CC BY
99
Section 2. Biotechnology
Section 2. Biotechnology Секция 2. Биотехнология
Fufaewa Tatjana Walentinowna Natalja Anatolewna Kasakowa üljanowsker Staatliche Pädagogische Ilja Uljanow- Universität,
E-mail: tanya-fnfaeva@yandex.ru
Die Einschätzung des Einflusses verschiedener Dosen von Formaldehyd und Phenol auf Mikroorganismen von ausgelaugter Schwarzerde.
Zusammenfassung: Der Einfluss verschiedener Dosen von Phenol und Formaldehyd auf die quantitative und qualitative Zusammensetzung der Mikroorganismen von ausgelaugter Schwarzerde wurde untersucht. Die 5 Heterotrophebakterienstämme werden hervorgehoben und beschrieben, die Phenol als Quelle von Kohlenstoff benutzen können.
Stichwörter: ausgelaugte Schwarzerde, Phenol, Formaldehyd, Mikroorganismen, Bakterienstämme.
Татьяна Валентиновна Фуфаева Наталья Анатольевна Казакова Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова
E-mail: tanya-fufaeva@yandex.ru
Оценка влияния различных доз формальдегида и фенола на микроорганизмы чернозема выщелоченного
Аннотация: Изучено влияние различных доз фенола и формальдегида на количественный и качественный состав микроорганизмов чернозема выщелоченного. Выделены и охарактеризованы 5 штаммов бактерий ге-теротрофов, которые способны использовать фенол в качестве источника углерода.
Ключевые слова: чернозем выщелоченный, фенол, формальдегид, микроорганизмы, штаммы бактерий.
Почва — одно из важнейших богатств, которыми располагает человек. Поэтому так важно для человека изучение почвы — источника нашего пищевого благосостояния. Вместе с тем проявляется тенденция к уменьшению площадей плодородных земель вследствие ветровой и водной эрозии, а также загрязнения почв человеком химическими веществами и отходами химических производств.
Почвенный покров выполняет функции биологического поглотителя, разрушителя и нейтрализатора загрязнений различного рода. Если это звено биосферы будет разрушено, то сложившееся функционирование биосферы необратимо нарушится. Именно поэтому чрезвычайно важно изучение глобального
биохимического значения почвенного покрова, его современного состояния и изменения под влиянием антропогенной деятельности, так как важнейшим значением почв является аккумулирование органического вещества, различных химических элементов и энергии. Охрана почв от загрязнений является важной задачей человека, так как любые вредные соединения, находящиеся в почве, рано или поздно попадают в организм человека [4].
Проблема оценки состояния почв, связанная с загрязнением ее отходами производства и потребления, выбросами от стационарных и передвижных источников, применения агрохимикатов, является весьма актуальной.
22
Секция 2. Биотехнология
Материалы и методы. В данной работе были использованы физико-химические и микробиологические методы исследований. Отбор почвы проводили в соответствии с ГОСТ 28168-89 [1]. Был проведен отбор, подготовка и анализ почвы (чернозем выщелоченный), пробы почв, взятых с пробных площадок паспортизированного поля. В качестве загрязнителей были выбраны фенол и формальдегид.
С каждых 40 га паспортизированного поля методом маршрутных ходов были отобраны на глубину пахотного слоя (до 35 см) смешанные пробы (каждая из 40 индивидуальных проб). Смешанные пробы помещали в чистые маркированные полипропиленовые мешки по 25-30 кг.
Определение динамики численности микроорганизмов живущих в почве (чернозема выщелоченного) необходимо для выявления адаптивной способности аборигенных микроорганизмов к фенолу и формальдегиду, определения физиологических групп устойчивых к высоким концентрациям токсиканта. Проведя анализ динамики численности, можно определить длительность токсического эффекта действия на микробиоту и величину максимальной депрессии микроорганизмов.
Численность микроорганизмов в черноземе выщелоченном, содержащей различные концентрации загрязнителя, определяли методом последовательных разведений почвенной суспензии на 5 и 30 сутки [3]. Для этого брали по 1 г контрольных и опытных образцов почв и вносили в колбы со 100 мл физиологического раствора. Полученную взвесь тщательно взбалтывали в течение 15-20 минут. После осаждения крупных частиц почвы из колб отбирали по 1 мл взвеси для разведений, которые готовили в четырех стерильных пробирках с 9 мл физиологического раствора.
Плесневые грибы выявляли поверхностным методом, высевая 0,1 мл почвенной суспензии из разведения 10-2 на агаризованную среду Чапека-Докса. Актиномицеты
выделяли поверхностным методом, также как и грибы, высевая 0,1 мл из разведения 10-3 на среду Красильникова № 1. Гетеротрофные бактерии выявляли глубинным методом посева 1 мл суспензии из разведения 10-5 на ГРМ-агар. Культивирование посевов осуществляли в термостате при 25 0 С в течение 2 суток при выделении гетеротрофных, 5-7 суток при выделении актиномицетов и плесневых грибов. После инкубации посевов проводили количественный учет выросших колоний и определяли колониеобразующие единицы в 1 г почвы. Динамику численности микроорганизмов в почве с ксенобиотиком отражали в процентах по отношению к контролю.
При посеве в чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + формальдегид отбирали изолированные колонии после 4 пассажа, а при посеве в чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + фенол отбирали изоляты после 6 пассажей в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой. Определение систематического положения отобранных штаммов проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [6] по настоящее время.
Статистическую обработку данных проводили с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007). Повторность всех экспериментов трехкратная.
Результаты исследований и их обсуждение.
Анализ почвенных образцов, в которые вносили 1,36, 13,6 и 136 мг/кг фенола, что соответствовало 10, 100 и 1000 доз ПДК, показал различные изменения микробиоценоза почв.
Исследования проб загрязненных почв были направлены на изучение численности гетеротрофных бактерий, актиномицетов и плесневых грибов, так как именно эти группы участвуют в почвообразовательных процессах и обеспечивают самоочищающую способность почвы [2].
Рис. 1. Влияние различных доз формальдегида на численность плесневых грибов в почве.
23
Section 2. Biotechnology
При взаимодействии формальдегида с плесневыми грибами отмечено стимулирующее влияние максимальных концентраций. Данные по влиянию различных доз формальдегида на численность плесневых грибов в почве приведены на рисунке 1. Внесение 100 и 1000 доз ПДК увеличивало количество грибов на 10-30%, а в почве, содержащей 10 дозу ПДК, в первые дни численность грибов уменьшилась. На 30 сутки отмечено снижение содержания грибов во всех пробах почвы с формальдегидом, причем выделялись в основном грибы родов Мыеог и PeniciHinm. Видимо, образующиеся продукты разложения препа-
рата обладали токсическим действием на грибы.
При взаимодействии фенола с плесневыми грибами было отмечено, что все дозы фенола в первые дни опыта обладали стимулирующим действием на плесневые грибы, увеличивая их количество в 1,5-2,5 раза, по сравнению с контролем. Причем стимулирующий эффект усиливался с увеличением концентрации ксенобиотика. Однако на 30 день выявлено снижение количественных показателей микромицетов до уровня контроля. Данные по влиянию различных доз фенола на численность плесневых грибов в почве приведены на рисунке 1.1
Рис. 1.1. Влияние различных доз фенола на численность плесневых грибов в почве.
Анализ динамики численности актиномицетов при внесении различных доз формальдегида показал ингибирующее действие на их размножение. Данные по влиянию различных доз формальдегида на численность актиномицетов в почве приведены на рисунке 2. В течение 30 суток отмечено
непрерывное снижение количества актиномицетов в пробах с формальдегидом. К 30 дню численность актиномицетов во всех пробах почвы уменьшилось до 90-97%. Таким образом, действие формальдегида выражается в негативном действии на их размножение.
Рис. 2. Влияние различных доз формальдегида на численность актиномицетов в почве.
На актиномицеты фенол практически не оказывал никакого влияния. Лишь при внесении малой дозы, численность актиномицетов оставалась на исходном уровне. При внесении же повышенных доз наблюдалось торможение ростовых процессов, но на 30 день их численность восстанавливалась до контрольных показателей. Данные по влиянию различных доз фенола на численность актиномицет приведены на рисунке 2.1.
На рисунке 3 показано влияние формальдегида на численность гетеротрофных бактерий. Установлено, что в течение 30 суток происходило увеличение содержания гетеротрофных бактерий в почве, содержащей формальдегид. Причем, внесение в почву концентрации 10 ПДК не сразу отразилось на размножении бактерий. В почве с максимальными дозами (100 и 1000 мг/кг) уже на пятые сут-
24
Секция 2. Биотехнология
ки количество бактерий на 10 и 45% превышало контрольные значения. К 30 дню численность гетеротрофов во всех пробах почвы увеличилась до 147-154%. Так действие формальдегида выра-
жалось в непрерывном стимулировании процесса размножения бактерий, увеличение числа которых на 30 сутки превысило содержание их в контроле в 1,5 раза.
Рис. 2.1. Влияние различных доз фенола на численность актиномицетов.
Как видно из рисунка 3.1 гетеротрофные бактерии оказались весьма чувствительными к загрязнителю. Наблюдалось подавление их роста, снизившее их количественные показатели до 70%. К 30 суткам в пробах, содержащих рабочую концентрацию препарата и в 10 раз превышающую её, наблюдалось слабое
возобновление роста бактерий. Однако численность их все же не достигала контрольного уровня. В пробе почвы, содержащей дозу в 1000 раз превышающую ПДК, ингибирующее влияние фенола на бактерии сохранялось, что говорит о сильном бактерицидном свойстве фенола.
Рис. 3. Влияние различных доз формальдегида на численность гетеротрофных бактерий в почве.
После 4 пассажа в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + формальдегид и отбирали изолированные колонии. Таким образом
удалось получить 2 изолята, устойчивых к формальдегиду в концентрации 50 мг/л, которые были исследованы на способность к деструкции в условиях непрерывного культивирования в аэробных условиях на минеральной среде М9.
Рис. 3.1. Влияние различных доз фенола на численность гетеротрофных бактерий в почве
25
Section 2. Biotechnology
Выделенные 2 штамма бактерий были обозначены под шифрами Фд1 и Фд2. При микроскопическом изучении видов бактерий установлено, что это тонкие грамотрицательные палочки; на агаре Хоттингера pH 7,6 через 24 часа инкубации при температуре плюс 28oC вырастают матовые, бугристые, с фестончатым краем колонии, дающие цветочный запах. Вызывает равномерное помутнение бульона и образует белую пленку на поверхности. Штаммы подвижны. Физиолого-биохимические признаки: аэроб растет при температуре 5-42°С, оптимум роста 28-37°С. Оптимальный pH сред колеблется в пределах 7,0-7,6.
Определение систематического положения отобранных штаммов проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [6] по настоящее время.
Деструкцию наблюдали в условиях непрерывного культивирования штаммов в колбах Эрленмейера со 100 мл жидкой среды М9, в которую вносили формальдегид в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрациях 50 мг/л. Инкубацию культуры проводили при плюс 28 0 C в течение 4 суток в условиях аэрации в шейкер-инкубаторе при частоте вращения платформы 50-70 оборотов/минуту.
Результаты исследования показывают, что после 48 часов инкубирования штаммы Фд 1 и Фд 2 разрушают 10 мг/л и 15 мг/л формальдегида.
После шести пассажей в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + фенол и отбирали изолированные колонии (изоляты). Таким образом удалось получить 5 изолятов, устойчивых к фенолу, которые были исследованы на способность к деструкции в условиях непрерывного культивирования в аэробных условиях на минеральной среде М9. Выделенные штаммы бактерий были обозначены под шифрами Фл 1, Фл 2, Фл 3, Фл 4 и Фл 5. При микроскопическом изучении видов бактерий установлено, что это мелкие грамположительные и грамотрица-тельные палочки гетеротрофных бактерий, образующие на агаре мелкие, блестящие, гладкие, с однородной структурой, выпуклые колонии с ровным краем. Определение систематического положения отобранных штаммов проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [6] по настоящее время.
В связи с тем, что фенол достаточно сложно поддается трансформации и не способен подвергаться полной минерализации только одним штаммом в результате отсутствия одного или нескольких генов деградации, то при изучении деструкции мы использо-
вали всю популяцию устойчивых штаммов. Известно, что в ассоциации или в консорциуме почвенных микроорганизмов генный пул, отвечающий за деструкцию, на несколько порядков выше и разнообразнее, чем у отдельных видов.
Выделенные штаммы изучали на способность разлагать фенол, используя его как единственный источник углерода. Деструкцию наблюдали в условиях непрерывного культивирования штаммов в колбах Эрленмейера со 100 мл жидкой среды М9, в которую вносили фенол в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрациях 50 и 100 мкг/л. Инкубацию культуры проводили при плюс 28 0 C в течение 10 суток в условиях аэрации в шейкер-инкубаторе при частоте вращения платформы 50-70 оборотов/минуту. Определение фенолов проводили в соответствии с ПНД Ф 16.1:2.3:3.44-05 [5].
Получены данные об изменении оптической плотности клеточной суспензии в процессе роста периодических культур в жидкой среде М9 с добавлением фенола в различной концентрации. Высокую плотность популяции штаммов наблюдали при внесении 50 мкг/л.
Для штаммов деструкторов в периодической культуре наблюдалось существенное изменение оптической плотности клеточной суспензии, начиная с 3-х суток культивирования. Наибольшей плотности культуры достигали к 6 суткам культивирования и затем заканчивали свой рост.
При добавлении концентрации 100 мкг/л происходила гибель культур на 2-е сутки инкубации. В процессе инкубации штаммов наблюдалось уменьшение концентрации фенола, которое уменьшалось на 6-е сутки от начальной концентрации 50 мкг/л до 15 мкг/л. Из этих данных следует, что выделенный консорциум бактерий осуществляет деградацию фенола. Так как деградация протекала при низкой концентрации фенола, поиск наиболее оптимальных условий и устойчивых штаммов ведутся и по настоящее время.
Таким образом, полученные результаты показывают характер влияния доз фенола и формальдегида на состав и функционирование комплекса почвенных микроорганизмов:
1. Установлено угнетающее действие фенола и формальдегида в высоких дозах 100 и 1000 ПДК на состав и жизнеспособность всех исследованных физиологических групп почвенных микроорганизмов чернозема выщелоченного.
2. Показана способность почвенных бактерий адаптироваться к загрязнению 10 и 100 ПДК загряз-
26
Секция 2. Биотехнология
нителей в течение 30 суток: качественный и количественный состав микробоценоза соответствовал исходным показателям.
3. Выделены и охарактеризованы 5 штаммов бактерий гетеротрофов, которые способны использовать
фенол в качестве источника углерода, также выделены штаммы бактерий гетеротрофов, потенциально способных использовать формальдегид в качестве источника углерода и энергии и давать активный рост на среде М9.
Список литературы:
1. ГОСТ 28168-89. Почвы. Отбор проб. - введ.1990-04-01. - М.: Изд-во стандартов, 1989. - 8 с.
2. Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М.: МГУ, 1983. - 215 с.
3. Кауричев И. С. Практикум по почвоведению. М., 1980. С. 106-108.
4. Круглов Ю. В. Микрофлора почвы и пестициды/Ю. В. Круглов. - М.,1991, с. 88
5. ПНД Ф 16.1:2.3:3.44-05 Выполнения измерений массовой доли летучих фенолов в пробах почв, осадков сточных вод и отходов фотометрическим методом после отгонки с водяным паром.
6. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriologi//9-th. e Baltimore, London, Los Angeles. SydneyVol. 1. 1984; vol. 2, 1986; vol. 3. 1989; vol. 4. 1989
27
