CC BY
37
УДК 611.018.4:616.72-018.3-003.93-089.227.84]-092.9
Т.А. Ступина
ОЦЕНКА РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ УДЛИНЕНИИ КОНЕЧНОСТИ В УСЛОВИЯХ СТИМУЛЯЦИИ ОСТЕОГЕНЕЗА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика
Г.А. Илизарова (Курган)
Методами сканирующей электронной микроскопии и гистоморфометрического анализа в суставном хряще при. удлинении голени в условиях стимуляции остеогенеза выявлены, изменения реактивного и/или деструктивно-репаративного характера. При. удлинении, конечности в сочетании с интрамедуллярным армированием, спицами к концу эксперимента пролиферация сочеталась с уменьшением, числа секреторно-активных клеток, прогрессировало падение синтетической активности, хондроцитов, снижалась толщина хряща. Отмеченные изменения свидетельствовали, о срыве регенераторных возможностей хряща. При. «веерной» дистракции динамика изучаемых параметров указывала на усиление биосинтетических процессов к концу эксперимента, что свидетельствовало о возможности в дальнейшем, восстановления, структуры, хряща. Разработанные и. апробированные в эксперименте методики, удлинения являются методом, выбора, наблюдаемые при. этом, изменения суставного хряща необходимо учитывать в клинической, практике, создавая условия для предупреждения, развития в нем патологического процесса.
Ключевые слова: суставной хрящ, удлинение конечности, репаративная регенерация
ESTIMATION OF REGENERATION POTENTIALS OF ARTICULAR CARTILAGE AT THE LIMB LENGTHENING UNDER THE CONDITIONS OF OSTEOGENESIS STIMULATION (AN EXPERIMENTAL-AND-MORPHOLOGICAL STUDY)
T.A. Stupina
Russian Scientific Center “Restorative Traumatology and Orthopedics” named after academician
G.A. Ilizarov, Kurgan
Changes of reactive and/or destructive-and-reparative character were revealed, in articular cartilage during shin lengthening with osteogenesis stimulation, using the techniques of scanning electron, microscopy and histomorphometric analysis. Proliferation was combined, with the decrease in secretory-active cell number, the drop of chondrocyte synthetic activity progressed, cartilage thickness decreased, by the end of experiment, when limb lengthening was performed in combination, with, wire reinforcement. The changes noted, evidenced, the break-down of cartilage regeneration potentials. In case of «fan-like» distraction the dynamics of the parameters studied, indicated the intensification of biosynthetic processes by the end. of experiment, thereby evidencing the scope for cartilage structure restoration, subsequently. The lengthening techniques developed, and. evaluated, experimentally appear to be a method, of choice, and. the observed changes in articular cartilage in this situation should be taken into consideration in clinical practice, creating the conditions to prevent the development of pathological process in it.
Key words: articular cartilage, limb lengthening, reparative regeneration
ВВЕДЕНИЕ
Удлинение нижних конечностей является одним из важных разделов проблемы ортопедического лечения врождённых и приобретённых заболеваний трубчатых костей. Современные социально-экономические условия диктуют необходимость внедрения в практику новых, более современных технологий, позволяющих сокращать сроки пребывания пациентов в стационаре, обеспечивающих оптимальные условия для репара-тивного остеогенеза при минимальном риске послеоперационных осложнений [11]. В связи с этим разрабатываются различные способы стимуляции остеогенеза [4, 5, 8].
Внедрение в клиническую практику современных технологий удлинения конечностей вызывает необходимость углубленного изучения процессов, происходящих в смежных суставах, поскольку сохранение их функциональных возможностей имеет большое значение для медицинской, со-
циальной реабилитации и улучшения качества жизни пациентов [12]. Учитывая большую социальную значимость заболеваний крупных суставов, регенерация хряща является одним из наиболее актуальных вопросов, связанных с морфологией и функцией суставного хряща [2].
Цель исследования — гистоморфометрическая оценка регенераторных возможностей суставного хряща при удлинении конечности в условиях стимуляции остеогенеза.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся суставной хрящ мыщелков бедра 5 интактных и 14 опытных собак, которым удлиняли голень аппаратом Илизарова на 28 — 30 мм (эксперимент проведен д.м.н. С.А. Ерофеевым). В 1-й серии в течение 28 суток осуществляли «веерную» дистракцию с чередованием сторон приложения дистракционных усилий [5]. При этом режим дистракции был 2,0 мм за 4
приема на резьбовых стержнях (по задней поверхности кости темп составлял 1,42 мм, по передней —
0,57 мм). Предлагаемый способ позволял не только осуществлять стимуляцию костеобразования, но и использовать щадящий режим для мягких тканей, так как мышцы, расположенные с противоположных сторон, имели возможность периодического отдыха. Во 2-й серии дистракцию осуществляли с темпом 1 мм за 4 приема в сочетании с интра-медуллярным армированием противоизогнутыми спицами. Известно, что удлинение в сочетании с интрамедуллярным напряженным армированием спицами сопровождается усилением эндостального и периостального остеогенеза, что позволяет реально увеличить темп дистракции и сократить сроки остеосинтеза [8, 9, 10]. Этапы эксперимента: 30 суток фиксации и 30 суток без аппарата. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию (передозировкой барбитуратов) осуществляли согласно требованиям приказа МЗ СССР № 755 от 1977 г., а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» [3].
Для гистоморфометрического анализа применяли серийные перпендикулярные суставной поверхности эпоксидные полутонкие срезы большой площади (4 — 8 мм2), окрашенные метиленовым синим и/или метиленовым синим-основным фуксином. На фотомикроскопе «Opton» (Германия) с АПК «DiaMorph» (Москва) изображения препаратов оцифровывали и анализировали в программе «ВидеоТест-Мастер-Морфология». Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. Определяли толщину суставного хряща (h, мкм), объемную плотность хондроцитов (VV, %) в ткани, численную плотность хондроцитов (NA ) и долю (%) изогенных групп (NA ) и пустых лакун (NA ) в общем
1 J ' из. гр' J J ' пуст лак' 1
объёме выборки. В качестве контроля морфоме-трировали суставной хрящ 5 интактных животных.
Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона в программе AtteStat, версия 1.0 [1], в электронных таблицах Microsoft Excel 97.
Рельеф суставной поверхности изучали в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «^М-840» (Лео1, Япония): материал дегидратировали в спиртах, пропитывали в камфене [6], высушивали на воздухе, напыляли серебром.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При исследовании суставного хряща интакт-ных животных рельеф суставной поверхности имел регулярную волнистость и соответствовал описанной в литературе интактной суставной поверхности мыщелков бедренной кости [7]. На полутонких срезах все зоны хряща имели обычное строение, деструктивные изменения не выявлены.
Через 30 суток фиксации в обеих сериях отмечали деструкцию суставной поверхности в виде очагов разволокнения, наиболее выраженных во 2-й серии: наблюдали разволокнение верхних слоев промежуточной зоны (рис. 1). Обнаружены открытые лакуны хондроцитов, как пустые, так и с обнаженными на поверхность клетками.
На полутонких срезах определялось нарушение гомогенности межклеточного вещества, что свидетельствовало о минимальном содержании гликозаминогликанов в матриксе хряща.
Сходные деструктивные изменения поверхностной зоны отмечены и после снятия аппарата. В обеих сериях сохранялось нарушение организации матрикса поверхностной зоны, наиболее выраженное во 2-й серии.
Параллельно в хряще развивались реактивные изменения. Одни хондроциты пролиферировали, в обеих сериях отмечали увеличение частоты встречаемости изогенных групп клеток, другие — демонстрировали высокую биосинтетическую активность, отличались большими размерами, округлой формой, рыхлыми крупными ядрами, базофильной цитоплазмой, окруженные гомогенным интенсивно окрашенным матриксом. Наибольшая частота встречаемости таких клеток отмечена в суставном хряще животных 1-й серии (рис. 2а). Повышение пролиферативной и биосинтетической активности хондроцитов регистрировали как признаки репа-ративных процессов. Во 2-й серии пролиферация сочеталась с увеличением количества пустых лакун и деструктивно измененных хондроцитов (рис. 2б).
тмим гпиммп мммммгп □ iiiiinn □ niiiiiii i
285
а б
Рис. 2. Хондроциты промежуточной зоны хряща. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. 30 суток фиксации. Об. 40; ок. х 12,5: а - 1-я серия; б - 2-я серия.
Таблица 1
Количественные характеристики суставного хряща мыщелка бедра при удлинении голени у собак
Группа Параметры
h (мкм, M ± ІТІ) VVXЦ (%, М ± т) ИДхц (М ± т) ИДпуст. лак (%) ИДиз. гр (%)
Контроль 475,5 ± 1,3 9,03 ± 0,46 6,2 ± 0,56 13,6 14,5
30 суток фиксации 1-я серия 336,5 ± 3,8 5,49 ± 0,64 6,63 ± 0,55 19,6 20,2
2-я серия 343,7 ± 3,8* 6,77 ± 0,37* 7,16 ± 0,65* 25,21 25,5
30 суток без аппарата 1-я серия 382,3 ± 1,4 7,56 ± 0,54 6,65 ± 0,47 14,9 17,1
2-я серия 342,4 ± 2,8* 5,58 ± 0,52* 9,73 ± 1,06* 27 18,9
Примечание: жирным шрифтом отмечены достоверные различия с контролем; * - достоверные отличия между сериями.
При определении достоверности различий для NAхц использовали критерий Вилкоксона (различия достоверны при р < 0,05), для Ьіхр - критерий Стьюдента (различия достоверны при р < 0,001).
Морфометрический анализ выявил достоверное снижение толщины хряща в обеих сериях на всех этапах эксперимента по сравнению с контролем, к концу эксперимента в 1-й серии отмечено увеличение данного параметра относительно предыдущего срока (табл. 1).
Численная плотность изогенных групп во всех сериях превышала контроль, максимальные значения на всех этапах эксперимента отмечены во 2-й серии (табл. 1), что может быть обусловлено более выраженной реактивной реакцией хондроцитов в ответ на повреждение при данном режиме дистрак-ции. Значения NA во 2-й серии превышали
1 пуст. лак 1 1
значения контроля и 1-й серии. За счет увеличения количества изогенных групп, численная плотность хондроцитов и в 1-й, и во 2-й сериях превышала контроль (табл. 1).
Объемная плотность хондроцитов во всех сериях была достоверно ниже нормы. К концу эксперимента в 1-й серии отмечена тенденция к увеличению данного параметра. Во 2-й серии дальнейшее снижение объемной плотности хондроцитов на фоне увеличения NAхц за счет повышения NA указывало на угнетение
из. гр ^ ^
биосинтетической активности хондроцитов, закономерным выглядело дальнейшее снижение толщины хряща.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При изученных режимах дистракции в суставном хряще мыщелка бедра выявлены структурнофункциональные изменения реактивного и/или деструктивно-репаративного характера. В неповрежденных участках хондроциты демонстрируют реактивные изменения адаптивного характера, проявляющиеся в активизации пролиферативных и биосинтетических процессов, за счет которых происходит регенерация хряща. Выраженность процессов пролиферации и биосинтеза в суставном хряще при разных режимах дистракции различна и зависит от степени повреждения.
При удлинении конечности в сочетании с интрамедуллярным армированием спицами к концу эксперимента пролиферация сочеталась с уменьшением числа секреторно-активных клеток, прогрессировало падение синтетической активности хондроцитов, снижалась толщина хряща. Отмеченные изменения свидетельствовали о срыве регенераторных возможностей хряща. При «веерной» дистракции динамика изучаемых параметров указывала на усиление биосинтетических процессов к концу эксперимента, увеличивалась толщина хряща относительно срока 30 суток фиксации, что свидетельствовало о возможности в дальнейшем восстановления структуры хряща.
Разработанные и апробированные в эксперименте методики удлинения являются методом выбора, наблюдаемые при этом изменения суставного хряща необходимо учитывать в клинической практике, создавая условия для предупреждения развития в нем патологического процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гайдышев И.П. Анализ и обработка данных: специальный справочник. — СПб.: Питер, 2001. — 752 с.
2. Данилов Р.К., Гололобов В.Г., Одинцова И.А., Мурзабаев Х.Х. Гистологические основы регенерации тканей опорно-двигательного аппарата // Ортопедия, травматология и протезирование. — 2000. - № 2. - С. 102.
3. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. -
2003. - № 4. - С. 34-36.
4. Михайлов И.Н. Способ стимуляции перестройки дистракционного регенерата при удлинении костей предплечья по Илизарову // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2008. - № 2 (60). - С. 93-94
5. Способ «веерного» удлинения конечности: пат. 2289348 Рос. Федерация: МКИ7 А61В 17/66 / Шевцов В.И., Ерофеев С.А.; заявитель и патентообладатель ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Или-зарова Росздрава». - № 2003118783/14; заявл. 23.05.2003; опубл. 20.12.2006, Бюл. № 35.
6. Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электрон-
ном микроскопе: пат. 2397472 Рос. Федерация, МПК8 А61 В 6/00 / Силантьева Т.А., Горбач Е.Н., Ирьянов Ю.М., Ступина Т.А., Варсегова Т.Н.; заявитель и патентообладатель ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий». — № 2008150910; заявл. 22.12.2008; опубл. 20.08.2010, Бюл. № 23.
7. Павлова В.Н., Копьева Т.Н., Слуцкий Л.И., Павлов Г.Г. Хрящ. — М.: Медицина, 1988. — 320 с.
8. Попков Д.А. Применение интрамедулляр-ного армирования при удлинении конечностей // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. - 2005. - № 2. - С. 65-69.
9. Попков Д.А., Ерофеев С.А., Чиркова А.М. Костеобразование при удлинении голени с использованием интрамедуллярного напряженного армирования (экспериментальное исследование) // Матер. междун. науч.-практ. конф. «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий». - Курган,
2004. - С. 226-227.
10. Попков А.В., Шутов Р.Б., Попков Д.А. Количественная оценка влияния различных факторов на сроки остеосинтеза при удлинении голени // Г ений ортопедии. - 2007. - № 1. - C. 76-80.
11. Шевцов В.И., Попков А.В. Оперативное удлинение нижних конечностей. - М.: Медицина, 1998. - 192 с.
12. Fink B. Schwinger G., Singer J., Sager M. et al. The effect of tibial lengthening using the Ilizarov method on the cartilage and the menisci of the knee joint // J. Orthop. Res. - 2001. - N 19 (4). - Р. 665-670.
Сведения об авторе
Ступина Татьяна Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории морфологии экспериментального отдела травматологии и ортопедии Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. ГА. Илизарова (640014, г. Курган, ул. Марии Ульяновой, 6; тел.: 8 (3522) 41-52-27; e-mail: StupinaSTA@mail.ru)
