CC BY
86
СПОРТИВНАЯ МЕДИЦИНА
ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА СПОРТСМЕНОВ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ
ТРЕНИРОВОЧНОГО ПРОЦЕССА
В.А. ШЛЕПЦОВА, факультет фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова;
Н.В. МАЛЮЧЕНКО, М.А. КУЛИКОВА, М.А. ТИМОФЕЕВА, биологический факультет
МГУ им. М. В. Ломоносова; А.М. ВЕДЯКОВ, А.Г. ТОНЕВИЦКИЙ, Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта
Аннотация
Тренировочный процесс спортсменов сопряжен с постоянным стрессом, как психологическим, так и физическим. В период интенсивных тренировок происходит истощение иммунной системы и реактивация латентных инфекций (ВЭБ, ВГЧ6). В данном исследовании было изучено изменение концентрации sIgA в зависимости от тренировочного процесса. В исследовании приняли, участие 58 спортсменок синхронного плавания, активно выступающих, имеющих спортивный разряд от первого до мастера спорта международного класса. В качестве диагностического материала использована слюна. Выявлено снижение sIgA во время интенсивных тренировок по сравнению с обычными тренировками. Изучение специфического иммунитета к ВЭБ и ВГЧ6 показало повышение концентрации специфического sIgA против белков реактивации вирусов и снижение концентрации специфического sIgA против белков латентной фазы.
Abstract
Training process of sportsmen is interfaced to constant stress both psychological, and physical. There is an exhaustion of immune system and reactivation of latent infections (VEB, HHV6) during intensive trainings. In this research change of concentration sIgA depending on training process has been studied.
In investigation has taken part 58 sportswoman synchronised swimming actively acting, having the sports category from the first sports up to the master of the international class. the saliva is used as a diagnostic material. Decrease of sIgA is revealed during intensive trainings in comparison with usual trainings. Studying of specific immunity to VEB and HHV6 has shown increase of concentration specific sIgA against proteins of reactivation viruses and decrease in concentration specific sIgA against proteins of a latent phase.
Ключевые слова: спортсмены, интенсивные тренировки, иммунитет, слюна, sIgA - секреторный иммуноглобулин А, ВЭБ - вирус Эпштейн-Барр, ВГЧ6 - вирус герпеса человека 6 типа.
Введение
Одной из основных проблем современного спорта является ухудшение результативности спортсменов на ответственных соревнованиях, которая связана с развитием симптомов острых респираторных вирусных инфекций
(ОРВИ). При исследовании взаимосвязи интенсивных тренировок и развития ОРВИ было высказано предположение, что усиленные физические нагрузки могут подавлять различные компоненты иммунной системы [5; 9; 10; 19]. Существуют трудности при определении иммунного статуса спортсменов, так как показатели иммунитета ат-
ШИШ
летов находятся на более низком уровне по сравнению с таковыми в общей популяции. В ряде исследований при изучении клеточного иммунитета замечено различие в ответе некоторых показателей: увеличение клеток натуральных киллеров (NK-клеток) и снижение нейтрофилов [23]. Было показано также снижение sIgA [8; 21; 14; 15]. Известно, что во время таких изменений иммунитета повышается риск проявления инфекций. В период интенсивных тренировок, длящихся обычно 3-72 часа, происходит значительное снижение иммунитета, увеличивается риск проникновения патогенных микроорганизмов и реактивации дремлющих (латентных) инфекций [16].
В последние годы высказывается предположение о развитии инфекционного процесса у спортсменов в результате реактивации латентных вирусов [7]. Наиболее распространены латентные инфекции, вызываемые вирусом герпеса, к которым относится вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ) и вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ6). Распространенность данных вирусов составляет около 90% населения. Реактивация данных вирусов может протекать как бессимптомно, так и с малыми проявлениями гриппоподобного характера или даже с развитием тяжелых заболеваний [1; 3]. Во многих исследованиях была замечена реактивация латентных вирусов герпеса во время стресса как при эмоциональном перенапряжении (например, экзамены), так и при интенсивных физических нагрузках (например, интенсивные тренировки перед ответственными соревнованиями) [20; 24; 17]. Для точности определения реактивации латентных инфекций представляется целесообразным проводить изучение состояния здоровья спортсменов, находящихся в экстремальных условиях тренировочного процесса и испытывающих разнообразные виды нагрузок (психологические, физические).
Обычно для диагностики данных заболеваний и состояния организма в целом проводятся исследования биологических жидкостей организма. Широко распространены общий, биохимический, иммунологический анализы крови, анализ мочи. В последнее время все более распространенным диагностическим материалом становится слюна. Данный диагностический материал имеет ряд особенностей по сравнению с другими биологическими жидкостями, которые заключаются в несложности забора слюны, доступности и гигиенической безопасности данного метода как для пациентов, так и для медицинского персонала, и, самое главное, слюна отражает местный иммунитет слизистых [2; 11; 12; 25].
Наиболее доступным и надежным способом исследования изменений иммунитета является определение в слюне концентрации общего секреторного иммуноглобулина А (sIgA), являющихся первой линией защиты против различных микроорганизмов. Наиболее важными свойствами sIgA являются стойкость к действию протеаз, что делает возможным его функционирование в секретах слизистых оболочек. sIgA способен препятствовать адгезии микроорганизмов, их токсинов, бактериальных и пищевых аллергенов на эпителиаль-
ные слизистые оболочки, что блокирует их проникновение во внутреннюю среду организма [5].
Материалы и методы
Объект исследования
В работе исследовали группу спортсменок сборной России по синхронному плаванию. Всего обследовано 58 активно выступающих спортсменок от 8 до 17 лет, имеющих спортивный разряд от первого до мастера спорта международного класса. В исследовании проводилось сравнение вирусной нагрузки и иммунного статуса каждой спортсменки на различных этапах тренировочного процесса: за несколько месяцев до соревнований - I группа, за несколько дней до соревнований - II группа, через несколько дней после соревнований - III группа.
Исследование одобрено этическим комитетом ВНИИФК.
Диагностический материал
У спортсменов производился забор слюны. Сбор слюны производился при помощи тампонов «Salivette» фирмы «Sarstedt» (Германия). За один час до забора слюны не рекомендуется курить, есть, пить ничего, кроме воды. Пациент в течение двух минут жевал ватный тампон, после чего тампон помещался в контейнер и закрывался пластиковой крышкой. Контейнер вкладывался в пластиковую пробирку, и слюну собирали на дне пробирки в результате центрифугирования в течение четырех минут со скоростью 5000 об./мин при 4 °С. Исследуемые образцы хранились при температуре -20 °С [13].
Иммуноферментный анализ
Определение общего sIgA слюны
Производилось определение общего sIgA слюны как главного маркера изменения местного иммунитета методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА). Для определения sIgA в слюне использована тест-система «sIgA векто-бест А8668» фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Пробы слюны разводили в 2000 раз. На плашке иммобилизованы моноклональные антитела к секреторному компоненту sIgA. В работе использован конъюгат в a-цепи sIgA. В качестве хромогена использовался тетраметилбензидин (ТМБ).
Определение специфического sIgA к вирусу ВЭБ и ВГЧ6 проводилось ТФИФА. Для определение были использованы модернизированные (измененные) тест-системы «век-тоВЭБ-VCA-IgM-стрип» и «вектоHHV-6-IgG-стрип». Для очищения слюны от IgG использоавли протеин G-сефаро-зу (Sigma, США). Очищение слюны от IgM проводили путем связывания IgM с поликлональной сывороткой, направленной к IgM (Sigma, США), и последующей отмывкой.
Определение специфических антител sIgA к ВЭБ и ВГЧ6 проводили на плашках «вектоВЭБ-VCA-IgM-
I группа II группа III группа
Рис. 1. Зависимость концентрации sIgA от этапа тренировочного процесса, р<0,05
стрип» и «вектоHHV-6-IgG-стрип» соответственно с использованием слюны, очищенной от IgG и ^М. На плашке иммобилизованны антигенами к ВЭБ (очищенный рекомбинантный белок EBNA-1 р72) для определения специфических антител к ВЭБ. На плашке для определения ВГЧ6 иммобилизованы очищенные рекомбинантные белки р41 и р100. На плашку с иммобилизованными антигенами к ВЭБ и ВГЧ6 наносили неразведенные пробы. В качестве контроля использовалась неочищенные пробы слюны. Был использован конъюгат - моноклональные антитела к а-цепи 8^А. Хромоген - ТМБ.
Результаты
Исследование sIgA в слюне
В нашей работе в качестве одного из показателей иммунного статуса организма было исследовано содержание 8^А в образцах слюны. Определение концентрации sIgA в слюне проводилось с помощью ТФИФА. При исследовании общего sIgA в группах замечено следующее распределение: до соревнований концентрация sIgA составила 75,75 мг/л; во время соревнований - 28,11 мг/л; после соревнований - 143,63 мг/л. Минимальная концентрация - 28,11 мг/л вещества замечена в группе спортсменок, находящихся на стадии интенсивных тренировок. При рассмотрении групп сравнения выявлена
такая же закономерность в трех группах. До соревнований концентрация sIgA в среднем по группе находилась на уровне 67,7 мг/л. Во II группе наблюдалась снижение концентрации sIgA - 42,6 мг/л. В III группе - после соревнований - концентрация возрастает почти в три раза по сравнению с установленной нормой и составляет 157,88 мг/л (см. рис. 1). В исследовании обнаружено снижение концентрации sIgA при интенсивных физических нагрузках по сравнению с концентрацией sIgA при средней интенсивности тренировок. Таким образом, обнаружена связь интенсивности тренировок с изменением активности местного иммунитета.
Исследование специфического sIgA к ВЭБ и ВГЧ6 в слюне
В изучении латентных инфекций важную роль играет серодиагностика данных инфекций, в частности специфический иммунитет к вирусам Эпштейн-Барр и герпеса человека 6 типа. В работе были рассмотрены изменения показателей специфического иммунитета к вирусу Эпштейн-Барр и герпесу человека 6 типа.
Для исследования ВЭБ были определены sIgA двум антигенам к EBNA- 1(нуклеарный антиген) и к VCA (поверхностный антиген). При исследовании EBNA-1 ВЭБ выявлено: в первой группе - 3,57 мкг/л, во второй - 3,06 мкг/л, в третьей - 5,49 мкг/л (р<0,5) (см. рис. 2). Обнаружено снижение концентрации sIgA к EBNA-1 во время
I группа II группа III группа
Рис. 2 Определение специфического sIgA EBNA-1 в зависимости от этапа тренировочного процесса, р<0,05
I группа II группа III группа
Рис. 3. Изучение специфического sIgA VCA на разных этапах тренировочного процесса.
интенсивных тренировок. Изучение группы контроля выявило следующие показатели в трех группах: I - 2,9 мкг/л, II - 2,75 мкг/л, III - 3,45 мкг/л (р<0,05). Для более точного определения необходимо изучить состояние специфического иммунитета во время фазы реактивации. Основным белком стадии реактивации является VCA. При исследовании VCA sIgA проводилась качественная оценка (наличие или отсутствие данного белка у пациента). При изучении VCA sIgA было получено, что в первой группе эти антитела были выявлены у 7% (4 человека) наличие sIgA в слюне, во второй - 27% (16 человек), в третьей - 15% (9 человек) исследуемых (см. рис. 3). Наличие VCA sIgA в группе контроля обнаружено только во II и III группах: одна спортсменка во время соревнований, одна спортсменка после соревнований.
При изучение 8^А, специфичного к ВГЧ6, получены другие результаты: I группа - 14,25 мкг/л; II группа -17,22 мкг/л; III группа - 2,41 мкг/л (р<0.05) (см рис. 4). В группе контроля: I группа - 1,7 мкг/л, во II и III группах - 1,8 мкг/л (р<0,05).
Полученные данные свидетельствуют о повышении концентрации специфического 8^А к белкам реактивации вирусов во время соревнований и уменьшение концентрации EBNA-1 к ВЭБ.
Обсуждение
Спортивная деятельность связана с постоянными психологическими и эмоциональными перегрузками. Основной пик интенсивности тренировок приходится на пери-
Рис. 4. Определение специфического к вирусу герпеса человека 6 типа на разных этапах тренировочного процесса, р<0,05
од перед соревнованиями. Адаптация спортсменов к таким тренировкам обеспечивается функциональными сдвигами, нарушением системы гомеостаза. Исследования последних лет показали, что при систематическом воздействии физических факторов в первую очередь именно иммунная система участвует в формировании адаптационных реакций в ответ на эти воздействия. Нарушение иммунного гомеостаза при больших тренировочных нагрузках может привести к перенапряжению организма, что обуславливает снижение резистентности организма к воздействию факторов внешней и внутренней среды [6; 18].
В нашем исследовании показано, что во время соревнований (интенсивные тренировки) происходит снижение иммунной активности организма (уменьшение концентрации 8^А во II группе) как в группе исследуемых, так и в группе контроля. При наличии стрессовой ситуации (в данном случае соревнований) в организме происходит ряд биохимических процессов: усиление работы гипота-ламо-гипозарно-надпочечниковой системы. Происходит быстрое нарастание секреции в крови глюкокортикои-дов, которое вызывает лизис тимико-лимфоидной ткани и острый выброс антител из разрушенных лимфоидных клеток. Это ведет к нарушению кооперации клеток иммунной системы, происходит выраженная супрессия Т- и В-систем иммунитета [4; 6]. Наличие таких перестроек приводит к истощению иммунной системы. Важно отметить, что после соревнований активность иммунитета значительно выше, чем во время усиленных тренировок и даже при тренировках средней интенсивности. Увеличение концентрации 8^А после соревнований, возможно, свидетельствует об усилении активности иммунитета вследствие «удаления» стрессового фактора. Именно реактивация латентных инфекций является основным проявлением снижения иммунитета.
Увеличение концентрации 8^А к VEB, обнаруженное в исследовании, может свидетельствовать об акти-
вации иммунитета организма. При исследовании полученных результатов замечено снижение концентрации 8^А, специфичного к ВЭБ (EBNA-1) во второй группе. Sculley Й а1. исследовал изменения титра специфичных антител к ВЭБ и показал, что титр антител к EBNA-1 остается на прежнем уровне или слегка снижается при реактивации вирусов [22]. Обнаружение снижения специфических антител к EBNA-1 свидетельствует о возможной реактивации вируса. Для подтвреждения данной гипотезы в исследовании изучено состояние специфического иммунитета к белкам фазы реактивации вируса. Исследование концентрации 8^А к VCA выявило увеличение процента встречаемости специфических антител в исследуемой группе. Наличие VCA подтверждает реактивацию ВЭБ.
Было замечено повышение специфического 8^А к ВГЧ6 во второй группе, что характерно для реактивации данного вируса во время интенсивных физических нагрузок.
При исследовании групп контроля не было выявлено изменения концентрации 8^А против белков вирусов на разных этапах тренировочного процесса.
В исследовании изучено влияние физических нагрузок на состояние иммунитета. В работе были выявлены некоторые маркеры реактивации латентных инфекций, которые позволяют достаточно точно определить реактивацию данных вирусов. Данное исследование имеет большое практическое значение. Мониторинг состояния иммунитета позволит спортсменам и их тренерам найти оптимальные условия тренировок, когда активность иммунитета будет способствовать улучшению спортивных достижений атлетов.
Работа была поддержана государственным контрактом 02.467.11.3001 и 02.438.11.7049 Министерства образования и науки Российской Федерации и Программой «Фундаментальные науки - медицине» Президиума РАН.
Литература
1. Данилюк Н.К. Вирус Эпштейн - Барр и серодиагностика связанных с ним заболеваний // Информационный бюллетень «Новости “Вектор-Бест”» - 2000. - № 4 (18).
2. Денисов А.Б. Слюнные железы. Слюна. - М.: Изд. РАМН. - 2003.
3. МалашенковаИ.К., Дидковский Н.А., СарсанияЖ.Ш., Жарова М.А., Литвиненко Е.Н., Щепеткова И.Н., Чистова Л.И., Пичужкина О.В., Гусева Т.С., Паршина О.В. Клинические формы хронической Эпштейн-Барр-вирус-ной инфекции: вопросы диагностики и лечения // Лечащий врач. - 2003. - № 09.
4. Потешкина Е.Е., Позднякова Р.З., Манукян Л.М. Пособие по лабораторной клинической иммунологии. -М.: Изд. РУДН. - 2003.
5. Таймазов В.А., Цыган В.Н., Мокеева Е.Г. Спорт и иммунитет. - СПб.: Олимп СПб, 2003.
6. Футорный С.М. Иммунологическая реактивность спортсменок как одно из направлений современной спортивной медицины // Научно- технический журнал. -2004. - № 1.
7. Cox A.J., Gleeson M. Pyne D.B., Saunders P.U., Clancy R.L., Fricker P.A. Valtrex therapy for Epstein-Barr virus reactivation and upper respiratory symptoms in elite runners // Med. Sci. Sports Exerc. - 2004, Jul; 36 (7): 1104-10.
8. Dimitriou L., Sharp N. C. C., Doherty M. Cortisol and IgA in well trained swimmers Circadian effects on the acute responses of salivary // Br. J. Sports Med. - 2002. - № 36. - P. 260-264.
9. Gleeson M. Mucosal immunity and respiratory illness in elite athletes // Int. J. Sport Med. - 2000. - № 21. -P. 33-43.
10. Gleeson M., Pyne D., Austin J., Francis J., Clancy R. Epshtein-Barr virus reactivation and upper-respiratiry illness in elite swimmers // Medicine and Science in Sport and Exercise. - 2001. - № 6. - P. 411-417.
11. Hofman H. Human Saliva as a Diagnostic Specimen // J. Nutr. - 2001. - № 131. - P. 1621-1625.
12. Hold K., Douwe de Boer, Zuidema J., Robert A., Maes A. Saliva as an analytical tools in toxicology // Internaltional journal of drug testing. - 1999. - № 6.
13. Lenander-Lumikari M., Johansson I., Vilja P., Samaranayake L.P. Newer saliva collection methods and saliva composition: a study of two Salivette kits // Oral Dis. -1995. - № 1(2). - P. 86-91.
14. Mackinnon L.T., Ginn E., Seymour G.J. Decreased salivary immunoglobulin A secretion rate after intense interval exercise in elite kayakers // Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. - 1993. - № 67(2). - P. 80-84.
15. Mouton C., Fillion L., Tawadros E., Tessier R./ Salivary IgA is a weak stress marker // Behav Med. - 1989. -№ 15 (4). - P. 179-85.
16. Nieman D.C. Immunity in Athletes: Current Issues // Sport science exchange. - 1998. - № 2.
17. Payne D.A., Mehta S.K., Tyring S.K., Stowe R.P., Pierson D.L. Incidence of Epstein-Barr virus in astronaut saliva during spaceflight // Aviat Space Environ Med. -1999. - № 70 (12). - P. 1211-1213.
18. Pedersen B.K., Rohde T., Zacho M. Immunity in athletes // J. Sports Med. Phys. Fitness. - 1996. - № 6 (4). -P. 236-245.
19. Peters E.M. Exercise, immunology and upper respiratory tract infections // Int. J. Sports Med. - 1997. -№ 18. Suppl 1. - P. 69-77.
20. Pierson D.L., Towe R.P., Phillips T.M. et al. Epstein-Barr virus shedding by astronauts during space flight. Patterns of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in 32 astronauts and 18 healthy age-matched control subjects were characterized by quantifying EBV shedding // Brain Behav Immun. - 2005.
21. Sarid O., Anson O., Yaari A., Margalith M. Epstein-Barr specific salivary antibodies as related to stress caused by examinations // Journal of Medical Virology. - 2001. -№ 64. - P. 149-156.
22. Sculley T.W., Walker P.J., Moss D.J., Pope J.H. Identification of Multiple Epstein-Barr Virus-induced Nuclear Antigens with Sera from Patient with Rhematoid Arthritis // J. Virology. - 1984. - № 52. - P. 88-93.
23. Smith J.A., and Pyne D.B. Exercise, training, and neutrophil function // Exercise Immunol. Rev. - 1997. - № 3 -P. 96-117.
24. Stowe R.P., Pierson D.L., Barret A.D.T. Elevated Stress Hormone Levels Relate to Epstein-Barr Virus Reactivation in Astronauts // Psychosomatic Medicine. -2001. - № 63. - P. 891-895.
25. Streckfus C.F., Bigler L.R. Saliva as a diagnostic fluid // Oral Dis. - 2002. - № 8 (2). - P. 69-76.
