CC BY
76
e
Оценка влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона альфа-2Ь человеческого рекомбинантного в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток
А. Н. ВАСИЛЬЕВ
Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств Научного центра экспертизы средств медицинского применения, Москва'
Antioxidant Impact on Specific Antiviral Activity of Human Recombinant Interferon a-2b with Respect to Herpes simplex in Cell Culture
A. N. VASILYEV
Institute of Preclinical and Clinical Examination of Drugs,
Scientific Centre for Examination of Medicinal Products, Moscow
Получены данные, свидетельствующие о синергидном противовирусном эффекте in vitro комбинации интерферона альфа-2Ь и антиоксиданта унитиола в отношении различных вариантов вируса простого герпеса, в том числе клинических изолятов вируса, устойчивых к ацикловиру. Показано, что унитиол обладает прямой противогерпесвирусной активностью в культуре клеток, однако его активность менее выражена, чем у другого сильного антиоксиданта — аскорбиновой кислоты. Также выявлено, что в присутствии унитиола специфическая противогерпесвирусная активность интерферона альфа-2Ь повышается в несколько раз. Полученные данные могут быть применены в клинической практике, поскольку использование комбинаций препаратов или комплексных препаратов позволяет повышать эффективность проводимой терапии герпетической инфекции, добиваясь большего эффекта при тех же концентрациях действующих лекарственных средств.
Ключевые слова: вирус простого герпеса, культура клеток, интерферон альфа-2Ь, антиоксидант унитиол.
In vitro synergistic antiviral effect of interferon a-2b in combination with unithiol (an antioxidant) on diverse variants of Herpes simplex, including the clinical acyclovir-resistant isolates, was demonstrated. Unithiol showed immediate antiherpes activity in the cell culture. However, its activity was lower than that of ascorbic acid, another highly active antioxidant. It was also observed that the specific antiherpes activity of interferon a-2b in the presence of unithiol increased several times. The data could be useful in the clinical practice, since the drugs combinations or complex formulations provide higher efficacy of the herpetic infection therapy with the use of the same concentrations of the available agents.
Key words: Herpes simplex, cell culture, interferon a-2b, unithiol (antioxidant).
Генитальный герпес является одной из наиболее распространённых форм инфекции вируса простого герпеса (ВПГ-инфекции) среди взрослого населения. В России ежегодно ВПГ инфицируется около 10 млн человек, а в последние годы отмечена тенденция к увеличению заболеваемости генитальной формой ВПГ-инфекции, что имеет особую значимость в гинекологической и акушерской практике.
© А. Н. Васильев, 2010
Адрес для корреспонденции: 1231082, Москва, ул. Щукинская, 6.
Развитие ВПГ-инфекции может иметь тяжёлые последствия для здоровья матери и ребенка, выражаемые в развитии бесплодия, различных патологий беременности, а также тяжёлых заболеваний новорожденных [1, 2].
Основным направлением лечения ВПГ-ин-фекции является химиотерапия [3, 4], однако способность вирусов к формированию устойчивости к химиопрепаратам и распространение таких штаммов существенно снижает эффективность химиотерапии. Метод комбинированной терапии вирусных заболеваний довольно распространён, использование препаратов с разными
1 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.
О
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
механизмами действия позволяет получать надёжный эффект при снижении терапевтической дозы препаратов, а также снизить вероятность получения мутантов вируса с лекарственной устойчивостью [5, б]. Препараты интерферона прочно заняли своё место в арсенале практикующих врачей благодаря универсальному механизму противовирусного действия. Поиск препаратов, позволяющих повысить эффективность интреферонотерапии, проводится довольно давно, разработаны и используются в клинической практике комбинации препаратов интерферона альфа-2Ь и модифицированных нуклеозидов [б].
B последнее время опубликовано множество работ об участии процесса перекисного окисления липидов мембран (nOH) и системы анти-окислительной защиты организма (AO3) в патогенезе вирусных и бактериальных инфекций, а также в развитии многих других заболеваний [У, 8]. Дисбаланс nOH-AO3 на местном уровне осложняет течение вирусных инфекций, следовательно, применение препаратов, обладающих ан-тиокислительными свойствами, позволяет восстановить баланс процессов nOH-AO3 и облегчить течение вирусной инфекции [7—9].
Ранее была изучена противогерпесвирусная активность комбинаций интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного и антиоксидантов токоферола ацетата и аскорбиновой кислоты in vitro и in vivo, показано наличие выраженного синергизма между препаратами [9, l0]: в присутствии аскорбиновой кислоты и токоферола ацетата специфическая противовирусная активность интерферона альфа увеличивалась в несколько раз.
Целью настоящей работы явилось изучение in vitro противовирусной активности сочетаний интерферона альфа-2Ь человеческого рекомбинантного и серосодержащих антиоксидантов таурина и унитиола в отношении различных вариантов вируса простого герпеса, в том числе клинических изолятов вируса простого герпеса, выделенных от больных.
Материал и методы
Вирусы. В работе использовали четыре варианта вируса простого герпеса, из них два эталонных штамма и два клинических изолята:
— ВПГ-1/Л2 — вирус простого герпеса тип 1, штамм Л2;
— ВПГ-1/(Б+) вирус простого герпеса тип 1, штамм (Б+). Оба штаммы получены из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Инфекционный титр вирусов в культуре клеток Уего, по нашим данным, составил 6,0—6,5 ^ ТЦИД50/мл.
— ВПГ-1 изолят ау(± Вирус выделен в 2006 г. от больного рецидивирующим ВПГ. По антигенной структуре, по данным МФА, а также по наличию специфического цитопа-тического эффекта в культуре клеток Уего (образование син-цитиев) вирус подобен ВПГ-1.
— ВПГ-1 изолят 8ЬавИ. Вирус выделен в 2006 году от больного рецидивирующим ВПГ. По антигенной структуре, по данным МФА, а также по наличию специфического цито-
патического эффекта в культуре клеток Vero (образование синцитиев) вирус подобен ВПГ-1. Указанные изоляты ВПГ относятся к ацикловирорезистентным штаммам.
Методика изоляции вирусов указана в работе [11]. До начала исследования вирусы прошли по 5 пассажей на культуре клеток, хранение вирусного материала осуществляли в пробирках типа Eppendorf при температуре -70°С.
Клетки. В работе использовали культуру клеток почки африканской зелёной мартышки, Vero Е6, полученной из коллекции культур тканей НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Клетки культивировали на среде Игла DMEM с двойным набором аминокислот или на среде RPMI с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов коров (HyClone Standard Fetal Bovine Serum, Thermo Fisher Scientific Inc, США или другая аналогичного качества) и глютамина в концентрации 300 мкг/мл. В качестве антибиотиков использовали смесь пенициллина (100 мкг/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) или гентамицин (100 мкг/мл). Процедура пересева заключалась в снятии монослоя клеток смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:2. Оптимальная плотность пересева 1,0х105-3,0х105 клеток/мл. Среда поддержки: среда Игла DMEM с двойным набором аминокислот или среда RPMI с антибиотиками и глутамином аналогично среде роста с добавлением 2% инактивированной при 56°С в течение 1 часа сыворотки крови эмбрионов коров.
Препараты. Интерферон альфа-2Ъ человеческий рекомбинантный, субстанция (ФСП, ООО «Фармапарк», Россия). Ди-меркаптопропансульфонат натрия (Унитиол), субстанция (ФСП 42-0348-4718-03) производства ФгУП «Технолог СКТБ» (Россия) и Унитиол (ФСП 42-0024131-03) производства ОАО «Мосхимфармпрепараты им. Н. А. Семашко» (Россия). Амино-этансульфоновая кислота (Таурин), субстанция (ФСП 42-05500044-04) производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (Россия) и препарат Тауфон глазные капли 4% (ФСП 42-00876550-05) производства Московского эндокринного завода (Россия). В качестве препарата сравнения использовали Аскорбиновую кислоту, в виде субстанции (ФСП). В качестве рефе-ренсного препарата активности интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного использовали международный стандарт активности интерферона — WHO International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566 (МСО).
Для работы в культуре клеток из субстанций препаратов готовили растворы на поддерживающей среде в концентрации 2 мг/мл. Приготовленные растворы выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч, для аскорбиновой кислоты проводили коррекцию рН раствором гидрокарбоната натрия 2% до рН 5,5, затем приготовленные растворы подвергали стерилизующей фильтрации через насадки фирмы Millipore с фильтром Durapore из эфиров целлюлозы. Препараты в виде готовых лекарственных средств разводили на поддерживающей среде до нужной концентрации.
Оценка цитотоксического действия препаратов. Оценку воздействия различных концентраций веществ и определение 50% тканевой цитотоксической дозы (ТЦЦ50) и максимальную переносимую концентрацию вещества (МПК) проводили следующим образом: к сформированному в стандартных 96-луночных планшетах клеточному монослою добавляли последовательные двукратные разведения приготовленных растворов препаратов на поддерживающей среде, затем клетки культивировали при 37°C в атмосфере 5% СО2 в течение 2—5 дней. О воздействии вещества на морфологию клеток и их жизнеспособность судили по наличию изменений в структуре клеток, включающих следующие признаки: нарушение целостности монослоя, округление клеток, набухание или напротив сжатие клеточных мембран, грануляция и вакуолизация цитоплазмы клеток. За ТЦЦ50 вещества принимали такую концентрацию, которая вызывала цитотоксические изменения у 50% клеток на 4 сутки наблюдения, за МПК принимали концентрацию вещества, воздействие которой не вызывало видимых цитодеструктивных изменений клеточного моно-
Є
Цитотоксическое действие и антигерпесвирусная активность изучаемых препаратов
Препарат МПК ТЦД50 Л2 ИД50 вариант ВПГ F(+) Avd Shash а 0т в і 1 ХТИ (среднее значение)
Унитиол, мкг/мл 148б,50 У49,б1 297,30 594,б0 353,55 250,0 781,00 3,97
Tаурин, мкг/мл б25,00 841,97 0* 0* 0* 0* 0 0
Интерферон альфа-2Ь, МЕ/мл 3б8б5,42 1189207 2973,01 594б,03 2500,00 3535,53 б200,00 9,8б
Aскорбиновая кислота, мкг/мл 374,80 420,71 74,32 88,38 б2,5 б2,5 250,00 5,21
Примечание. 0* означает отсутствие противовирусной активности соединения в выбранном диапазоне концентраций без прямого цитотоксического действия на клетки.
Изучение противогерпесвирусной активности препаратов.
Изучение противогерпесвирусной активности препаратов как отдельно взятых, так и в комбинациях проводили на культуре клеток Vero E6 в отношении четырёх различных вариантов вируса простого герпеса по общепринятому методу [5, 12]. Культуру клеток выращивали в стандартных 96-луночных планшетах (Nunk или Corninc Costar, США) в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 2—3 суток. После формирования плотного монослоя среду роста удаляли, клетки заражали разведением вируса, соответствующим 100 ТЦИД50/кл. Планшеты инкубировали в течение 60 мин в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С, затем инокулум удаляли и добавляли последовательные двукратные разведения растворов изучаемых препаратов на поддерживающей среде. Каждый препарат исследовали в четырёх повторах. Планшеты инкубировали в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С, через 48 ч проводили оценку цитопатического действия вируса и оценку ингибирующего действия веществ на развитие вирусиндуци-рованного ЦПД. За 100% поражение принимали полное развитие вирусиндуцированного ЦПД на поверхности клеточного монослоя. Концентрацию вещества, обеспечивающую защиту клеточного монослоя от развития вирусиндуцированного ЦПД в 50% лунок, обозначали как ИД50. Учёт воздействия веществ на репликацию вируса в культуре клеток проводили только в случае отсутствия клеточной дегенерации в лунках контроля качества клеточного монослоя и при развитии 100% поражения клеточного монослоя в контрольных лунках, соответствующих инфекционной дозе вируса 100 ТЦИД50АЛ.
Статистическую обработку результатов проводили по методу Спирмена—Кербера, используя формулу:
log2HM50=Dmax + (d/n)X{p—(n/2)}, где
Dmax — двоичный логарифм шага разведения, выше которого произошла 100% защита; d — двоичный логарифм шага разведения (1,0); n — число лунок на каждую дозу (4); р — число лунок, давших защиту в Dmax и последующих разведениях.
Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности соединений использовали понятие химиотерапевтического индекса (ХТИ), вычисляемого как отношение МПК к ИД50. Согласно данным литературы для химиотерапевтического препарата, значение ХТИ должно быть равно 3 и более.
Определение противогерпетической активности комбинации соединений in vitro проводили по методу [6] путём определения противогерпетичской активности комбинации соединений по сравнению с противовирусной активностью вещества при использовании его в отдельности. Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле:
ФИК = сумма ИД50 (соединений в комбинации) / сумма ИД50 (соединений в отдельности)
Значение ФИК 0,5 оценивалось как умеренный синергизм, при значении ФИК, равном 1,0-1,5 — как аддитивный
эффект комбинации, при значении ФИК более 2 — как антагонизм. Для наглядной интерпретации результатов определения ИД50 двух веществ в комбинации строили изоболограммы: по оси абсцисс откладывали концентрации ИД50 одного вещества в комбинации, по оси ординат откладывали концентрации ИД50 другого вещества в комбинации. В этих координатах строили кривую, точки которой соответствовали 50% ингибированию вирусиндуцированного ЦПД комбинации веществ в соответствующих концентрациях. Синергидный противовирусный эффект комбинации веществ выражался в наличии экспоненциальной зависимости, радиус кривизны которой был направлен к центру оси координат, при наличии линейной зависимости эффект комбинации соединений приближался к аддитивному. При наличии экспоненциальной зависимости, радиус кривизны которой был направлен вверх — в противоположную от центра оси координат сторону, проявлялся антагонистический эффект комбинации веществ.
Результаты и обсуждение
Сначала нами было оценено цитотоксическое действие соединений на культуру клеток Уего Е6. Установлено, что степень выраженности циток-сического воздействия препаратов на культуру клеток зависит от их концентрации. Полученные данные представлены в таблице. Рабочий диапазон концентраций для работы на выбранной культуре клеток для интерферона альфа-2Ъ был менее 35000 МЕ/мл, для унитиола и таурина — менее 1486,5 мкг/мл, для аскорбиновой кислоты — менее 370,0 мкг/мл, при использовании концентраций препаратов ниже указанных показатель жизнеспособности клеток (в %) через 96 ч наблюдения не отличался от такового в контроле.
Далее нами была изучена прямая противогер-песвирусная активность антиоксидантов, как в отношении эталонных штаммов, так и в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса. Полученные результаты также представлены в таблице.
Проанализировав результаты изучения циток-сичности и противовирусной активности препаратов, можно сделать вывод о том, что исследуемый препарат унитиол и препарат сравнения аскорбиновая кислота обладают прямой противогерпесвирусной активностью, в отличие от таурина, который не обладал прямой противогерпесвирусной активностью в исследуемом диапазоне концентраций. Выявлено, что противогерпетиче-ская активность антиоксидантов унитиола и ас-
ГЕРПЕС И ЦИТОМЕГАЛИЯ
ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ В, С, О
ХЛАМИДИОЗ, МИКОПЛАЗМОЗ УРЕАПЛАЗМОЗ
УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ И БРОНХОЛЕГОЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ
ПИЕЛОНЕФРИТ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТ
ДИСБАКТЕРИОЗ
ЭНДОМЕТРИОЗ И ВУЛЬВОВАГИНИТ
МЕНИНГИТЫ
КАНДИДОЗ
ГРИПП И ОРВИ
’ І. ^0.
суппозитории мазь и гель
^ВИФЕРОН
ИНТЕРФЕРОН ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ РЕКОМБИНАНТНЫИ АЛЬФА-2 С АНТИОКСИДАНТНЫМ КОМПЛЕКСОМ
• Препарат разрешен к применению у беременных жен шин и новорожденных детей
• Не вызывает побочных эффектов, имеет минимум противопоказаний и хорошо совместим
с другими лекарствами
Эффективность подтверждена ведущими клиницистами
ферон
ПРОИЗВОДСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Адрес: 125424 г. Москва, Волоколамское ш., Д. 73 Производство: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18, корп. А ООО «ФЕРОН»
тел/факс (495/499) 193-3060, 646-1219 многоканальный электронная почта: viferon@rol.ru адрес \уеЬ-сайта: http://www.viferon.su информационный сайт: http//:www.interferon.su
©
Рис. 1. Антигерпесвирусная активность интерферона альфа-2Ь в комбинации с унитиолом в культуре клеток Vero Е6, инфицированных ВПГ-1 Л2.
Рис. 2. Антигерпесвирусная активность интерферона альфа-2Ь в комбинации с аскорбиновой кислотой в культуре клеток Vero Е6, инфицированных ВПГ-1 Л2.
корбиновой кислоты носит избирательный и дозозависимый характер: вещества проявляют свою противовирусную активность в диапазоне неци-тотоксичных концентраций и могут применяться для лечения герпетической инфекции в качестве химиопрепаратов: ХТИ унитиола равен 3,97, ХТИ аскорбиновой кислоты 5,21. Как видно из результатов исследования, препарат таурин не обладает прямой противогерпесвирусной активностью.
Следующим этапом нашей работы было изучение противогерпетической активности комбинаций интерферона альфа-2Ъ и антиоксидантов в культуре клеток в отношении эталонного варианта вируса простого герпеса штамм Л2. По результатам изучения были построены изоболограммы, наглядно иллюстрирующие характер взаимодействия соединений, а также вычислен ФИК. Результаты исследования представлены в виде изоболограмм на рис. 1 и 2.
Проанализировав полученные результаты, мы пришли к заключению, что антиоксиданты унитиол и аскорбиновая кислота не только обладают прямой противогерпесвирусной активностью в культуре клеток, но и обеспечивают эффективность комбинации с интерфероном альфа-2Ъ. При комбинировании унитиола или аскорбиновой кислоты с интерфероном альфа-2Ъ наблюдается выраженный синергидный эффект: в присутствии указанных соединений концентрация интерферона альфа-2Ъ, которая предотвращает развитие вирусиндуцированного цитопатическо-го действия в 50% лунок, снижается в несколько раз в зависимости от концентрации антиокидан-тов. Например, при комбинировании ИФН с унитиолом удалось добиться снижения концентрации в пять с лишним раз, при этом значение ФИК составило в среднем 0,3, что свидетельствует о выраженном синергизме соединений. Для сравнения при комбинировании ИФН и аскорбиновой кислоты ИД50 ИФН снижается практи-
чески в 6 раз, а значение ФИК в среднем составляет 0,23, что показывает выраженный синергизм соединения.
Относительно активности комбинации ИФН и таурина не выявлено влияния присутствия таурина на специфическую противогерпесвирусную активность ИФН: в присутствии различных концентраций таурина специфическая противогер-петическая активность ИФН соответствовала таковой чистой субстанции.
Полученные данные согласуются с данными литературы об антиокислительной активности соединений: аскорбиновая кислота является одним из самых сильных водорастворимые антиоксидантов, способна блокировать свободные радикалы и предотвращать дальнейшее развитие ПОЛ. Антиокислительная активность унитиола несколько слабее, механизм действия унитиола связан с его способностью блокировать перекиси, образующиеся в процессе ПОЛ, а также связывать ионы металлов переменной валентности подобно комплексону. Относительно антиокислительной активности таурина и механизме его действия как антиоксиданта в литературе не найдено достаточно объективных данных.
Заключение
Таким образом, применение препаратов ИФН в комплексе с активными антиоксидантами позволяет повысить противогерпесвирусную активность ИФН в пять и более раз, что может способствовать повышению эффективности проводимой терапии столь тяжело поддающейся лечению инфекции вируса простого герпеса. Отметим, что действие ИФН и антиоксидантов в отношении вируса простого герпеса носит избирательный дозозависимый характер и не зависит от варианта вируса герпеса, что подтверждают полученные результаты в отношении эталонных штаммов и клинических изолятов ВПГ.
-е
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИТЕРАТУРА
1. Маретикова С. С, Мацевич Г. Р., Чекунова Э. В. и др. Разработка и практическое использование новых экспериментальных моделей разных форм герпетической инфекции. Вопр вирусол 1986; 1: 59—65.
2. Темичева Е. В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе гениталий и коррекция его нарушений: Автореф. дисс. ... к. м. н. М.: 1989.
3. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А. и др. Этиотропная лекарственная терапия вирусных инфекций. Вопр вирусол 2004; 3: 35—40.
4. Галегов Г. А. Лекарственная терапия герпес-вирусной инфекции: фундаментальные аспекты и современные клинические достижения. Consilium Medicum 2002; 4: 5: 240—243.
5. Львов Н. Д., Самойлович Е. О., Баринский И. Ф. Комбинированная терапия герпесвирусной инфекции, экспериментальные и клинические данные. Вопр вирусол 1992; 1: 8—16.
6. De Clercq E, Sakuma T., Baba M. et al. Antiviral activity of phospho-nylm ethoxy alkyl derivatives of purine and pyrimidines. Antiviral Research 1987; 8: 5—6: 261—272.
10.
11.
12.
Амвросьева Т. В., Вотяков В. И., Андреева О. Т. Дислипидемия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпесвирусной инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами. Вопр вирусол 1992; 1: 61—64.
Красавина Б. С., Майчук Ю. Ф., Долгат Л. Д., Ромащенко А. Д. Влияние водорастворимого антиоксиданта оксипиридина-6 на интенсивность процессов перекисного окисления липидов мембран тканей глаза при экспериментальном офтальмогерпесе. Бюлл эксп биол. мед 1982; 7: 731—740.
Темичева Е. В., Малиновская В. В., Манахова Л. С. и др. Вопр вирусол 1986; 1: 12—18.
Никонова А. П., Асцатурова О. Р. Генитальный герпес и беременность. Инфекции и антимикроб тер 1999; 3: 77—80.
Львов Н. Д., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Галегов Г. А. Изоляция из клинического материала штаммов вируса герпеса простого, обладающих pезистентностью к ацикловиру. Вопр вирусол 1999; 6: 247—249.
Blanebier H., Huraux-Rendu Gb. Genital herpes and pregnancy preventive measures. Eur J Obst Gynecol Reproduct Biol 1994; 53: 1: 33—38.
