CC BY
42
УДК. 576.3/7.086.83:612.014
ПЕЧЕНЬ - ИММУНОПРИВИЛЕГИРОВАННАЯ ЗОНА ДЛЯ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ В ЛЕЧЕНИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА МЕЛКИХ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ
И.К. АБДРАХМАНОВ, кандидат биологических наук, докторант
ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко
Л.А. СЕРЕЖИНА, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина
М.А. СЕЛЮГИН, кандидат биологических наук, ветеринарный врач
Ветеринарный центр «АВЕРС-ВЕТ»
Н.М. ТУРЖАНСКАЯ, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина
Ю.А. КУЗНЕЦОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, ветеринарный врач
Ветеринарный центр «АВЕРС-ВЕТ»
И.Ф. ВИЛКОВЫСКИЙ, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина
Н.Б. САВЕНКО, кандидат биологических наук, научный сотрудник
ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко
В.Н. МИТИН,\доктор биологических наук Российский онкологический научный центр им.
Н.Н. Блохина
Л.П. ДЬЯКОНОВ, доктор биологических наук ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко
Резюме. Один из способов лечения инсулинозависимого сахарного диабета - трансплантация островковой ткани доноров больным. Основное препятствие для ее проведения - сверхострое и острое отторжение трансплантата. Сегодня известны такие методы предотвращения иммуноотторжения трансплантата, как правильный выбор иммунопривилегированнойзоны, использование «очищенных» предварительным культивированием р-клеток, использование р-клетокна определенных сроках гестации при отборе донорского материала. При соблюдении всехэтихусловий мы в качестве иммунопривилегированной зоны использовали печень, что позволило отказаться от иммунодепрессантов.
В работе изложен опыт клинической ксенотрансплантации р-клеток поджелудочныхжелез плодов кролика 5 собакам и 3 кошкам (всего 8 опытов) с диагнозом сахарный диабет. Клетки трансплантировали в печень по уникальной неинвазивной методике, которая позволяет проводить процедуру без анестезии, чрезкожно и через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени в дозе 100 тыс. клеток на 1 кг массы тела. В случае необходимости проводили симптоматическое лечение сопутствующих патологий. Уровень глюкозы в крови после трансплантации определяли 1...4 раза в день. Положительного результата удалосьдобиться у бживотных из
8, при этом отмечено улучшение лабораторных показателей: снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацитоза и др. В 4 случаях из 8 наблюдали полную инсулинонезависимость на протяжении от 7 месяцев до 3 лет.
Ключевые слова: сахарный диабет, ксенотрансплантация, островковые клетки поджелудочной железы, плоды кролика, эндокринология
Несмотря на тщательную предтрансплантационную подготовку материала, реакция отторжения трансДостижения науки и техники АПК, №10-2011 _
плантата - основное препятствие для длительного функционирования пересаженной ткани в организме реципиента. Как при аллогенной, так и при ксеногенной пересадке органов и тканей процессы отторжения и приживления зависят от степени биологической совместимости донора и реципиента.
Трансплантация в иммунологически привилегированные зоны обеспечивает успех в достижении длительного функционирования трансплантированных островковых клеток (ОК) в организме реципиента, без назначения иммунодепрессантов. Это свидетельствует об атипичной иммунной реакции организма реципиента, при которой иммунокомпетентные клетки долго не распознают чужеродные антигены [1...4].
В 2004 г. был установлен положительный эффект трансплантации ксеногенной культуры ОК из поджелудочной железы (ПЖ) эмбрионов кроликов в организм собак с экспериментальным сахарным диабетом (СД) [1]. Для предотвращения отторжения трансплантацию осуществляли в костный мозг, рассматриваемый в качестве иммунологически привилегированной зоны.
В 1977 г. было опубликовано первое сообщение о внутрипеченочной трансплантации аллогенных ОК ПЖ. При этом после введения материала через воротную вену, снижение потребности в экзогенном инсулине произошло у 3 больных из 4 на срок до 18 мес. [5].
В дальнейшем многие авторы признали трансплантацию р-клеток в печень наиболее эффективной [6...9].
В научном мире накоплен большой материал по внутрипеченочной трансплантации клеток лабораторным животным с экспериментальным (индуцированным) СД. В своей работе мы впервые применили клеточную трансплантацию для лечения СД в клинической ветеринарной практике.
В связи с этим цель нашей работы - получить первичные экспериментальные данные по лечению сахарного диабета в клинической ветеринарной практике с помощью трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы кролика.
Условия, материалы и методы. В исследования включали животных с установленным диагнозом СД 1 или 2.
Пяти собакам и трём котам в паренхиму печени под эхографическим контролем трансплантировали культивированные фетальные ОК ПЖ кролика в количестве 100 тыс. клеток/кг массы тела.
Непосредственно перед трансплантацией кожу животных обрабатывали стандартно для ультразвукового исследования: выбривали, обрабатывали антисептиком, увлажняли. Общей анестезии и обездвиживания животного не проводили. Трансплантат, представляющий собой суспензию бета-клеток в физиологическом растворе, набирали в шприц с длинной иглой с мандре-ном для спинномозговой пункции. Прокол брюшной стенки проводили правее белой линии на уровне конца мечевидного отростка грудины под контролем ультразвука. Иглой чрезкожно и через мышечную брюшную стенку попадали в паренхиму левой доли печени и после удаления мандрена инъецировали трансплантат порциями по 0,2 мл в 5.7 точек. Иммуносупрессивной терапии после трансплантации не проводили. Резуль-
таты оценивали по уменьшению уровня глюкозы в крови до физиологической нормы и, соответственно, по снижению дозы вводимого инсулина.
Всем животным после трансплантации резко уменьшали дозу экзогенного инсулина, чтобы использовать стресс для активизации собственных сил организма. Наблюдения выполняли при ежедневном контроле уровня глюкозы в крови. Инсулин назначали только в случае значительного превышения нормального уровня глюкозы и неудовлетворительного состояния животного.
При необходимости проводили симптоматическое лечение сопутствующих патологий. Уровень глюкозы в крови после трансплантации определяли хозяева животных глюкометром в домашних условиях 1.4 раза в день. Биохимическое, клиническое исследование крови и общий анализ мочи проводили за 2.3 дня до трансплантации и на 5, 21 и 60 дни после процедуры, затем по необходимости.
результаты и обсуждение. Животное №1. Английский сеттер, кастрированный кобель, 10 лет, массой
29 кг Клинико-диагностические признаки заболевания за 5 сут. до трансплантации: кахексия, дегидратация 5.7 %, полидипсия, анорексия, рвота, гипергликемия (32,6 ммоль/л), глюкозурия (55 ммоль/л). Доза вводимого инсулина 44 ед./сут.
Суммарно животному трансплантировали 3 млн ОК. Сразу после процедуры дозу вводимого инсулина уменьшили до 20 ед./сут. и под контролем уровня глюкозы в крови снижали ее в течение 4 мес., в том числе за первые 3 мес. - в 3,7 раза. Наблюдали уменьшение уровня глюкозы в моче вплоть до полного исчезновения. Спустя 4 мес. отмечали тенденцию к росту уровня глюкозы в крови и моче, кетоновые тела отсутствовали. Дозу вводимого инсулина увеличили до 24 ед./сут. Через 200 сут. провели повторную трансплантацию. В этот период плавно снизили дозу вводимого инсулина с 24 ед./сут до 14 ед./сут. Уровень глюкозы в крови и моче находился в норме в течение месяца. Через 240 сут. после первой трансплантации наблюдение прекратили.
Животное№2. Стаффордширский терьер, сука, 9,5 лет, массой 24 кг поступила на прием с жалобами на полидипсию, полиурию, мастопатию, кардиомегалию. Выявили: гипергликемию (19,3 ммоль/л), глюкозурию (55 ммоль/л) и кетонурию (1,5 ммоль/л). Животному проведена овари-огистероэктомия и одномоментная трансплантация ОК в паренхиму печени в количестве 2,5 млн клеток.
До и в день трансплантации животное получало 20 ед./сут. инсулина, на следующие сутки под контролем уровня глюкозы в крови его введение полностью отменили. Нормализация уровня глюкозы в крови и моче произошла сразу. Нормогликемия и отсутствие глюкозы в моче сохранялись до 952 дня после трансплантации, когда наблюдение прекратили.
В период течки у собак, вследствие секреции ге-стагена и соматотропного гормона, сначала отмечают повышение продукции инсулина, затем развитие инсулин-антагонистического действия и вероятное развитие СД. В таком случае при одновременной стерилизации суки мы резко нарушили её гормональный фон, что сыграло вспомогательную роль в стабилизации гормонального статуса и привело к нормогликемии на первые сутки после трансплантации.
Животное №3. Беспородная сука, 10 лет, 25 кг. Собака попала в клинику почти за год до трансплантации с жалобами на одышку, хроническую сердечную недостаточность, гипергликемию - 20 ммоль/л, длительную глюкозурию - 60 ммоль/л. Два предшествующих трансплантации месяца доза инсулина составляла 14 ед./сут.
Суммарно животному трансплантировали 2,5 млн ОК. Снижение дозы экзогенного инсулина сразу после процедуры провоцировало рост уровня глюкозы в крови и моче, и к 20 дню эксперимента средняя доза вводимого инсулина осталась прежней - 14 ед./сут, к 60 дню она возросла до 18 ед./сут., к 78 - до 23 ед./сут. Ежедневное наблюдение за уровнем глюкозы в крови и дозой экзогенного инсулина проводили до 156 дня эксперимента. Гибель животного произошла спустя 272 сут. по независящим от трансплантации причинам.
Анализируя клинические признаки заболевания, картину крови и мочи, патологоанатомические изменения (резко выраженная жировая дистрофия печени, выраженное ожирение миокарда, гиперплазия коры надпочечников, дистрофия эпителия почечных канальцев), а также отсутствие эффекта трансплантации р-клеток мы предположили у этой собаки заболевание гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, при котором продукция кортикостероидных гормонов повышена вследствие гиперплазии или гормонпродуцирующей аденомы гипофиза. Стероидный диабет характеризуется инсулинрезистентностью. При этом наблюдают стероидную миопатию и кардиопатию. Количество эритроцитов, гемоглобина и холестерина, как правило, увеличено. Выраженность клинических признаков зависит от степени секреции глюкокортикоидов. Отсутствие эффекта трансплантации в этом опыте, вероятнее всего, связано с этиологической причиной заболевания, при которой не было поражения р-клеток, а гиперплазированная кора надпочечников продуцировала слишком много глюкокортикоидов, и небольшое количество трансплантированных клеток не смогло восполнить резко возросшую потребность в инсулине.
Животное №4. Ризеншнауцер, сука, 11 лет, масса 34 кг поступила на приём с жалобами на похудение, жажду, полиурию. При анализе крови выявлена гипергликемия 14,6 ммоль/л, глюкозурия 55 ммоль/л. За двое суток и в день трансплантации доза экзогенного инсулина составила 40 ед./сут.
Суммарно животному трансплантировано 3 млн ОК. При плавном снижении дозы экзогенного инсулина после процедуры до 27 ед./сут., происходило скачкообразное изменение уровня глюкозы в крови. К 50 сут. эксперимента наблюдали рост глюкозурии до 55 ммоль/л и за период в 10 дн. дозу инсулина подняли еще на 2 ед./сут.
С 50 по 81 сут. эксперимента наблюдали рост потребности в экзогенном инсулине, доза которого 33 ед./ сут. обеспечивала уровень глюкозы крови в среднем за период только порядка 17 ммоль/л , что свидетельствует о недостатке инсулина. Начиная с 81 сут. после трансплантации наблюдение за животным не проводили.
Отсутствие эффекта в этом случае, на наш взгляд, связано с отторжения трансплантата, так как на 39 сут. отмечено возросшее количество эозинофилов.
Животное №5. Ирландский сеттер, сука, 8 лет, масса 27 кг Животное находилось на лечении с диагнозом неосложнённая форма СД 2. За период, предшествующий эксперименту, доза экзогенного инсулина составляла
30 ед./сут. Клиническое состояние: гипергликемия 9,7 ммоль/л, глюкозурия 50 ммоль/л. Животному проведена трансплантация 2,5 млн ОК.
Через 6 сут. после процедуры доза экзогенного инсулина осталась неизменной, глюкоза крови начала плавно снижаться с 9 сут. после трансплантации, что позволило уменьшить дозу экзогенного инсулина до 24 ед./сут. Далее ее плавно сокращали с условием поддержания нормогликемии к 11 сут. - до 20 ед./сут., к 13 сут. - до 16 ед./сут., а с 24 сут. отменили совсем.
Наблюдение продолжали еще на протяжении 7 мес., в течение которых отмечали антидиабетогенный эффект трансплантации. При этом уровень глюкозы крови оставался в норме, общее состояние животного улучшилось.
Животное №6. Персидский кот, кастрированный, 9 лет, масса 12 кг Клинико-диагностические признаки заболевания: гипергликемия (18,8 ммоль/л), глюкозурия (17 ммоль/л). Среднетяжёлое общее состояние. Доза экзогенного инсулина перед трансплантацией - 20 ед./сут.
Суммарно животному трансплантировано 1,2 млн ОК. При сохранении нормогликемии заметное снижение уровня экзогенного инсулина наблюдали к 70 сут. после процедуры. К этому моменту показатели глюкозы и вводимого инсулина составили 2 ммоль/л и 13 ед./ сут соответственно. До 138 сут. после трансплантации 13.14 ед./сут. инсулина обеспечивали нормоглике-мию. Со 172 сут. от инсулина отказались, гипергликеми-ческих скачков не наблюдали. Всего за этим животным наблюдали около года, в течение которого возврата к инсулинотерапии не было.
Животное №7. Беспородный кастрированный кот, 12 лет, масса 9 кг Поступил на лечение с признаками полиу-рии, полидипсии. Гипергликемия 20,9 ммоль/л. Средняя доза экзогенного инсулина за предтрансплантационный период составила 18 ед./сут. на протяжении 2 мес.
Проведена трансплантация 1 млн ОК. В течение первых 5 сут. в результате снижения дозы инсулина до 7 ед./ сут., уровень глюкозы крови поднялся до 18,6 ммоль/л. Но уже к 46 сут. 9 ед./сут. инсулина обеспечивали нормогли-кемию. Наблюдение за животным продолжали 119 дн., при этом плавно снижали дозу экзогенного инсулина при достижении нормогликемии. Среднее его количество за период от 46 до 119 дня составило 6 ед./сут.
Животное №8. Кастрированный кот европейской короткошёрстной породы, 11 лет, 6 кг. Поступил на лечение с признаками полиурии, анорексии. Гипергликемия (28,9 ммоль/л). Окончательный диагноз - СД,
отягощённый почечной недостаточностью. Животному провели инфузионную терапию и назначили инсулин в дозе 10 ед./сут. в течение 3 недель. После чего была проведена трансплантация 1 млн ОК.
В 1 день после процедуры дозу инсулина снизили до 2 ед./сут., что сопровождалось гипергликемическим скачком, далее наблюдали планомерное снижение уровня глюкозы крови. К 24 сут. отказались от инсулина совсем, при этом уровень глюкозы крови стабилизировался. Животному периодически проводили симптоматическое лечение по поводу почечной недостаточности.
Гибель животного произошла на 1182 сут. после начала эксперимента из-за хронической почечной недостаточности и общей интоксикации организма, что подтвердили результаты патологоанатомического исследования. Таким образом, после трансплантации островковых р-клеток плода кролика 11-летний кот, с поставленным до процедуры диагнозом сахарный диабет, прожил еще 3 года без инсулинотерапии.
Выводы. Таким образом, мы провели трансплантацию р-клеток поджелудочной железы плодов кроликов восьми инсулинозависимым животным с диагнозом сахарный диабет. Положительного, на наш взгляд, результата удалось добиться у 6 животных из 8, при этом наблюдали снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацитоза.
Результаты проведённых клинических исследований позволяют предположить, что при ксеногенной трансплантации в печень собакам и кошкам, больным сахарным диабетом, кроличьих фетальных р-клеток поджелудочной железы, очищенных путем культивирования происходит выработка эндогенного инсулина. Кроме того, у животных снижается проявление или полностью исчезают такие сопутствующие диабету осложнения, как ангиопатия, нефропатия, ретинопатия, что позволяет значительно улучшить качество их жизни и предотвратить риск новых осложнений.
Литература.
1. Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А., Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг. Белорусский медицинский журнал. - 2004. - №1. - С.44.
2. Transplantation of islets of Langerhans: new developments/Berney T., Buhler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. // Swiss. Med. Wkly - 2002. - 132. - pp. 671-680.
3. Federlin K., Pozza G. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future - the diabetologist's point of view// J Mol Med. - 1999. - 77. - pp. 148-152.
4. Kolb E., Largiader F. Clinical islet transplantation// Transpl. Proc. - 1980. - 12. - №4. - pp. 205-207.
5. Najarian J.S., Sutherland D.E.R. et al. Human islet autotransplantation. A preliminary report// Transplant. Proc. - 1977. - 9. -№1. - pp. 233-236.
6. Oberholzer. 6 Cell Replacement for the Treatment of Diabetes//Annals of the New YorkAcademy of Sciences. -944. -2001. - pp. 373-387.
7. Shamblott M.J., Axelman J., Wang S., et al. Derivation of pluripotent stem cells cultured human primordial germ cells// Proc. Natl. Acad. Rec. USA. - 1998. - 95. - рр. 13726-13731.
8. Valente U., Ferro M., Barocci S. Report of clinical cases of human fetal transplantation//Transplant. Proc. -1980. - 12. - №4. - pp. 213-214.
9. Alejandro R., Ferreira J. V., Caulfield A. et al. Insulin independence in 7 patients following transplantation of cultured human islets //Am J Transplant. - 2002. - vol. 2. - Suppl. 3. - p. 227.
LiVER iS iMMUNOPRiViLEGED ZONE FOR TREATMENT OF DiABETES OF SMALL DOMESTiC
ANiMALS BY XENOTRANSPLANTATiON.
I.K.Abdrakhmanov, L.A. Serezhina, M.A.Selyugin, N.M.Tuzhanskaya, Yu.A.Kuznetsov, I.F.Vilkovysky, N.B.Savenko, V.N.Mitin, L.P.Dyakonov
Summary. This article describes the experience of clinical xenotransplantation p-cells of rabbit fetuses pancreas to 5 dogs and 3 cats (8 experiments) with a diagnosis of diabetes mellitus. Cells were transplanted into the liver percutaneously through the abdominal wall into the parenchyma of the left lobe of the liver in a dose of 100 thousand cells per 1 kg of body weight using an unique non-invasive technique to enable a transplant without anesthesia. If necessary, symptomatic treatment of associated pathologies was realized. Blood glucose levels was determined 1-4 times per day after transplantation. Positive results we achieved in 6 of 8 animals, with the observed improvement in laboratory parameters: reduction of blood glucose and urine, disappearance ketoacidosis, improving the flow of diabetic complications. In 4 cases of 8 total insulin- independence over 7 months to 3 years we observed.
Insulin-dependent diabetes - the disease characterized by failure to maintain normoglycemia p-cells of the pancreas. One of the treatments - transplanted islet tissue donors to patients with diabetes mellitus. The main obstacle for transplantation is acute and hyperacute transplant rejection. Methods to prevent immune rejection of the graft are the right choice immunoprivileged zone, use of «refined» pre-cultivation of p-cells and use of p-cells for a certain period of gestation in the selection of donor material. We used the liver as immunoprivileged zone, thus renounce the use of immunosuppressive drugs.
Key words: diabetes mellitus, xenotransplantation, p-cells of pancreas, rabbit fetus, endocrinology
