CC BY
65
ПРЕПАРАТЫ
ОЦЕНКА НОВОЙ ИФА ТЕСТ-СИСТЕМЫ
«Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ»
12Жираковская Е.В.,3Игнатьев Г.М., 3Индикова И.Н., 12Тикунова Н.В.
1 ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл.;
2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины, Новосибирск;
3 Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевичаг Москва
Приводятся результаты испытаний чувствительности, специфичности и воспроизводимости нового набора реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» разработанного в ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Полученные данные позволяют прогнозировать диагностическую достоверность результатов при использовании данной тест-системы для выявления антигена ротавируса группы А в клиническом материале.
Ключевые слова: ИФА тест-система, эффективность, ротавирус А
^ >
Ротавирусы группы А (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются наиболее распространенной причиной тяжелого гастроэнтерита у детей младшего возраста во всем мире. Нередко заболевают и взрослые с ослабленным иммунитетом. Ротавирусная инфекция (РВИ) является высококонтагиозным заболеванием с множественными путями распространения. Источником инфекции служит человек с манифестной или бессимптомной формой заболевания, а также вирусоноситель [1, 2]. Среди детей и взрослых РВИ может проявляться в виде спорадических случаев, локальных групповых заболеваний, вспышек и имеет повсеместное распространение [2, 4, 8]. Фекально-оральный механизм передачи этой инфекции реализуется пищевым (молоко и молочные продукты, детское питание), водным и контактно-бытовым путями [9, 10].
Постановка диагноза ротавирусного гастроэнтерита по клинической картине, особенно при спорадической заболеваемости, представляет определенную сложность, поскольку характерные для этой инфекции симптомы мало отличаются от симптомов других острых кишечных инфекций (ОКИ) различной этиологии. Дифференциальная диагностика у больных ротави-русным гастроэнтеритом проводится как с пищевыми токсикоинфекциями, так и с другими ОКИ вирусной (норовирусы, астровирусы, аденовирусы, коронави-русы, энтеровирусы Коксаки и ECHO) и бактериальной (сальмонеллез, дизентерия, холера, иерсиниоз, условно-патогенные микроорганизмы) этиологии [1]. К сожалению, не во всех специализированных лечебных учреждениях РФ проводят диагностику ротави-русной инфекции.
Диагностические методы при РВИ направлены на обнаружение цельных вирионов, вирусного антигена или вирусоспецифической РНК в фекалиях [2, 16]. Перспективным подходом к прямому выявлению вирусов как в клиническом материале, так и в объектах окружающей среды, является метод обратной транскрипции - по-лимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) [4, 6, 7, 12, 15]. В последние годы создаются тест-системы, основанные на современных научных разработках с комбинированием различных методов детекции ротавирусов: мультиплексная ПЦР с гибридизационно-флуоресце-нтной детекцией продуктов амплификации «по конечной точке»; иммуно-ПЦР (IPCR) «по конечной точке» с детекцией в реальном времени; количественная ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени [3, 13, 14]. В научно-исследовательских лабораториях для быстрого выявления ротавирусов используют электронную микроскопию [5, 11]. Однако все вышеперечисленные методы являются достаточно трудоемкими и требуют наличия дорогостоящих приборов и высококвалифицированного персонала. Поэтому при проведении лабораторной диагностики в стационарах и в амбулаторных условиях предпочтение отдается методам, основанным на обнаружении вирусного антигена в фекалиях с помощью имму-ноферментного анализа (ИФА) с моно- и поликпональны-ми антителами к ротавирусам [1,2]. Этот метод доступен для практических лабораторий, прост в постановке и позволяет достаточно быстро получить результат.
Цель настоящей работы - изучение диагностической эффективности нового набор реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» разработанного в ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск.
^Сентябрь-декабрь
2009 г.
Материалы и методы
Материалом исследования служили образцы фекалий детей раннего возраста с диагнозом ОКИ и без клинических проявлений кишечной инфекции, находившихся на стационарном лечении в отделениях кишечных инфекций и респираторных инфекций МУЗ «Детская городская клиническая больница №3» Новосибирска. Образцы фекалий собирали в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры в объеме 2-3 мл при поступлении пациентов в отделение стационара и хранили при - 20 °С в течение 15 суток. Более длительное хранение материала осуществлялось при - 70 °С.
В работе была использована предварительно протестированная на наличие возбудителей ОКИ панель из 104 образцов фекалий. Из них:
• 30 образцов, в которых методами ИФА и ОТ-ПЦР были выявлены только ротавирусы группы А; гено-типирование методом ОТ-ПЦР показало, что фекальные пробы содержали ротавирусы генотипа P[8]G1 (18 образцов), P[4]G2 (4 образца), P[8]G3 (3 образца), P[6]G4 (2 образца), P[8]G4 (1 образец), P[8]G9 (1 образец), P[9]G3 (1 образец);
• 14 образцов, в которых методом ОТ-ПЦР были выявлены только норовирусы второго генотипа, что было подтверждено определением нуклеотидной последовательности 5' - области гена капсида, расположенного на геноме норовирусов в районе 5085-5485 h.;
15 образцов, в которых методом ОТ-ПЦР были выявлены только астровирусы, что было подтверждено определением нуклеотидной последовательности 5' - области гена капсида, расположенного на геноме астровирусов в районе 4526 - 4955 н.; 15 образцов, в которых методом ПЦР были выявлены только аденовирусы;
30 образцов фекалий (контроль) от детей без клинических проявлений кишечной инфекции, госпитализированных в респираторное отделение больницы; предварительный анализ не выявил в этих образцах вышеперечисленных вирусных патогенов.
Тестирование образцов на наличие или отсутствие рота-, норо-, астро-и аденовирусов проводили методом ОТ-ПЦР с использованием зарегистрированных в РФ коммерческих наборов «АмплиСенс No го virus 1, 2 genotypes - 306/322», «АмплиСенс Astrovirus -165», «АмплиСенс Adenovirus - 462», «АмплиСенс Rotavirus - 290» (производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, РФ). Исследование образцов проводили в соответствии с инструкциями по применению соответствующих наборов реагентов в период срока годности. Положительные по наличию ротавируса образцы были генотипированы методом ОТ-ПЦР [4]. Определение наличия или отсутствия антигена ротавируса так же проводили методом ИФА с использованием коммерческой тест-системы IDEIA™ Rotavirus, (DakoCytomation, Великобритания) в соответствии с инструкцией к набору.
При проведении испытаний набора реагентов «Рота-вирус-антиген-ИФА-БЕСТ» все вышеуказанные образцы (104) были зашифрованы и трехкратно протестированы исследуемым набором. После завершения испытаний образцы были дешифрованы и результаты проанализированы.
Результаты и обсуждение
Чувствительность комплекта реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» оценивали по числу совпадений положительных результатов (в %) тестирования образцов с помощью испытуемой тест-системы и препаратов сравнения. При этом было выявлено, что при использовании комплекта реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» все 30 образцов с подтвержденным наличием ротавируса А были положительными (табл. 1). Следовательно, чувствительность исследуемого комплекта реагентов при выявлении ротавирусов А составила 100 %. Следует отметить, что в состав панели вошли образцы с семью различными генотипами ротавирусов, и все они были успешно выявлены комплектом реагентов « Рота ви рус - анти ген - И ФА- Б ЕСТ».
Специфичность тест-системы оценивали по числу совпадений отрицательных результатов (в %) тестирования образцов с помощью испытуемой тест-системы сданными предварительных исследований. Для оценки специфичности в используемую панель были включены 30 образцов, в которых вирусные патогены выявлены не были, а также 14 образцов, в которых были выявлены только норовирусы второго генотипа с помощью метода ОТ-ПЦР, 15 образцов, в которых методом ОТ-ПЦР были выявлены только астровирусы; 15 образцов, в которых методом ПЦР были выявлены только аденовирусы. Было определено, что в 69 из 74 отрицательных образцов значения оптических плотностей при детекции набором реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» на присутствие ротавируса А не превышали фоновых, то есть значений, полученных в результате измерения оптической плотности в контрольных отрицательных образцах. Два образца, содержащих астровирусы, один образец - норовирус второго генотипа, один образец -аденовирус и два образца, в которых ни один из вышеперечисленных вирусных патогенов обнаружен не был, продемонстрировали положительные показатели оптической плотности. Следует отметить, что в образцах, в которых ни один из вирусных патогенов ранее обнаружен не был, положительные сигналы были зарегистрированы только в одном из повторных исследований (табл. 2). Таким образом, специфичность комплекта реагентов «Ро-тавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» составила 93,2%.
В ходе проведения испытаний оценивали воспроизводимость результатов, полученных при использовании испытуемого комплекта реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» на клиническом материале - все образцы были исследованы трехкратно в различных опытах для определения варьирования результатов. Практически во всех случаях были получены схожие результаты: тест-система выявляла все отрицательные и положительные пробы одинаково. Исключение составили две пробы, в которых ранее не были выявлены ни один из вирусных патогенов: в одном из повторов для обоих образцов значения оптической плотности превысили ОПкрит. Следует отметить, что превышение было незначительным (табл. 2). Таким образом, воспроизводимость результатов составила 98,8%.
Результаты проведенных испытаний показали, что испытуемый набор реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» по своей диагностической эффективности -специфичности, чувствительности и воспроизводимости - сопоставим с имеющимися в РФ диагности-
Е
БИО
ЕПАРАТЫ
ческими тест-системами, что позволяет прогнозировать диагностическую достоверность результатов при использовании исследованного набора реагентов «Ро-тавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» для выявления антигена ротавируса группы А в клиническом материале.
Литература
1. Богомолов Б.П. // «Инфекционные болезни: неотложная диагностика, лечение, профилактика». - М., Нью-диамед. - 2007.
2. Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В.// «Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротави-русная инфекция». - С.-Пб., Лань. - 2000.
3. Жираковская Е.В., Тикунов А.Ю., Боднев O.A., и др.// «БИОпрепараты». - 2008 - № 2. - с. 15 - 18.
4. Жираковская Е.В., Малеев В.В., Боднев A.C. и др. // ЖМЭИ - 2008 - №.4. - с. 12 - 16.
5. Игнатюк Т.Е., Голутвин И.А., Насикан Н.С., и др. // «Вопросы вирусологии». - 2003. - т. 48. - №6.- с. 1721.
6. Новикова H.A., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чуп-рова А.Б. // «Вопросы вирусологии». - 2007. - т.52. -№ 3 - с. 19-23.
7. Подколзин А.Т., Мухина A.A., Шипулин Г.А., и др.//
«Инфекционные болезни». - 2004. - т. 2. - № 4. - с. 85 -91.
8. Подколзин А.Т., Фенске Е.Б., Абрамычева Н.Ю., и др.// «Терапевтический архив». - 2007. - т. 79. - № 11. -с. 10-16.
9. Сергевнин В.И., Вольдшмидт Н.Б., Сармометов Е.В., и др. // «Эпидемиология и инфекционные болезни». -2004.-№ 6.-с. 17-20.
10.Сергевнин В.И., Вольдшмидт Н.Б., Сармометов Е.В., и др. // Гигиена и санитария. - 2007. - № 1. - с. 56 -58.
11. Arcangeletti М.С., De Conto Е, Pinardi F., at al. // Acta Biomed. Ateneo. Parmense. - 2005. -V. 76 (3). - P. 165 -170.
12.Gladstone B.P., Iturriza-Gomara M., Ramani S., at al. // Epidemiol. Infect. - 2008. V. 136(3). - P. 399-405.
13. Min B.S., NohYJ., Shin J.H., atal. //J. Virol. Methods. -2006. - V. 137 (2). - P. 280 - 286.
14. Santos N., Honma S., Timenetsky Mdo C., at al. //J. Clin. Microbiol. - 2008. V. 46 (2). - P. 462 - 469.
15.Schets F.M., van Wijnen J.H., Schijven J.F., at al. //Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - V. 74 (7). - P. 2069 - 2078.
16. Stockman L.J., Staat M.A., Holloway M., at al. // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V. 46 (5). - P. 1842 - 1843.
Оценка чувствительности и специфичности комплекта реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ»
Таблица 1
№п/п Кол-во образцов Результаты детекции препаратами сравнения IDEIA Rotavirus Астро-ПЦР Hopo 2-ПЦР Адено-ПЦР Результаты детекции набором «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ»
1. 30 30 0 0 0 30
2. 15 0 15 0 0 2
3. 14 0 0 14 0 1
4. 15 0 0 0 15 1
5. 30 0 0 0 0 0
Оценка специфичности комплекта реагентов «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ>-
Таблица 2
No
1. 2.
3.
4.
ПЦР АмплиСенс
rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus
IDEIA Rotavirus DakoCytomation ОПКрит = 0,150
0,443 1,306 0,676 0,418
Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ ЗАО «Вектор-Бест»
ОПКрит ОПКрит ОПКрит
0,250 0,263 0,251
> 4,000 > 4,000 > 4,000 3,926 > 4,000 3,939
> 4,000 > 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000 > 4,000
£Сентябрь
-декабрь 2009 г.
№
5.
6.
7.
8.
9.
10. 11. 12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20. 21. 22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
ПЦР
АмплиСенс
rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus rotavirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus
IDEIA Rotavirus DakoCytomation ОПКрит = 0,150
0,401 0,322 1,659 0,566 0,518 1,278 1,285 0,809 1,160 0,407 0,218 0,703 1,889 1,069 1,302 0,879 1,842 0,747 0,793 1,013 1,124 0,670 0,726 0,683 0,814 0,997 0,206 0,052 0,050 0,034 0,040 0,048 0,040
Ротавирус-
ЗАО
ОПКрит 0,250
3,870
3,991
> 4,000 3,933 3,987 3,918 3,853 3,972
> 4,000 3,864 3,879 3,897 3,800
> 4,000 3,981
> 4,000
> 4,000
> 4,000 3,713
> 4,000
> 4,000 4.000
> 4,000 3,989
> 4,000 3,872 0,088 0,103 0,230 0,240 0,268 1,819 0,062
антиген-ИФА-БЕСТ «Вектор-Бест»
ОПКрит ОПКрит 0,263 0,251
> 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000 3,821 3,899
> 4,000 3,964 3,845 3,923 3,962 3,871
> 4,000 3,929
> 4,000 3,881 3,884 > 4,000
> 4,000 > 4,000 3,800 3,851 3,818 >4,000
> 4,000 > 4,000
> 4,000 3,995
> 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000 3,837 3,839
> 4,000 > 4,000
> 4,000 > 4,000
> 4,000 3,986
> 4,000 > 4,000
> 4,000 3,998
> 4,000 > 4,000
> 4,000 3,823 0,063 0,073 0,054 0,061 0,255 0,250 0,256 0,244 0,278 0,560 1,117 1,235 0,052 0,052
Н
DPLTAPATH
№
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60. 61. 62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
mxp
AMnjinCeHC
astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus astrovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus norovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus
IDEIA Rotavirus DakoCytomation OIIKpHT = 0,150
0,043 0,043 0,041 0,052 0,040 0,046 0,041 0,040 0,037 0,039 0,030 0,045 0,032 0,030 0,037 0,042 0,034 0,039 0,043 0,043 0,045 0,039 0,050 0,034 0,050 0,043 0,050 0,042 0,041 0,042 0,038 0,047 0,039
PoTaBHpyc-aHTHreH-HOA-EECT 3AO «BeKTop-EecT»
OnKpHT OnKpHT OIIKpHT
0,250 0,263 0,251
0,115 0,075 0,082
0,053 0,046 0,058
0,233 0,198 0,189
0,144 0,105 0,128
0,243 0,062 0,073
0,043 0,040 0,046
0,069 0,043 0,041
0,143 0,044 0,058
0,220 0,206 0,230
3,475 2,577 2,405
0,223 0,247 0,240
0,232 0,236 0,231
0,048 0,042 0,041
0,121 0,085 0,093
0,132 0,111 0,174
0,122 0,052 0,063
0,061 0,044 0,054
0,073 0,035 0,048
0,089 0,046 0,046
0,047 0,043 0,044
0,041 0,039 0,044
0,083 0,046 0,038
0,168 0,074 0,097
0,247 0,118 0,099
0,248 0,251 0,242
0,243 0,259 0,250
0,054 0,048 0,055
0,048 0,040 0,037
0,058 0,045 0,046
0,053 0,045 0,049
0,069 0,058 0,065
0,912 0,344 0,379
0,089 0,037 0,042
-декабрь 2009 г.
№
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80. 81. 82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100. 101. 102.
103.
104.
ПЦР АмплиСенс
adenovirus adenovirus adenovirus adenovirus отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц отриц
IDEIA Rotavirus DakoCytomation ОПКрит = 0,150
0,040 0,044 0,039 0,041 0,260 0,044 0,046 0,042 0,047 0,041 0,039 0,048 0,055 0,035 0,039 0,040 0,041 0,033 0,046 0,049 0,048 0,038 0,039 0,029 0,037 0,036 0,043 0,043 0,039 0,042 0,034 0,037 0,041 0,036
Ротавирус - антиген- ИФА-БЕСТ ЗАО «Вектор-Бест»
ОПКрит О П Крит ОПКрит
0,250 0,263 0,251
0,105 0,042 0,043
0,046 0,143 0,133
0,227 0,045 0,042
0,065 0,068 0,054
0,125 0,039 0,042
0,196 0,191 0,182
0,209 0,170 0,154
0,316 0,071 0,073
0,058 0,043 0,049
0,171 0,056 0,061
0,049 0,060 0,064
0,047 0,062 0,065
0,058 0,047 0,066
0,073 0,072 0,066
0,188 0,120 0,109
0,180 0,074 0,072
0,057 0,063 0,058
0,047 0,060 0,047
0,162 0,146 0,143
0,248 0,248 0,260
0,063 0,066 0,104
0,247 0,223 0,251
0,054 0,053 0,070
0,242 0,240 0,248
0,073 0,061 0,103
0,066 0,065 0,064
0,108 0,123 0,192
0,072 0,067 0,071
0,079 0,079 0,087
0,104 0,079 0,164
0,169 0,150 0,162
0,140 0,166 0,146
0,114 0,133 0,131
0,251 0,241 0,234
s
