CC BY
53
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
УДК 616.34/35-006.6-091.8
ПАРАЛЛЕЛИ МЕЖДУ ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ И НЕКОТОРЫМИ МОРФО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ
Непомнящая Е.М., Никипелова Е.А., Нистратова О.В., Новикова И.А.,
Водолажский Д.И., Ульянова Е.П.
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Россия, 344037, Ростов-на-Дону, ул. 14 линия, 63 nistratova.o.v@mail.ru
Цель. Определить возможность прогнозирования развития рецидивов и метастазов при колоректальном раке в зависимости от наличия циркулирующих опухолевых клеток и мутаций в гене KRAS с учетом морфологической характеристики опухоли.
Материалы и методы. У 40 больных с впервые установленным колоректальным раком выявляли циркулирующие опухолевые клетки. В ткани удаленной опухоли определяли наличие мутаций в гене KRAS.
Результаты. Количество циркулирующих опухолевых клеток в венозной крови было выше у больных с низкой и умеренной степенью дифференцировки опухоли по сравнению с больными, опухоль которых имела высокую степень дифференцировки. Установлено, что у больных с высоким уровнем циркулирующих опухолевых клеток отмечена положительная экспрессия маркеров апоптоза (р53), а также маркеров, отражающих микрососудистую инвазию (CD31, ММП-2). Морфологические изменения были сопоставимы с клиническими проявлениями в виде возникновения ранних рецидивов и метастазов.
Заключение. Полученные данные имеют прогностическое значение и важны для понимания механизмов прогрессии колоректального рака.
Ключевые слова: колоректальный рак, циркулирующие опухолевые клетки, KRAS мутации, морфо-генетические показатели.
PARALLELS BETWEEN CIRCULATING TUMOR CELLS AND SOME MORPHOLOGICAL AND GENETICAL INDICATORS IN COLORECTAL
CANCER
Nepomnyschaya E.M., Nikipelova E.A., Nistratova O.V. Novikova I.A.,
Vodolazhsky D.V., Ulianova E.P.
Rostov Research Institute of Oncology 63,14 Line st., Rostov-on-Don, 344037, Russia nistratova.o.v@mail.ru
Purpose. Study the possibility of forecasting of development of recurrences and metastases in colorectal cancer depending on the presence of circulating tumor cells and mutations in the KRAS gene, given the morphological characteristics of the tumor.
Materials and methods. In 40 patients with newly diagnosed colorectal cancer were identified circulating tumor cells. In the tissue of the removed tumor was determined the presence of mutations in the KRAS gene.
Results. The number of circulating tumor cells in venous blood was higher in patients with low and moderate degree of differentiation of the tumor in comparison with patients whose tumor had a high degree of differentiation. It was found that in patients with high levels of circulating tumor cells marked by positive expression of markers of apoptosis (p53), as well as markers reflecting of microvascular invasion (CD31, MMP-2). Morphological changes were comparable with the clinical symptoms in the form of occurrence of early relapses and metastasis.
Conclusion. The findings have prognostic value and important for understanding the mechanisms of progression of colorectal cancer.
Key words: colorectal cancer, circulating tumor cells, KRAS mutations, morphological indices.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение
В настоящее время является актуальным ранее выявление рецидивов и метастазов колоректаль-ного рака (КРР), что обусловлено его широкой распространенностью в России, составляющей по данным разных авторов от 40 до 47% опухолей желудочно-кишечного тракта, и неуклонным ростом заболеваемости, достигшим 12% за последние 5 лет. На 2013 год стандартизированный показатель заболеваемости раком прямой кишки составил 12,3 на 100 тысяч населения [1]. При этом в течение первых пяти лет у 30-50% больных II-III стадией КРР развиваются рецидивы и отдаленные метастазы [2].
Важным аспектом в лечении больных КРР является своевременная диагностика бессимптомных рецидивов и метастазов, позволяющая повысить резектабельность и выживаемость пациентов, поскольку наличие минимальной остаточной опухоли и микрометастазов снижает показатели выживаемости [3].
В связи с этим обстоятельством, современный подход в индивидуализации лечения больных КРР основывается на важной роли прогнозирования рецидивирования и метастазирования опухоли. Одним из маркеров, дающих эту возможность, является увеличение в крови количества циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) [4].
Важными факторами являются не только клинические параметры (распространение опухоли, ее объем и проч.), но и молекулярно-генетический портрет КРР. Имеются данные, что в 80% случаев КРР отмечается гиперэкспрессия рецепторов эпи-дермального фактора роста (EGFR). Сигнал через рецептор от EGFR распространяется через внутриклеточный сигнальный путь и оказывает влияние на процессы дифференцировки, пролиферации, миграции, ангиогенеза и апоптоза.
Одним из таких молекул-передатчиков являются белки гена KRAS. При наличии активирующей мутации в этих генах, имеющей место у 50-60% больных, нарушается работа данного сигнального пути, и применение моноклональных антител к EGFR становится неэффективным [5].
В исследовании В.А. Горбуновой [6] отражены результаты химиотерапевтического лечения больных КРР, обоснована необходимость изучения статуса гена KRAS для выбора тактики оптимальной терапии.
Особое значение в разработке проблемы КРР придается иммуногистохимическим характеристикам опухоли, отражающим ее метастатический и пролиферативный потенциал. Так, в частности, экспрессия металлопротеиназ определяет высокую опухолевую активность, но в условиях развития высокодифференцированной опухоли она выражена меньше, чем при низкодифференцированной опухоли [7].
В исследованиях у больных КРР изучение количества ЦОК считается важным прогностическим фактором, определяющим агрессивное поведение опухоли, а данные о генно-молекулярных изменениях указывают на формирование сложных па-
тогенетических взаимосвязей различных факторов [8-10]. Мутация генов происходит в результате различных молекулярных процессов хромосомной, микросателлитной нестабильности и метилирования островков ДНК.
Хроническое воспаление сопровождается продукцией противовоспалительных цитокинов, которые индуцируют мутации и в онкогенах, и ту-мор-супрессорных генах (АРС, р53, KRAS). В молекулярный канцерогенез вовлечены различные группы генов-мутантов. Вышеизложенные обстоятельства позволяют представить интегральный подход к генезу КРР и разработать программу кан-церпревенции [11].
Целью исследования явилось определение возможности прогнозирования развития рецидивов и метастазов в зависимости от наличия циркулирующих опухолевых клеток и мутаций в гене KRAS с учетом морфологической характеристики опухоли.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования стали 40 пациентов (20 мужчин и 20 женщин) с диагнозом колоректальный рак III В стадии. Возрастной диапазон пациентов варьировал от 42 до 84 лет. У 15 (37,5%) больных опухоль локализовалась в прямой кишке, а у 25 (62,5%) больных — в сигмовидной кишке.
Исследование крови у пациентов на наличие ЦОК проводили с использованием системы Cell-Search™, состоящей из двух приборов: станции подготовки пробы и анализатора, принцип работы которой основан на подсчёте количества эпителиальных опухолевых клеток, выделяемых из крови. Идентификацию клеток осуществляли с помощью флюоресцентно-меченых антител к цитокератинам (8,18,19), общелейкоцитарному антигену CD45 и ядерного красителя DAPI. Анализ был основан на иммуномагнитном обогащении клеток при помощи металлических наночастиц, покрытых полимерным слоем, содержащим антитела к EpCAM молекулам (маркеры эпителиальных клеток) с последующей иммунофлуоресцентной идентификацией собранных в магнитном поле клеток. В настоящее время данная система утверждена FDA для клинического применения при трёх локализациях злокачественных опухолей: в молочной железе, предстательной железе и толстом отделе кишечника. При этом ре-ференсными значениями считаются не более 5-ти ЦОК в образце при раке молочной железы и предстательной железы, не более 3-х при КРР.
Определение уровня ЦОК у пациентов в крови производили в 8 мл венозной крови, полученной в предоперационном периоде.
Исследование ткани опухоли на наличие мутаций в гене KRAS проводили методом Real-Time qPCR. Из фиксированных в 10%-ом забуференном формалине и залитых в парафин образцов ткани опухоли получали срезы толщиной 3-5 мкм. Процедура экстракции ДНК включала стандартную депарафинизацию срезов. Затем образцы обрабатывали согласно протоколу производителя набором реагентов QlAamp DNA FEPE Tissue Kit (QIAGENE, Германия). Концентрацию выделен-
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
ной из образцов ДНК измеряли на флюориме-тре Qubit 2.0 с использованием набора Quant-iT dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, США). Концентрацию ДНК нормализовали до 1 нг/мкл. С помощью набора реагентов Real-Time PCR-KRAS-7М («Биолинк», Россия) производили определение 7 SNP-мутаций (Single Nucleotide Polymorphism) в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США).
Иммуногистохимическое исследование прово-дилис помощью моноклональных антител ki-67, р53, CD31, ММП-2 (Dako) на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования. При этом срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол исследования включал в себя предварительный нагрев до 65°C, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97°C и дальнейшее охлаждение до 65°C. Затем стекла промывали в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещали в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме.
Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, используя для заключения бальзам Bio-Mount. Оценку экспрессии маркеров осуществляли на 10-ти выбранных полях зрения с применением светового микроскопа Zeiss Axio Imager M2 под увеличением х10, х40.
В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:
1. опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было
менее 25%, и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток;
2. для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество ki-67-положитель-ных опухолевых клеток, приходящихся на 200300 опухолевых клеток;
3. для оценки ангиогенеза в опухоли микрососуды окрашивали антителом CD31. Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40 и программы AxioVs40 v-4.8.1.0.
Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoftInc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).
Результаты исследования
У 30-ти из 40 больных КРР III В стадии (75% случаев) обнаружен повышенный уровень ЦОК (рис. 1). При этом у 90% ЦОК-положительных больных, что составило 67,5% от общего числа пациентов, выявлены активирующие мутации в гене KRAS.
Опухоли у больных, в соответствии с гистологическим строением были представлены аденокар-циномой разной степени дифференцировки. На основе этого признака соотношение пациентов было следующим: 20% больных (8 человек) с высоко-дифференцированной, 35% больных (14 человек) с умереннодифференцированной и 22% (18 больных) с низкодифференцированной аденокарциномой.
Установлены статистически значимые различия (при р<0,05) в уровне ЦОК у больных с разной степенью дифференцировки КРР. У 80% пациентов пороговое значение уровня ЦОК в крови было повышено (>3 клеток в образце). Количество клеток варьировало от 10 до 400. У 20 % пациентов значение уровня ЦОК было ниже порогового (<3 клеток в образце), однако ЦОК присутствовали в каждом образце от 1 до 3.
Рисунок 1. Соотношение больных колоректальным раком по содержанию циркулирующих опухолевых клеток в крови.
ЦОК - циркулирующие опухолевые клетки.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
На рисунке 2 представлены результаты анализа количества ЦОК в крови у пациентов в зависимости от степени дифференцировки КРР. Получено,
что содержание ЦОК при умеренной и низкой степени дифференцировки опухоли больше, чем при высокой степени ее дифференцировки.
45,00% 40,00% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00%
количество циркулирующих опухолевых клеток < 3
количество циркулирующих опухолевых клеток > 3
Ю1
Ю2
вз
Рисунок 2. Содержание циркулирующих опухолевых клеток в крови у больных колоректальным раком в зависимости от степени дифференцировки опухоли.
01, 02, 03- высокая, умеренная, низкая степень дифференцировки.
Ретроспективный анализ данных об отдаленных метастазах у пациентов позволил выявить связь между повышенным уровнем ЦОК в крови и ве-
роятностью обнаружения ранних метастазов в период с 18 по 24 месяц после оперативного лечения (рис. 3).
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Метастазы и рецедивы Отсутствие метастазов и
рецидивов
■ количество циркулирующих опухолевых клеток <3 клеток
количество циркулирующих опухолевых клеток > 3 клеток
Рисунок 3 .Вероятность обнаружения метастазов и рецидивов у больных колоректальным раком в зависимости от количества циркулирующих опухолевых клеток.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
У 90% больных с отдаленными метастазами очаги поражения были локализованы в печени, а по гистологическому строению были аналогичны первичной опухоли. У 7,5% больных при рентгенологическом исследовании были обнаружены метастазы в лёгких. У 2,5% больных отдаленные метастазы обнаружены в большом сальнике, по гистологическому строению они также были аналогичны первичной опухоли.
Анализ морфологических показателей, отражающих поведение опухоли, позволил выявить, что
у 67,5% больных была выраженная экспрессия ММП-2. Высокая и умеренная пролиферативная активность была отмечена в 100% случаев, экспрессия р53 — в 67,5% случаев. В то же время экспрессия CD31 была установлена в 75% образцов, что отражало наличие выраженной микрососудистой инвазии.
Результаты иммуногистохимического исследования в сопоставлении с содержанием ЦОК в крови у больных КРР представлены в таблице.
Таблица
Показатели иммуногистохимических маркеров у больных колоректальным раком с разным уровнем
циркулирующих опухолевых клеток в крови
Экспрессия ИГХ маркеров Доля больных с числом ЦОК>3 (n=30), % Доля больных с числом ЦОК <3 (n=10), %
Положительная экспрессия р53 76,7%* 40%*
Отсутствие экспрессии р53 23,7%** 60%**
Умеренная пролиферативная активность (Ы-67) 33,3% 30%
Высокая пролиферативная активность (Ы-67) 66,7% 70%
Положительная экспрессия CD31 93,3%° 20%°
Отсутствие экспрессии CD31 6,7%°° 80%°°
Положительная экспрессия ММП-2 26(86,7%) Ф 10% Ф
Отсутствие экспрессии ММП-2 13,3% Ф Ф 90% Ф Ф
Примечание: статистически значимые различия при количестве циркулирующих опухолевых клеток < 3 и > 3 выявлены: * и ** - по экспрессии р53, р=0,0383; ° и °° - по экспрессии СЭ31, р=0,00001; * и * * - по экспрессии ММП-2, р=0,0001. ИГХ - иммуногистохимический, ЦОК - циркулирующие опухолевые клетки.
Из таблицы следует, что у больных с высоким уровнем ЦОК имеется положительная экспрессия маркеров апоптоза, а также маркеров, отражающих микрососудистую инвазию и метастатический потенциал опухоли.
Полученные результаты, отражающие повышение содержания в крови ЦОК, наличие мутаций в гене KRAS, увеличение уровня р53, ki-67, ММП-2, позволяют прогнозировать развитие рецидивов и метастазов, что согласуется с существующим представлением [3] о перспективности динамического наблюдения за больными КРР в прогнозировании развития рецидивов и метастазов, обеспечивающем более высокую выживаемость после выполнения операции.
Заключение
Проведенное исследование показало, что обнаружение ЦОК в периферической крови и активирующих мутаций в гене KRAS при КРР имеет ряд значимых характеристик: во-первых, чем больше количество ЦОК в крови, тем выше частота положительных мутаций KRAS. Во-вторых, высокое содержание ЦОК отражает вероятность возникновения ранних метастазов и рецидивов КРР.
Установлена связь между степенью дифферен-цировки опухоли и выявлением ЦОК в крови: в условиях умеренно- и низкодифференцированной опухоли количество ЦОК в крови выше по сравнению с высокодифференцированным ее вариантом.
Полученные результаты служат основанием рассматривать превышение порогового уровня ЦОК в крови (больше 3 клеток в одном образце при варьировании количества от 10 до 400 клеток) при изучении флюоресцентномеченых антител к цитокератинам (8,18,19), общелейкоцитарного антигена CD45 и ядерного красителя DAPI, как один из факторов для прогнозирования агрессивного течения КРР.
Показано, что количество ЦОК находится в прямой зависимости от маркеров апоптоза (р53) (р=0,0383), микрососудистой инвазии (CD31) (р=0,00001), ММП-2 (р=0,0001). При этом морфологические изменения сопоставимы с клиническими проявлениями в виде возникновения ранних рецидивов и метастазов. У больных с повышенным количеством ЦОК метастазы и рецидивы возникают в более ранние сроки по сравнению с больными с низким уровнем ЦОК.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии ЛИТЕРАТУРА
1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) // Москва: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, 2015. С. 11-53.
2. Нефедова Н.А., Мальков П.Г. Роль стволовых клеток в канцерогенезе толстой кишки // М. Онкологическая колопрок-тология. 2015. №3. С. 15-24.
3. Хомяков Е.А. Динамическое наблюдение больных колорек-тальным раком после радикальных операций // Колопрок-тология. 2015. №2(52). С.57-67.
4. Massimo Cristofanilli, "ttomas Budd, Matthew J. Ellis et al. Circulating Tumor Cells, Disease Progression, and Survival in Metastatic Breast Cancer. N Engl J Med. 2004.351:781-91.
5. Федянин М.Ю., Трякин A.A., Тюляндин С.А. Перспективы лечения больных раком толстой кишки с мутацией в гене BRAF / Онкологическая колопроктология. 2014. №3. С.9-16.
6. Горбунова B.A. Необходимость углубленного анализа RAS-мутаций для стратегии лекарственной терапии колорек-тального рака / Онкологическая колопроктология. 2014. №1. С.7-13.
7. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеиназы: строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний
(обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. 2010. №5. URL: http://cyberleninka.ru/article/n/matriksnye-metalloproteinazy-stroenie-regulyatsiya-rol-v-razvitii-patologicheskih-sostoyaniy-obzor-literatury(дата обращения: 02.08.2016).
8. Кит О.И., Нистратова О.В., Новикова И.А., Водолажский Д.И., Никипелова Е.А., Непомнящая Е.М., Ульянова Е.П., Олейникова Е.Н. Ассоциация между наличием KRAS мутаций в опухоли и количеством циркулирующих опухолевых клеток у больных колоректальным раком// Кубанский научный медицинский вестник. 2016. №1. С.56-62.
9. Cohen SJ, Punt CJ, Iannotti N, Saidman BH, Sabbath KD, Gabrail NY et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2008. 26: 3213-3221 [PubMed].
10. Miller MC, Doyle GV, Terstappen LW. Significance of circulating tumor cells detected by the Cell Search system in patients with metastatic breast colorectal and prostate cancer. J Oncol. 2010: 617421-617421 [PMC free article] [PubMed].
11. Шапошников А.В. Колоректальный рак. Канцерогенез и он-копревенция. М. 2015.
