеток крови. ММСК могут быть экс-пандированы in vitro на протяжении более 30 пассажей без изменения кариотипа, могут быть генетически модифицированы для экспрессии минидистрофина и р-галактозидазы, могут дифференцироваться в клетки мышечной, нервной и эндотелиальной тканей in vitro и in vivo [70]. ММСК обладают
способностью заселять КМ и восстанавливать кроветворение у смертельно облученных mdx мышей при введении внутривенно. Они способны попадать в дистрофические мышцы и участвовать в их регенерации [34]. Таким образом, клоны ММСК могут быть экспандированы с сохранением миогенного потенциала после гематопоэтической дифференциации. Также была показана способность этих клеток мигрировать из кровотока в поврежденные мышцы после их внутриартериальной инъекции mdx мышам [71].
SP (side population) клетки. Другой субпопуляцией взрослых мышечных предшественников, обнаруженных в мышцах и в КМ, являются так называемые SP [side population) клетки [30, 31]. Эта популяция мультипотентных клеток характеризуется тем, что они активно вытесняют краситель Hoechst 33342, благодаря активности на клеточной поверхности ABC переносчика ABCG2 [72, 73]. Мышечные SP клетки негативны на c-kit и CD45. Значительная часть SP клеток положительна на CD34 [30]. При внутривенной трансплантации смертельно облученным самкам mdx мышей мышечные SP клетки способны восстанавливать гемо-поэз [30]. При этом на 17-28 день после трансплантации донор-производные [Y+ ядра) дистрофин-положительные мышечные волокна были найдены у 9% волокон mdx мышей. Следует заметить, что мышечные SP клетки отличаются еще и тем, что могут быть изолированы из мышц Pax 7-дефицитных мышей, которые не имеют миогенных СатК [74], что указывает на уникальность этой популяции клеток. При этом нефракционированные мышечные SP клетки могут образовывать как скелетные мышечные волокна, так и СатК после внутримышечной инъекции. Также они способны становиться мышечными клетками при совместном культивировании с первичными миобластами [33].
СК мышц, устойчивые к большим дозам радиации. Известна также популяция клеток, которые вносят вклад в репарацию мышц после больших доз радиации [32]. Облучение большими дозами [18 Gy) блокирует регенерацию в мышцах mdx мышей, ингибируя митоз в пролиферирующих миобластных/сателлитных клетках. Однако дальнейшее введение myotoxin notexin [разрушает зрелые мышечные волокна, но не затрагивает мононуклеарные клетки, включая сателлитные) приводит к регенерации мышц. Анализ этого явления у нормальных и дистрофических мышей после облучения показал высокий уровень пролиферации мышечных клеток-предшественников. Они, вероятно, являются резидентными стволовыми клетками.
Следует заметить, что перспектива использования взрослых СК для клеточной терапии вообще и мышечных дистрофий в частности имеет достаточно много критиков. В частности, многими исследователями подвергается серьезным сомнениям сама возможность взрослых СК к трансдифференциации [75-77]. Так, исследование, проведенное группой Т. Брауна, противоречит мнению о том, что взрослые мезенхимальные СК КМ или локальные СК участвуют в восстановлении сердечных и скелетных мышц путем трансдифференциации в мышечные клетки. Исследователи продемонстрировали, что все случаи, в которых функциональные клетки скелетной мышцы вырастали из мезенхимальных СК, на самом деле основывались на слиянии мезенхимальных СК с уже дифференцированными мышечными клетками [77]. Сливаясь с клетками восстанавливаемой ткани, эти клетки, скорее всего, только имитируют механизм трансдифференциации, что указывает на их ограниченную способность восстанавливать поврежденные мышцы. Следует отметить, что в процессе постнатального развития наблюдается снижение способности СК к хоумингу [78]. Некоторые исследователи полагают, что в ДНК взрослых СК накапливаются мутации, и ее информация постепенно деградирует. Другие
указывают на возможность накопления мутаций в ДНК митохондрий, в которых отсутствует механизм восстановления. Существует также мнение о том, что СК стареют и утрачивают способность к самовозобновлению. Культивирование СК in vitro проводится в условиях, сильно отличающихся от условий in vivo, что может приводить к существенным изменениям как генетической программы этих клеток, так и их реакции на влияние внешних факторов и регуляторов [подобных ростовым факторам и цитокинам). Все эти изменения, происходящие как в процессе постнатального развития СК, так и в процессе культивирования in vitro, могут, в конечном итоге, приводить к ограничению их способности к миграции, самовозобновлению, пролиферации, дифференциации, а также к неадекватной реакции на клеточные сигналы микроокружения в организме реципиента. К тому же в настоящее время нет эффективных методов выращивания «взрослых» СК - в культуре они растут чрезвычайно медленно. Одним из препятствий клинического применения «взрослых» СК также является малочисленность их популяции в тканях и трудности выделения.
Эмбриональные миогенные предшественники
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Источником мышечных прогениторов для клеточной терапии мышечных дистрофий могут также служить ЭСК - клетки внутренней клеточной массы бластоцисты человека [79, 80]. Они тоти-потентны и характеризуются свойством самовозобновления. Эти клетки могут быть экспандированы in vitro на протяжении длительного периода времени, оставаясь в недифференцированном состоянии. Теоретически, ЭСК являются неограниченным источником клеток, способных дифференцироваться во все типы клеток, включая и мышечные [81]. Однако, длительная экспансия ЭСК достаточно сложная и длительная процедура, требующая постоянного присутствия стромальных [фидерных) клеток, дорогостоящих цитокинов [EGF, FGF, SCF, LIF, IL-6,), а также своевременной дезагрегации и пересева клеток. Невыполнение хотя бы одного из перечисленных условий приводит к уменьшению СК в культуре за счет их дифференциации или гибели. С возрастанием срока культивирования ЭСК возрастает вероятность возникновения генетических мутаций, которые будут накапливаться в последующих клеточных поколениях. Помимо этого, в настоящий момент нет точного понимания молекулярных путей, лежащих в основе формирования органов, и не определены факторы, которые необходимы и достаточны для формирования специфических типов клеток. В случае клинического применения ЭСК существует потенциальная опасность образования нежелательных клеток, тканей и даже формирования тератом. Эта опасность проистекает, главным образом, из плюрипотентности ЭСК, и их способности образовывать все клетки эктодермы, энтодермы и мезодермы. Для широкого применения ЭСК в клинической практике предстоит решить ряд достаточно сложных задач: разработать методы, позволяющие получать достаточное количество направленно дифференцированных в мышечные предшественники ЭСК, а также способы устранения плю-рипотентных и частично дифференцированных клеток, которые могут вносить вклад в озлокачествление тканей.
ЭСК цитогибридов. Другим источником мышечных предшественников могут быть ЭСК, полученные в результате межвидовой цитогибридизации [82], которая позволяет получать гибридные бластоцисты [например, человека и свиньи, человека и коровы). Межвидовая цитогибридизация позволяет получать ЭСК с геномом человека без использования фетальных тканей человека. Этот метод теоретически позволяет получать нелимитированные количества ЭСК с геномом реципиента и далее их использовать для трансплантации без
риска иммунных осложнений, избавляя при этом от морально-этических проблем. Однако существует ряд научных проблем, стоящих на пути терапевтического использования цитогибридов. Во первых, стареющие пост-митотические клетки характеризуются накоплением генетических ошибок и мутаций. Большой проблемой также является относительно неэффективное перепрограммирование донорского ядра обратно в плюрипотентное состояние [83].
Таким образом, СК, полученные в результате межвидовой гибридизации эмбрионов, могут характеризоваться большим количеством мутаций и ошибок [не говоря уже о наследственных заболеваниях), что способно лишить их эффективности, или, хуже того, стать причиной их онкологической трансформации. Необходимо заметить, что правовые и этические аспекты в области межвидовой гибридизации эмбрионов все еще остаются непроработанными.
Мышечные предшественники эмбрионов ранних сроков развития. Потенциальным источником клеток для клеточной терапии мышечных дистрофий являются миоген-ные предшественники, полученные из абортивных эмбрионов человека ранних сроков гестации. Эти клетки обладают существенным недостатком, ограничивающим их клиническое использование - это морально-этические проблемы, связанные с их получением. Наряду с этим, они имеют достаточно много преимуществ перед постнатальными миоген-ными предшественниками. Во-первых, миогенные клетки эмбрионов человека включают в себя, помимо окончательно дифференцированных, вышедших из клеточного цикла и активно формирующих мышечные волокна миоцитов, мезо-дермальные СК и коммитированные в мышечном направлении миобласты, которые характеризуются высокой степенью самовозобновления, пролиферации, миграции и пластичности [см. рис. 2). Во-вторых, миогенные предшественники эмбрионов человека представляют собой достаточно гетерогенную по происхождению клеточную популяцию, что позволяет надеяться на их способность формировать в организме реципиента не только волокна скелетных мышц, но также и клетки, например, сердечной поперечно-полосатой мышечной ткани. В-третьих, эмбрионы человека ранних сроков гестации характеризуются практически полным отсутствием на клеточной поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости. Это определяет их низкую иммуноген-ность после трансплантации. И хотя, на наш взгляд, нельзя полностью отказываться от иммуносупрессии при трансплантации этих клеток, она может быть минимальной как по времени, так и по интенсивности. В-четвертых, эмбриональные стволовые и прогениторные клетки характеризуются отсутствием приобретенных генетических нарушений.
Мезангиобласты - это популяция мезодермальных стволовых клеток, выстилающих поверхность некоторых эмбриональных сосудов [51, 84]. Эти клетки являются еще одним потенциальным источником взрослых СК для клеточной терапии мышечных дистрофий. Они экспрессируют маркеры ангиобластов, такие как Sca-1, Flk-1, и CD34, а также гены, типичные для мезодермы, включая рецепторы и сигнальные молекулы классических индукторов мезодермы, такие, как BMP, Wnt и Notch. Мезангиобласты могут быть экспандированы in vitro, при действии на них цитокинов или при сокультивировании с другими клетками мезодермального происхождения [84] способны дифференцироваться в большинство тканей, имеющих мезодермальное происхождение, включая кровь, хрящ, кость, гладкие скелетные и сердечные мышцы. Мезангиобласты обладают удивительной способностью к хоумингу в поврежденную мышечную ткань и активно восстанавливают поврежденные мышцы [85-87]. Внутриар-териальное введение мезангиобластов, меченных ленти-ви-русным вектором, экспрессирующим a-саркогликан, мышам
с моделью тазово-поясничной мышечной дистрофии [85] продемонстрировало, что они накапливаются в капиллярах и затем мигрируют в области мышечной недостаточности или воспаления, и, в конечном итоге, исправляют морфологически и функционально дистрофические мышцы [85]. Многократные внутриартериальные трансплантации мезангиобластов привели к образованию через 4 месяца после введения более чем 50% положительных на а-саркогликан мышечных волокон. Помимо нового потенциального источника СК для лечения мышечных дистрофий, эти исследования показали перспективность внутриартериального способа введения клеток при клеточной терапии.
Таким образом, следует надеяться, что СК и мышечные клетки-предшественники эмбрионов человека ранних сроков гестации при попадании в поврежденные мышечные ткани реципиента будут адекватно реагировать на клеточные сигналы микроокружения, активно пролиферировать и дифференцироваться, формируя здоровые вторичные мышечные волокна, а также сливаться с уже существующими волокнами, способствуя их репарации.
Заключение
Исходя из литературных данных, можно заключить, что в настоящее время наблюдается параллельное развитие двух очень перспективных подходов лечения мышечных дистрофий - генной и клеточной терапий.
Генная терапия имеет хорошие перспективы для лечения широкого спектра заболеваний, в том числе и мышечных дистрофий. Однако ее эффективность в настоящее время находится на достаточно низком уровне. При этом, основной проблемой генной терапии является проблема доставки определенного гена в нужную клетку. Можно надеяться, что решить эту проблему помогут исследования, направленные на использование в качестве «переносчика» необходимых генов стволовых/прогениторных клеток человека. Следует полагать, что успехи в изучении СК позволят выйти технологиям генной терапии на новый уровень, которых обеспечит качественный скачок в лечении многих наследственных заболеваний человека, в том числе и мышечных дистрофий.
На сегодняшний день существует достаточно обширный круг потенциальных источников соматических или эмбриональных стволовых/прогениторных клеток человека, которые могут использоваться как в качестве объектов приложения генно-инженерных методов, так и для клеточной терапии мышечных дистрофий. Однако для их широкого внедрения
в клиническую практику необходимо решить ряд проблем как морально-этического [касательно эмбриональных клеток человека), так и методического плана.
Для успешного применения методов клеточной терапии с целью лечения мышечных дистрофий необходимо:
1. Определить оптимальный тип донорских клеток, которые:
а) являются ранними мышечными предшественниками и обладают способностью к образованию как мышечных волокон, так и клеток сердечной мышечной ткани;
б) обладают высокой степенью пролиферации, пластичности и способностью к самовозобновлению;
в) способны адекватно реагировать на сигналы микроокружения реципиента;
г) способны направленно мигрировать в мышечную ткань и легко в нее встраиваться [интегрироваться);
д) обладают низкой степенью иммунореактивности [иммунологически толерантны) и хорошо приживаются в тканях реципиента.
2. Разработать эффективные, максимально приближающиеся к условиям in vivo методы культивирования и экспансии клеток in vitro.
3. Определить наиболее предпочтительный способ введения клеток пациенту [внутримышечный, внутривенный либо внутриартериальный).
4. Определить оптимальное количество клеток для одноразовой трансплантации и оптимальную частоту трансплантаций.
5. Установить молекулярные механизмы, способствующие миграции донорских клеток в поврежденные мышечные ткани, их включению в эти ткани и эффективному приживлению и функционированию.
6. Установить оптимальные терапевтические процедуры, направленные на максимальное снижение риска отторжения трансплантированных клеток.
Решение этих вопросов помимо определения оптимального источника клеток и стратегии их введения в каждом конкретном случае, позволит определить проведение оптимальных терапевтических процедур до и после трансплантации клеток. Это, с одной стороны, позволит избежать отторжения трансплантированных клеток [иммуносупрессия), а с другой - обеспечит эффективную направленную миграцию клеток с их последующей интеграцией в необходимые ткани и их трофическую поддержку [введение определенных ростовых факторов, цитокинов, хемокинов).
ЛИТЕРАТУРА:
1. O'Brien K.F., Kunkel LM Dystrophin and muscular dystrophy: past, present, and future. Mol. Genet. Metab. 2001; 74: 75-88.
2. Durbeej М., Campbell K.P. Muscular dystrophies involving the dystrophinglycoprotein complex: an overview of current mouse models. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: 349-61.
3. Ehmsen J., Poon E., Davies K. The dystrophin-associated protein complex. J. Cell Sci. 2002; 115: 2801 - 3.
4. Coffey A.J., Roberts R.G., Green E.D. et al. Construction of a 2.6-МЬ contig in yeast artificial chromosomes spanning the human dystrophin gene using an STS-based approach. Genomics 1992; 12: 474-84.
5. Monaco A.P., Walker A.P., Millwood I. et al. A yeast artificial chromosome contig containing the complete Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics 1992; 12: 465-73.
6. Roberts R.G., Coffey A.J., Bobrow М, Bentley D.R. Exon structure of the human dystrophin gene. Genomics 1993; 16: 536-8.
7. Partridge T.A. Models of dystrophinopathy, pathological mechanisms and assessment of therapies in Dystrophin, Gene , Protein and Cell Biology [Brown S.C., Lucy J.A. eds.), Cambridge, U.K. ; New York: Cambridge University Press; 1997; 310-31.
8. Wilton S.D., Lloyd F., Carville K. et al. Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul. Disord. 1999; 9 [5): 330-8
9. Fassati A., Murphy S., Dickson, G. Gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Adv. Genet. 1997; 35: 117-53.
10. Howell J.M., Lochmuller H., O'Hara A. et al. High-level dystrophin expression after adenovirus-mediated dystrophin minigene transfer to skeletal muscle of dystrophic dogs: prolongation of expression with immunosuppression. Human Gene Ther. 199В; 9: 629.
11. Wang B., Li J., Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 13714- 9.
12. Harper S.Q., Hauser M.A., Dellorusso C. et al. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nat. Med. 2002; В: 253-61.
13. Зеленин А.В. , Kaйгоpодов В.А., Прасолов В.С. Г енная терапия сегодня и завтра. Mол. биол. 199В; 32: 219-2В.
14. Баранов В.С. Генная терапия - медицина 21 века. Соросовский Образовательный Журнал 1999; 3: 63-В.
15. Love D.R., Hill D.F., Dickson G. et al. An autosomal transcript in skeletal muscle with homology to dystrophin. Nature 19В9; 339: 55-В.
1 6. Clerk A., Morris G.E., Dubowitz V. et al. Dystrophin-related protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal skeletal muscle. Histochem. J. 1993; 25: 554-61.
17. Tinsley J.M., Davies K.E. Utrophin: a potential replacement for dystrophin? Neuromuscular Disorders 1993; 3: 537-9.
1В. Tinsley J.M., Potter A.C., Phelps S.R. et al. Amelioration of the dystrophic phenotype of mdx mice using a truncated utrophin transgene. Nature 1996; ЗВ4: 349-53.
19. Rafael J.A., Tinsley J.M., Potter A.C. et al. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice.
Nat. Genet. 1998; 19: 79-82.
20. Gilbert R., Nalbanoglu J., Tinsley J.M. et al. Efficient utrophin expression following adenovirus gene transfer in dystrophic muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 242: 244-7.
21. Friedenstein A., Owen M. Stromal stem cells: marrow derived osteogenic progenitors. CIBA Found. Symp. 1988; 136: 42-60.
22. Anderson D.J., Gage F.H., Weissman I.L. Can stem cells cross lineage boundaries? Nat. Med. 2001; 7: 393-5.
23. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? Cell 2001; 105: 829-41.
24. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I. et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single BMderived stem cell. Cell 2001; 105: 369-77.
25. Bjornson C.R., Rietze R.L., Reynolds B.A. et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 1999; 283: 534-7.
26. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J. et al. Generalized potential of adult neural stem cells. Science 2000; 288: 1660-3.
27. Rietze R.L., Valcanis H., Brooker G.F. et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature 2001; 412: 736-39.
28. Alonso L., Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100 [Suppl. 1): 11830-5.
29. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763-76.
30. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C. et al.: Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 1999; 401: 390-4.
31. Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 14482-6.
32. Heslop L., Morgan J.E., Partridge T.A. Evidence for a myogenic stem cell that is exhausted in dystrophic muscle. J. Cell Sci. 2000; 113[Pt 12): 2299-308.
33. Asakura A., Seale P., Girgis-Gabardo A., Rudnicki M.A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 2002; 159: 123-34.
34. Cao B., Zheng B., Jankowski R.J. et al. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat. Cell Biol. 2003; 5[7): 640-6.
35. Wakitani S., Saito T., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat BM mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 1995; 18: 1417-26.
36. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41 -49.
37. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 2000; 290: 1775-9.
38. Mezey E., Chandross K.J., Harta G. et al. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from BM. Science 2000; 290: 1779-82.
39. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat. Med. 2000; 6: 1229-34.
40. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998; 279: 1528-30.
41. Bittner R.E., Schofer C., Weipoltshammer K. et al. Recruitment of bone-marrow-derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice. Anat. Embryol. [Berl) 1999; 199: 391 -6.
42. Ferrari G., Stornaiuolo A., Mavilio F. Failure to correct murine muscular dystrophy. Nature 2001; 411: 1014-5.
43. Gussoni E., Bennett R.R., Muskiewicz K.R. et al. Long-term persistence of donor nuclei in a Duchenne muscular dystrophy patient receiving bone marrow transplantation. J. Clin. Invest. 2002; 110: 807-14.
44. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., Smirnov V.N. Searching for Alternative Sources of Postnatal Human Mesenchymal Stem Cells: Candidate MSC-Like Cells from Umbilical Cord. Stem Cells 2003; 21: 105-10.
45. Kong K.Y., Ren J., Kraus M. et al. Human Umbilical Cord Blood Cells Differentiate into Muscle in sjl Muscular Dystrophy Mice. Stem Cells 2004; 22: 981 -3.
46. Bischoff R. The satellite cell and muscle regeneration. In: Myology, 2nd Edition, Engel AG, Franzini-Armstrong C [Eds), McGraw Hill 1994; 1: 97-119.
47. Seale P., Rudnicki M.A. A new look at the origin, function, and 'stem-cell' status of muscle satellite cells. Dev. Biol. 2000; 218: 115-24.
48. Grounds M.D., McGeachie J.K. A model of myogenesis in vivo, derived from detailed autoradiographic studies of regenerating skeletal muscle, challenges the concept of quantal mitosis. Cell Tissue Res. 1987; 250: 563-9.
49. Rantanen J., Hurme T., Lukka R. et al. Satellite cell proliferation and the expression of myogenin and desmin in regenerating skeletal muscle: evidence for two different populations of satellite cells. Lab. Invest. 1995; 72: 341 -7.
50. Schultz E. Satellite cell proliferative compartments in growing skeletal muscles. Dev. Biol. 1996; 175: 84-94.
51. De Angelis L., Berghella L., Coletta M. et al.: Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration. J. Cell Biol. 1999; 147: 869-78.
52. Beauchamp J.R., Heslop L., Yu D.S. et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 2000; 151: 1221-34.
53. Wada M.R., Inagawa-Ogashiwa M., Shimizu S. et al. Generation of different fates from multipotent muscle stem cells. Development 2002; 129: 2987-95.
54. Charge. S.B., Rudnicki M.A. Cellular and Molecular Regulationof Muscle Regeneration. Physiol. Rev. 2004; 84: 209-38.
55. Karpati G., Pouliot Y., Zubrzycka-Gaarn E. et al. Dystrophin is expressed in mdx skeletal muscle fibers after normal myoblast implantation. Am J. Pathol. 1989; 135: 27-32.
56. Partridge T.A., Morgan J.E., Coulton G.R. et al. Conversion of mdx myofibers from dystrophin negative to positive by injection of normal myoblasts. Nature 1989; 337: 176-9.
57. Gussoni E., Pavlath G.K., Lanctot A.M., et al. Normal dystrophin transcripts detected in Duchenne muscular dystrophy patients after myoblast transplantation. Nature 1992; 356: 435-8.
58. Karpati G., Ajdukovic D., Arnold D. et al. Myoblast transfer in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 1993; 34: 8-17.
59. Mendell J.R., Kissel J.T., Amato A.A. et al. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 1995; 333: 832-8.
60. Morandi L., Bernasconi P., Gebbia M. et al. Lack of mRNA and dystrophin expression in DMD patients three months after myoblast transfer. Neuromuscul. Disord. 1995; 5: 291-5.
61. Neumeyer A.M., Cros D., McKenna-Yasek D. et al. Pilot study of myoblast transfer in the treatment of Becker muscular dystrophy. Neurology 1998; 51: 589-92.
62. Partridge T., Lu Q.L., Morris G., Hoffman E. Is myoblast transplantation effective?, Nature Med. 1998; 4: 1208.
63. Beauchamp J.R., Morgan J.E., Pagel C.N., Partridge T.A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem celllike properties as the myogenic source. J. Cell Biol. 1999; 144: 1113-22.
64. Roy R., Tremblay J.P., Huard J. et al. Antibody formation after myoblast transplantation in Duchenne-dystrophic patients, donor HLA compatible. T ranspl. Proc. 1993; 25: 995-7.
65. Urish K., Kanda Y., Huard J. Initial failure in myoblast transplantation therapy has led the way toward the isolation of muscle stem cells: potential for tissue regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 2005; 68: 263-80.
66. Camirand G., Rousseau J., Ducharme M.E. et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Molecular Therapy 2004; 9[3): 475-82.
67. Zhao P., Hoffman E. P. Embryonic myogenesis pathways in muscle regeneration. Dev. Dyn. 2004; 229[2): 380-92.
68. Qu Z., Balkir L., van Deutekom J.C., Robinson P.D., Pruchnic R., Huard J. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J. Cell Biol. 1998; 142: 1257-67.
69. Lee J.Y., Qu-Petersen Z., Cao B. et al. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J. Cell Biol. 2000; 150: 1085-1100.
70. Qu-Petersen Z., Deasy B., Jankowski R. et al. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J. Cell Biol. 2002; 157: 851-64.
71. Torrente Y., T remblay J.P., Pisati F. et al. Intra-arterial injection of muscle-derived CD34[+)Sca-1 [+) stem cells restores dystrophin in mdx mice. J. Cell Biol. 2001; 152: 335-48.
72. Zhou S., Schuetz J.D., Bunting K.D. et al. The ABC transporter Bcrp1/ ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 2001; 7: 1028-34.
73. Zhou S., Morris J.J., Barnes Y., et al. Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population stem cells in mice, and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 12339-44.
74. Seale P., Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A. et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell 2000; 102: 777-86.
75. Castro R.F., Jackson K.A., Goodell M.A. et al. Failure of BM cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. Science 2002; 297 [Issue 5585): 1299.
76. Wagers A.J., Sherwood R.I., Christnsen J.L., Weissman I.L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 2002; 5: 5.
77. Schulze M., Belema-Bedada F., Technau A., Braun T. Mesenchymal stem cells are recruited to striated muscle by NFAT/IL-4-mediated cell fusion. Genes Dev. 2005; 19[15): 1787-98.
78. Liang Y., Van Zant G., Szilvassy S.J. Effects of aging on the homing and engraftment of murine hematopoietic stem and progenitor cells. Blood 2005; 106: 1479-87.
79. Amit M., Carpenter M.K., Inokuma M.S. et al. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 2000; 227: 271-8.
80. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst. Science 1998; 282: 1145-7.
81. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.Y. et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature. Biotechnology 2000; 18: 399-404.
82. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. N. Engl. J. Med. 2003; 349: 275-86.
83. Jaenisch R Human cloning - the science and ethics of nuclear transplantation. N. Engl. J. Med. 2004; 351: 2787-91.
84. Minasi M.G., Riminucci M., De Angelis L. et al. The mesoangioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development 2002; 129: 2773-83.
85. Sampaoles M., Torrente Y, Innocenzi A. et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science 2003; 301: 487-92.
86. Palumbo R., Sampaolesi M., De Marchis F. et al. Extracellular HMGB1, a signal of tissue damage, induces mesoangioblast migration and proliferation. JCB 2004; 164 [3): 441-49.
87. Cossu G., Bianco P. Mesoangioblasts-vascular progenitors for extravascular mesodermal tissues. Curr. Opin. Genet. Dev. 2003; 13: 537-42
