CC BY
53
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОСОБЛИВОСТ1 ПОЗАКЛ1ТИННО1 РЕДУКЦИ ХРОМАТУ ДР1ЖДЖАМИ
PICHIA GUILLIERMONDII
Кшемтська Гелена Петр1вна
1нститут бюлоги клтини НАН Украши, Кандидат б1олог1чних наук, Старший науковий ствробтник в1дд1лу
аналтичног бготехнологИ Гайда Галина Зуфаргвна
1нститут бюлогп клтини НАН Украши, Кандидат хгмгчних наук, старший науковий ствробтник, Старший
науковий ствробтник в1дд1лу аналтичног бготехнологИ
1ваш Маргя Федор1вна
1нститут бюлоги клгтини НАН Украши, 1нженер в1дд1лу аналтичног бготехнологИ
Гончар Михайло Васильович
1нститут бюлогп клгтини НАН Украши, Доктор бюлог1чних наук, професор, Завгдувач в1дд1лу аналтичног
бютехнологи
ОСОБЕННОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ РЕДУКЦИИ ХРОМАТА ДРОЖЖАМИ PICHIA GUILLIERMONDII Кшеминская Гелена Петровна, Институт биологии клетки НАН Украины, Кандидат биологических наук, Старший научный сотрудник отдела аналитической биотехнологии
Гайда Галина Зуфаровна, Институт биологии клетки НАН Украины, Кандидат химических наук, старший научный сотрудник, Старший научный сотрудник отдела аналитической биотехнологии
Иваш Мария Федоровна, Институт биологии клетки НАН Украины инженер отдела аналитической биотехнологии Гончар Михаил Васильевич, Институт биологии клетки НАН Украины, Доктор биологических наук, профессор Заведующий отделом аналитической биотехнологии
THE DETAILS OF EXTRA-CELLULAR CHROMATE REDUCTION BY THE YEASTS PICHIA GUILLIERMONDII Ksheminska H.P., Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine, PhD, biology, senior scientist of department of analytical biotechnology
Gayda G.Z., Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine PhD, chemistry, senior scientist, Senior scientist of department of analytical biotechnology
Ivash M.F., Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine, Engineer of department of analytical biotechnology
Gonchar M.V., Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine doctor of biology, professor, Heard of department of analytical
biotechnology
АНОТАЦ1Я
Дослгджено динамку позаклтинног редукцИ екзогенного хромату неконвенцтними флавтогенними дргжджами Pichia guilliermondii в залежност1 вгд умов гх культивування. Встановлено наявтсть двох типгв секреторних мета-болтгв, що володгють хромат-редукуючою активтстю. Розроблено способи концентрування, фракцюнування та характеристики хромат-редукуючих компонент1в позаклтинноИ р1дини з метою встановлення гх природи.
Ключовi слова: др1ждж1 Pichia guilliermondii, редукц1я хромату, секреторт метаболти др1ждж1в. АННОТАЦИЯ
Изучена динамика внеклеточного восстановления экзогенного хромата неконвенционными флавиногенными дрожжами Pichia guilliermondii в зависимости от условий их культивирования. Виявлено наличие двух типов секреторных метаболитов, способных восстанавливать хромат. Разработаны способы концентрирования, фракционирования и характеристики хромат-редуцирующих компонентов культуральной жидкости с целью установления их природы.
Ключевые слова: дрожжи Pichia guilliermondii, редукция хромата, секреторные метаболиты дрожей. Summary: The experimental data concerning the study of extra-cellular chromate reduction by non-conventional yeast Pichia guilliermondii are represented. The dynamics of cells growth in the presence of chromate, extra-cellular chromate reduction by organic components, secreted by yeast cells, were analyzed. Some approaches for concentration, fractionation and characterization of secreted yeast metabolites possessed the chromate reducing activity were developed. Key words: yeast Pichia guilliermondii, chromate reduction, extra-cellular yeast methabolites.
Постановка проблеми у загальному вигляд та Н зв'язок 1з важливими науковими чи практичними завдан-нями. Дослщження процеав редукци хромату др1жджами е актуальним як для розробки нових метод1в контролю за забрудненням довшлля 1 бюремед1ацп спчних вод, так 1 для з'ясування молекулярних мехашзм1в резистентносп еукарютичних клггин при дп стресових, зокрема, токсич-них фактор1в [1-3].
Аналiз останшх дослщжень i публжацш, в яких за-початковано розв'язання дано! проблеми, на яш поси-лаеться автор. В останш роки доведено, що толерантшсть дрiжджiв до хромату безпосередньо пов'язана Í3 здатшстю клггин чинити отр сполукам Cr(VI) стосовно !х акумуляци, а також редукувати Cr(VI) [4-5]. У хромат-ре-зистентних штамГв дргжджгв Candida maltosa, видшених Í3 спчних вод, що мютили хромат, виявлено NADH-залежну
хромат-редукуючу актившсть, зв'язану з розчинними та мембранними бшками [6]. Селекцiоновано резистентнi до хромату мутанти дрГждж1в РюЫа guilliermondii, як реду-кували 80-90% токсичного 0"(УТ) до менш токсичного Сг(111) [7-10].
В попередшх достижениях на моделi дрГждж1в Sассharomyces cerevisiae та Р. guilliermondii нами вияв-лено феномен позаклиинно! редукцп хромату (ПРХ) як результат клгтинного метаболiзму [8-13]. Показано, що рiзнi типи дрiжджiв - пекарсьш та неконвенцiйнi здатнi детоксикувати хромат шляхом ПРХ: Сг(У1) ^ Сг(У) ^ Сг(111) з утворенням по меншiй мiрi двох форм стабГльних розчинних бiокомплексiв - Сг(Ш)-бюхелата [9]. При ростi дрiжджiв у присутносп 0,5-1 мМ 0"(УТ), в культуральнш рiдинi (КР) в мiру падiння рiвня Сг(У1) i утворення Сг(Ш), в спектрах ЕПР появлявся тк парамагнiтного штерме-дiату Сг(У) [10]. При повному вiдновленнi Сг(У1) значна доля сполук хрому (понад 90% вiд вихвдного рiвня хромату) залишалась у КР [11]. Додатковим тдтвердженням визначально! ролi секреторних метаболтв в процесi редукцп хромату слугуе здатнiсть культурально! рщини дрiжджiв Р. guilliermondii самостiйно, без учасп клiтин, вiдновлювати хромат [12].
Видшення невирiшених ранiше частин загально! проблеми. Перелiченi данi дозволяють розглядати процес ПРХ як дуже важливий шлях детоксикацп Сг(У1) культурами др1ждж1в i критично переосмислити загальноприй-няту концепцш про внутрiшньоклiтинний мехашзм детоксикацп Сг(У1). Дослiдження, здшснеш в останнi роки iншими дослщниками, засвгдчили, що продукти редукци хромату мшрооргашзмами складаються з наночастинок Сг203 та органiчних сполук [14]. Результати здшснених нами хроматографiчних та електрофоретичних дослщ-ження Cr(III)-бiокомплексiв показали, що в !х склад мо-жуть входити бiлки [11]. Але на даний час неведомо, з яких саме органiчних сполук складаються Сг(Ш)-бюкомплекси та яки речовини культури др1ждж1в вiдповiдають за ПРХ.
Цiль статп. Мета експериментiв, представлених в данш роботi - вивчити особливостi редукцп Сг(УТ) секре-торними метаболiтами дрiжджiв - компонентами КР пiсля вщщлення клiтин, а саме: зясувати вплив умов культи-вування (тривалiсть, склад середовища, наявнiсть деяких iонiв i т.п.) на параметри процесу ПРХ. Розробити методи концентрування, фракцiонування хромат-редукуючих компонента КР та нанокомплексiв оксиду хрому (III) з метою встановлення !х природи.
Виклад основного матерiалу. Матерiали i методи. Об'ектами дослвдження слугували штами флавiногенних дрiжджiв Р. guilliermondii АТСС 201911 (L2) з колекцп мiкроорганiзмiв 1нституту бюлогп клгтини НАН Украши i мутантний штам L2-89, резистентний до 1,5 мМ хромату, який втратив здатнiсть до надсинтезу РФ в умовах де-фiциту залiза в середовищi [7].
ДрГждж вирощували в колбах Ерленмейера на роторному шейкерi при 250 об./хв, температурi 30 °С в синтетичному середовищi Беркгольдера [14], в присутностi гiстидину (40 мг/л). Fe(П) в виглядi солi Мора рочиняли в ЕДТА у молярному сшввщношенш 2:1, вiцповiдно.
В експериментах використовували клгтини в експо-ненцшнш та стацiонарнiй фазах росту. До суспензп клттин з концентрашею 0,3 - 0,5 мг/мл додавали стерильний роз-чин хромату калш Г проводили iнкубацiю за вадповадних температур Г аерацп. Бюмасу визначали турбщиметрично на фотоелектороколориметрГ ФЕК-56М, за оптичною гу-стиною клиинно! суспензп при 540 нм, з наступним пере-рахунком на суху бюмасу клгтин, вадповадно до калГб-рувального графГка.
Bmíct залишкового хромату в КР шд час Гнкубацп дрщджових клiтин з хроматом визначали колориметри-чно дифенiлкарбазидним методом [16], вмют доступного Cr(III) в КР визначали за використання хромазуролу S [17].
Ферихелатредуктазну активнiсть (ФРА) визначали за модифжованим нами методом [18]. До КР додавали розчин а,а-дишридилу в 10 мМ МОРS буферi, рН 6,2, Ре(Ш)-цитрат до 0,5 мМ. За 10 хв реакщю зупиняли рiзким охолодженням (0 0С). ФРА визначали за оптичною густиною кольорового комплексу Fe(П)-o(,а-диmридил. За одиницю ФРА приймали швидк1сть (мМ хв-1) вгднов-лення Fe(III) до Fe(II).
Хроматографгю КР проводили на сорбентi ДЕАЕ-целлюлоза при рН 8,8, в 30 мМ Трис-НС1 буферi за елоюцп 0,5 М NaCl в тому ж буферг Хроматографiчнi фракци аналiзували на здатнiсть редукувати доданий хромат [16], в реакцшнш сумiшi наступного складу: 0,25 мМ хромат, 0,2 мМ НАДН, 50 мМ ацетатний буфер, рН 3.5. Спектральш дослiдження виконували на спектрофото-метрi Shimadzu-UV-1650PC.
Усi дослiди повторювали тричi, а вимiри - у 3-х па-ралелях. У таблицях наведено середнi арифметичнi вели-чини; вщхшення вiд середнього значения не переви-щувало 5%.
Результати та 1х обговорення. У даиiй робоп ре-дукцiю хромату метаболiтами КР, одержано! тсля вида-лення центрифугуванням культивуваних без хромату клiтин, ми умовно називаемо процесом "in vitro", на про-тивагу позаклiтиннiй редукци хромату (ПРХ) культурою дрiжджiв (процес "in vivo").
У попередшх дослщженнях метаболiзму хромату дрiжджами "in vivo", для культивування використовували середовище iз 0,1% дрiжджового екстракту (ДЕ), який частково зшмав токсичну дiю Cr(VI) i стимулював рiст клiтин [8]. Як було показано нами рашше, на середовищi без ДЕ клгтини дрiжджiв значно чутливiшi до хромату [8]. З метою усунення впливу ДЕ на сукупшсть клГтинних ме-таболiтiв, яш зумовлюють ПРХ, експерименти "in vitro" проводили з КР, яку було одержано тсля вирощування дрГжджгв без ДЕ.
В КР дрГжджгв P. guillermondii L2 тзньо! стацюнар-но! фази росту, тсля додавання хромату, спостертаеться швидка та короткочасна (протягом 0,5 - 2 хв) фаза ПРХ, з утворенням Cr(III) як продукту вадновлення Cr(VI) [12]. Контрольний експеримент сввдчив про нездатнiсть компо-нентiв мшерального середовища вiдновлювати хромат. Перший (I, «надшвидкш») етап ПРХ вгдбуваеться, воче-видь, за рахунок х1мГчних реакцш Cr(VI) Гз секреторними метаболiтами КР, яш мають високий редукцшний потен-шал. Шсля 2 хв процес ПРХ значно сповГльнювався (II, «повшьний» етап). I та II етапи вгдрГзняються як за три-валютю - у 120-360 разГв, так i за швидшстю - у 140-300 разГв, вГдповгдно [12]. Ми припускаемо, що II етап ПРХ вгдбуваеться за участю клГтинних метаболтв шшо!, мож-ливо бшково!, природи. Ефектившсть процесу ПРХ ощ-нювали за двома критерГями: за швидшстю зникнення Cr(VI) в КР та сумарною концентрашею вгдновленого хромату (СКВХ).
Доцшьно було зясувати, чи юнуе зв'язок мГж ефек-тившстю ПРХ та тривалютю культивування дрГжджгв («вжом» КР), а також складом ростового середовища i концентрашею доданого Cr(VI). Як видно з результата, поданих на рис. 1, швидшсть ПРХ суттево залежала вГд «вжу» КР, причому швидкосп ПРХ зростали при трива-лому культивуванш дрГжджгв як на I (протягом 2 хв), так i на II (повшьному, тривалому) етапах.
Обидва етапи редукцп залежали також ввд концентраци Сг(У1). Як видно з рис. 1А, спостерпалось майже повне вщновлення 0,5 мМ Сr(VI) при шкубаци iз 5-ти до-бовою КР, однак при додаваннi Сr(VI) до 1 мМ в КР зали-шалась значна кiлькiсть Сr(VI). Швидшсть ПРХ на I етапi та загальна швидшсть (протягом двох, 1+11, еташв), при удвiчi вищiй концентраци Сr(VI), збiльшувалась лише на 30% порiвняно до аналогiчного параметру при 0,5 мМ Сг(УТ), що сввдчить про зменшення потенцшно! здатностi 5-ти добово! КР до ПРХ в цих умовах (рис. 1Б). В попе-редшх експериментах in vivo нами було показано [8-13], що 1 мМ С^У!) гальмуе рют дрiжджiв. Вiдсутнiсть про-порцшно! залежносп швидкостей ПРХ (загально! та на I еташ) вiд концентраци Сг(УТ) (як субстрату), дае подставу припустити, що Сr(VI) iнгiбуе не пльки рiст дрiжджiв, але i актившсть (або синтез) хромат-редукуючих метаболiтiв в КР. Заслуговуе уваги факт, що на II етат ПРХ виявлено пропорцiйну залежнiсть мiж швидк1стю процесу i вих1-дною концентрацiею хромату (рис.1Б): при удвiчi вищiй концентраци субстрату реестрували удвiчi вищу швидшсть ПРХ.
З метою ввдмежування II етапу ПРХ ввд I та до-слвдження параметрiв процесу ПРХ на II етат, проведено
експерименти, в яких передбачено можливють «ввдсь кати» вклад в ПРХ метаболтв, як1 редукували Сr(VI) на I еташ. Для цього до КР, збщнено! метаболггами, що ввдповщають за здiйснення I етапу ПРХ, додавали посль довними порцiями Сг(УТ) до концентрацiй 0,4-0,5 мМ, як не iнгiбують хромат-редуктазну активнiсть КР [12]. При дробному додаванш СгСУТ) виявилося можливим продов-жити II етап ПРХ у часi, тим самим досягти пiдвищення сумарно! концентраци вщновленого хромату (СКВХ).
При додаванш до 5-ти добово! КР хромату до 0,4 мМ виявлено як I, так i II етапи ПРХ, iз швидкостями 140 i 1 мкМхв-1, вiдповiдно (рис. 1В). При дробному додаваннi хромату, кожен раз до 0,4 мМ, тсля повно! його редукцп, достатньо висока швидшсть процесу (1 мкМ хв-1) зберпа-лась протягом 12 год, тсля чого суттево падала (рис. 1В). За рахунок трьохкратного додавання Сг(У1) значно зрос-тала СКВХ - до 1,6 мМ. Сшвввдношення СКВХ на II i - I ому етапах в шнц експерименту складало 5:1 проти 1:2 на початку, за 1 год процесу ПРХ. Таким чином, аналiз швид-костi ПРХ дозволив вщмежувати i докладнiше про-аналiзувати тривалiсть ПРХ i потенцiйну здатнють клгтин-них метаболiтiв до цього процесу, що може служити вихвдним етапом дослвджень по встановленню !х природи.
1,0 0,9 0,8 Ш. 0,7 0,6 я 0,5 I 0,4 £ 0,3 0,2 0,1 0,0
1 2 3 4 5 6 Час культивування, доби
250 7 о 200 | 150
л" 100 | 10
I 5 3 0
ё
ИЛ
I II 1+11
Етапи редукцп
150
125
X ? 100
X г 75
л" 50
Й 25
т
1
т
э 0
5 10 15 20 25 30 35 40 Час реакцм, год
Рис. 1. Параметри процесу ПРХ «ш vitro». А - Залежшсть профiлю динамiки ввдновлення хромату (1 мМ - суцшьт лшп, 0,5 мМ - пунктирнi) вщ часу культивування др1ждж1в (0.3 мг/мл); швидкосп ПРХ визначались протягом 30 с (1), 2 хв (2), 50 хв (3). Б - Швидшсть ПРХ за концентраци хромату 0,5 мМ (чорш стовпчики) i 1 мМ (ари): за 2 хв (I); за наступш 48 хв (II); середня за 50 хв. В - Динамша змш швидкостi при послiдовному додаваннi до КР (позначено
салками) алiквот Сг(У!).
А
в
0
Заслуговуе уваги факт, що токсичну дш Сr(VI) на рют дрiжджiв Р. guШermondп можна модифiкувати in vivo концентрацiею Fe(II) в ростовому середовищi: збiльшення останньо! призводить до пiдвищення резистентностi кштин до Сr(VI) (рис.2). Класичне середовище Беркголь-дера, яке забезпечуе оптимальний рiст клiтин дрiжджiв, мiстить 3,6 мкМ юшв Fe(II).
В умовах надлишку iонiв Fe(II) у присутносп хромату, протiкае окиснення Fe(II) до Fe(III), при цьому юни
Fe(II) можуть спонтанно редукувати Сг(УТ) згiдно з реак-цiею:
3Fe2+ + CrO42- + 8Н + ^ 3Fe3+ + Cr3+ + 4H2O
Для пiдтримання процесу вщновлення хромату, утворенi iони Fe(III) повинш вiдновлюватись. Як ведомо, всi мжрооргашзми, включаючи дрiжджi, мають потужну ферментативну систему редукцп Fe(III), представлену у дажджах S. cerevisiae множиною гешв FRE1-FRE7 [19].
Ре (II), мкМ
Рис. 2. Вплив концентраци юшв Fe(II) в ростовому середовищi на толерантшсть дрiжджiв Р. guiUermondii до С^У!). Клiтини дрiжджiв (20 мкг/мл) вирощували три доби: 1 - без Сг(УТ), 2 та 3 - з 1,0 i 1,2 мМ Сг(УТ), ввдповвдно.
Як видно з рис. 2, при оптимальнш для росту дрщдж1в концентраций Fe(II) в середовищi (3,6 мкМ), спо-стер^али значне пригнiчення росту клiтин у присутносп 1 мМ хромату in vivo. ,nBÍ4Í вища концентpaцiя Fe(II) майже повнicтю знiмaлa токсичну дш 1 мМ Cr(VI). Не-значне пiдвищення концентрацй' хромату (до 1,2 мМ) приводило до суттевого гальмування росту клiтин, але 5-кратне пiдвищення концентрацп Fe(II) - до 18, 0 мМ, су-проводжувалось збiльшенням виходу бiомacи. Не виклю-чено також, що надлишок або дефiцит Fe(II) може впли-вати на пул клiтинних редуктаз, як1 беруть участь в процеа редукцп хромату.
Виходячи з мipкувaнь, що обмiн iонiв Cr(VI) i Fe(II) можуть бути взаемно пов'язаш, доцiльно було дослвдити ПРХ в КР др1ждж1в, культивованих в умовах дефщиту Fe(II) (КР-), без додання Fe(II), тобто, при бшьшо! чутли-воcтi клiтин до токсично! до Cr(VI). КР-, отримана пicля 4 дiб культивування дpiжджiв, повнicтю редукувала 0,5 мМ Cr(VI) in vitro протягом 1-2 хв. Додаткова портя доданого до 0,5 мМ Cr(VI) вiдновлювaлacь поступово (рис. 3А). Протягом 90 хв швидшсть ПРХ становила 3,9 мкМ хв-1, дaлi знижувалась за 4,5 год до 0,5 мкМ хв-1 - до повного зникнення Cr(VI) в КР-. «Над-швидке» зникнення 0,5 мМ Cr(VI) з швидшстю 250 мкМ хв-1, сввдчить про високий piвень метaболiтiв, защяних в ПРХ на I етат. Повторне
додавання Сr(VI) до 0,5 мМ дозволило чгтко вiдмежувати обидва етапи ПРХ та виявити в профш II етапу двi фази (11-1 i 11-2), швидкостi яких були нижчими, нiж на I етат, в 50 i 500 разiв, ввдповвдно.
Виникае, однак, застереження, чи дiйсно пiсля пов-но! ПРХ на I етапi, в КР- повшстю вичерпались метаболии, здатнi до «над-швидко!» редукцi!. Навпъ незна-чний !х залишок при ташй висок1й рiзницi швидкостей на I i II етапах ПРХ шг суттево вплинути на ефектившсть II етапу, особливо на початку процесу. З метою надiйного усунення iз КР метаболiтiв, що беруть участь на I етат ПРХ, наступну порцш Сr(VI), доданого до КР-, збiлъшили удвiчi (рис. 3Б), що привело до шдвищення (хоча i незна-чного) швидкостi i збiлъшенню СКВХ на I еташ ПРХ. Та-кий пiдхiд дозволив чпташе вiдмежувати метаболiти КР на I та II етапах ПРХ.
Профш швидкосп ПРХ виявлеш тсля вiдсiканнi метаболiтiв I етапу при дробному додаванш Сr(VI), по мерi його редукцп в КР- i КР, подано на рис.4.
Виявлено вiдмiнностi в профiлях швидкостей ПРХ для КР- i КР (рис. 4) - на II етат швидшсть в КР- була вищою. Шсля вичерпання низькомолекулярних мета-болтв дрiжджiв Р. guillermondii, що ввдповщають за I етап ПРХ, функцюнуе тiлъки II етап, який можна подов-жити шляхом дробного додавання СгСУТ).
0 30
60 90 300 Час, хв
360
1,0
g 0,8
а
S. 0,6
со
| 0,4
а. * 0,2
0,0
Б
1 \ 11-2
\
■. . 11-2 1__ -М—г- .......
4 12 24 36 48 60 72 Час, год
Рис. 3. Швидшсть ПРХ в КР- P. guillermondii L2. А. Редукшя 0,5 мМ хромату ( I етап) i додатково! ал^оти ( II етап); Б - редукшя 1 мМ Cr(VI), а також наступно! порци 0,75 мМ Cr(VI). Моменти додавання хромату позначено стршками.
0
2
Час, год
Рис. 4. Характеристика процесу ПРХ при дробному додаванш Cr(VI) до КР- i КР. A. Швидкосп ПРХ на II еташ для КР- (1) i КР (2); с^лки вказують: а - час додавання Cr(VI) до 0,75 мМ, тсля повно! редукцп 1 мМ Cr(VI); б - г - час додавання чергових порцш Cr(VI), до 0,4 мМ, тсля повно! редукцп попередшх; Б, В - СКВХ на I i II етапах
(в% ввд вихвдного piвня доданого хромату) в КР- i КР, вщповщно.
За швидшстю ПРХ на II еташ, протягом 50 год в шнетиш, виявлено i охарактеризовано 3 piзних фази процесу (рис. 4), як було названо умовно: швидка (II-1), по-вшна (II-2) i значно сповшнена, довготривала (II-3). Другу i третю фази процесу виявлено як в КР, так i в КР-. Швидкосп ПРХ, визначеш для кожно! iз 3-х фаз ПРХ II етапу, були наступними (мкМ хв-1): II-1 - (2,8-2,5); II-2 -(1,2-0,95); II- 3 - (0,3-0,05). Як видно з рис. 4 Б i В, в КР-
переважае рiвень метаболтв I етапу ПРХ. При дробному додаванш хромату, по мiрi його утилiзацi!, вдалось продо-вжити II етап редукцп як для КР, так i для КР-.
Заслуговуе уваги швидка фаза II етапу ПРХ (П-1), яку виявлено тшки в КР-. Швидкiстъ ПРХ в фазi П-1 майже утричi вища ввд П-2 i на порядок вища ввд П-3. Три-валiсть фази П-1 - 2 год, однак и вклад у СКВХ на II етат е суттевим - 29% (або 19% ввд сумарно доданого хромату).
Ввдомо, що за умов дефщиту Fe(II) в ростовому се-редовищ1 флавшогент др1ждж1 P. guillermondii здатт до надсинтезу рибофлаину (РФ), а в безклгшнних екстрак-тах (БЕ) таких клгшн виявлено тдвищет р1вн1 ферире-дуктазно! активносп (ФРА). Нами було показано, що над-синтез РФ спостериаеться також при культивувант цих др1ждж1в в затзовмютному середовищ^ в умовах при-гтчення росту клгшн за наявносп Cr(VI) [20]. Скорше за все, щ явища взаемопов'язат: не виключено, що пром1жн1 продукти бюсинтезу РФ, накопичет в процеа культи-вування др1ждж1в, можуть впливати на ПРХ. Для зясу-вання цього припущення дослвджували параметри про-цесу ПРХ др1ждж1в P. guillermondii тсля шкубаци клпин протягом 4 д1б в середовищ^ до якого не додавали Fe(II) (рис.5).
Дослщжували ПРХ в КР флавшогенних др1ждж1в P. guillermondii L2 та одержаного з них ратше мутантного штаму L2-89 (яшй втратив здаттсть до надсинтезу РФ як при дефщип Fe(II), так i тд впливом хромату). Як видно з рис. 5, для обох шташв найвища швидшсть ПРХ як на I (за 2 хв), так i на II (протягом 60 хв) етапах, досягаеться в КР, вщбрано1 на стацюнарнш фазi росту клiтин. Виявлено, що КР штаму L2-89 мае нижчу швидшсть ПРХ на I
еташ, тж КР батьшвського штаму L2. В КР нефлавшоген-них др1ждж1в S. cerevisiаe I етап ПРХ взагалi вiдсутнiй. Встановлет факти пiдтверджують наше припущення щодо можливо! участi сполук - продукпв/метаболтв /складових процесу флавiногенезу - на I етат ПРХ. Посе-редньо це припущення шдтверджуе виявлений нами впе-рше феномен позаклгшнно1 редукци iонiв Fe(III) (ПРФ) компонентами КР тсля вирощування клiтин штамiв L2 та L2-89 в середовищi iз обмеженою концентрацiею iонiв Fe(II).
Дослвдження залежносп ефективностi ПРФ та ПРХ на рiзних етапах та кореляцiю цих процеав представлено на рис. 5. Не виключено, що ПРФ та ПРХ, а також «запуск» бюсинтезу РФ в присутносп Cr(VI), змтюють яшсний та/або к1льк1сний склад пулу метаболтв, здатних ввдновлювати Cr(VI). Посередньо це припущення тдтвер-джуеться виявленням в КР- фази II-1, як ми вважаемо, за рахунок метаболiтiв, вiдсутнiх у КР. У мутанта L2-89 як хромат-, так i Fe(Ш)-редукцiя в КР е нижчими, нiж у батьшвського штаму. В профiлi динамiки культивування дрiжджiв змiна рiвнiв обох еташв ПРХ та Fe(III)-редукци для P. guillermondii L2 аналопчш, але у мутанта L2-89 щ параметри, а також швидшсть ПРХ на II етат, е нижчими.
g 400
1 300
2 200 |Т 100
! 1'5
'Ц 1,0
5 0,5
0)
а 0,0
A
24 Час, доби
6
^ 3,0 ■
т
* 2,5 2 2,0
¥ 1,5
1,0
!0,5 I 0,0
Б
1
2 3 4 Час, доби
5
Рис. 5. Вплив часу культивування клггин на швидшсть позаклггинной редукци хромату (А) i ютв залiза (Б) в КР др1ждж1в P. guillermondii L2 (1, 2, 3) i мутанта L2-89 (4, 5, 6); швидкосп ПРХ на I (1 i 4) i на II етапах (2 i 5).
1
3
4
6
2
5
Можливо, два етапи в процеа ПРХ пов'язат з впливом не тшьки пром1жних продуктiв бiосинтезу РФ та ПРФ на цей процес, але також iз iншими сполуками. До-слвдження кiнетики ПРХ неконвенцiйними астаксантин-синтезуючими дрiжджами Р. rhodozyma, як не е над-синтетиками РФ, тдтвердили це припущення [11].
З метою концентрування та фракцiонування метаболитов КР, здатних до ПРХ, використано розроблений нами метод крюконцентрування КР [11]. Найбшьш кон-центроват фракци проявляли високий рiвень ПРХ, а стввщношення мiж швидкостями на I та II етапах ПРХ становило приблизно 25:1. В цих же фракщях виявлено високу швидшсть ФРА. По мiрi зниження концентраци метаболiтiв КР- у фракцiях, суттево падало сшввщно-шення мiж швидкостями ПРХ на I та II етапах, що було використано нами для одержання фракцш, збагачених компонентами КР-, яш забезпечують саме II етап ПРХ. Остант фракци, в яких виявлено невисок рiвнi I етапу ПРХ, але залишалась активтсть II етапу, були сконцен-троват методом юнообмшно! колонково! хроматографи i проаналiзованi спектрофотометрично i електрофоретично (дат не показано).
Попереднi результати дослщжень засввдчують, що в складi метаболтв, яш беруть участь на II етат ПРХ, е бшки. Однак, одержанi данi стосовно природи метаболтв потребують подальшого уточнення та вивчення.
Висновки i пророзщи. В результап дослiджень вив-чено динамiку позаклгшнно1 редукци хромату неконвен-цiйними дажджами Pichia guilliermondii в залежностi ввд умов 1х культивування та шкубаци iз хроматом. Розроб-лено способи концентрування, фракцiонування та характеристики одержаних наночастинок оксиду хрому(Ш), а також редуктанпв в складi позаклгшнно! рвдини, з метою встановлення 1х природи.
Дослвдження процесiв редукци оксианютв металiв дрiжджами можуть бути корисними для розробки техно-логiй одержання нових перспективних наноматерiалiв, зо-крема наночастинок оксидiв перехiдних металiв, шляхом «зеленого» синтезу та для з'ясування молекулярних ме-ханiзмiв резистентностi клгтин до ди стресових факторiв.
Список лггератури
1. Hexavalent chromium removal in vitro and from industrial wastes, using chromate-resistant strains of filamentous fungi indigenous to contaminated wastes / F.J. Acevedo-Aguilar, A.E.Espino-Saldana, I.L. Leon-Rodriguez et al. // Can. J. Microbiol. - 2006. - 52, № 9. - Р. 809-815.
2. Chromium accumulation by living yeast at various environmental conditions / P. Kaszycki, D. Fedorovych, H. Krzeminska et al. // Microbiol. Res.-2004. - 159, №1. - P. 11-18.
3. Interactions of chromium with microorganisms and plants / C. Cervantes, J. Campos-García, S. Devars et al. //FEMS Microbiol. Rev. - 2006. - 25, Is.3. - Р. 335347.
4. The influence of chromium compounds on yeast physiology (A review) / P. Raspor, M. Batic, P. Jamnik et al. // Acta Microbiol. Immunol. Hung. - 2000. - 47.
- Р. 143-173
5. Влияние Cr (VI) на физиологию роста и сорбцион-ную способность дрожжей / О.Г. Лозовая, Т.П. Касаткина, В.С. Подгорский // Мжробюл. Журн. -2004. - 66, №3. - С. 43-50.
6. Cr(VI) reduction in a chromate-resistant strain of Candida maltosa isolated from the leather industry / R. Ramírez-Ramírez, C. Calvo-Méndez, M. Avila-Rodríguez et al. //Antonie Van Leeuwenhoek. - 2004.
- 85, № 1. - Р. 63 - 68.
7. Selection and properties of mutant yeast Pichia guilliermondii strains resistant to chromium(VI) / L.Ya. Babyak, H.P. Ksheminskaya, M.V. Gonchar et al. // Appl. Biochem. Microbiol. - 2005. - 41. - Р. 177-181.
8. Yeast tolerance to chromium depends on extra-cellular chromate reduction and Cr(III)-chelation /H. Ksheminska, D. Fedorovich, T.Honchar et al. // Food Technol. Biotechnol. - 2008. - 46, № 4. - Р. 420-427.
9. Extra-cellular chromate-reducing activity of the yeast cultures / H. P. Ksheminska, T. M. Honchar, G. Z. Gayda, M. V. Gonchar // Cent. Eur. J. Biol. - 2006. -1, № 1. - P. 137-149.
10. The chromate resistance phenotype of some yeast mutants correlates with a lower level of Cr(V)-species generated in the extra-cellular medium /H. Ksheminska, T. Honchar, Y. Usatenko et al. // Biometals. - 2010. - 23. - P. 633-642.
11. Кшемшська Г., Нечай Г., 1ваш М., Гайда Г., Гончар М. Позаклиинна редукця хромату флавшогенними та каротиносинтезуючими неконвенцшними
дрщджами // Прац НТШ, Хем. Бюхем. - 2008. - 31.
- С. 272-281.
12. Хромат-резистентные мутанты дрожжей Pichia guilliermondii: получение и свойства / Г.П. Кшемин-ская, Г.З. Гайда, М.Ф. Иваш, М. В. Гончар //Микробиология (Москва). - 2011. - 80, №3. - С.301-307.
13. Bioremediation of chromium by the yeast Pichia guilliermondii: toxicity and accumulation of Cr(III) and Cr(VI) and the influence of riboflavin on Cr tolerance / H. Krzeminska, A. Jaglarz, D. Fedorovych et al. // Microbiol. Res. - 2003. -158, №1. - P.59-67.
14. Rakesh S. Synthesis of Chromium(III) Oxide Nanoparticles by Electrochemical Method and Mukia Maderaspatana Plant Extract, Characterization, KMnO4 Decomposition and Antibacterial Study / S. Rakesh, S. Ananda, M. M. G. Netkal // Modern Research in Catalysis. - 2013. - 2. - P. 127-135.
15. Burkholder P.R. Studies on some growth factors on yeasts / P.R. Burkholder, J. McVeigh, D. Moger // J. Bacteriol. - 1944. - 48. - Р. 385-391.
16. Marchart H. Über die Reaktion von Chrom mit Diphenylcarbazid und Diphenylcarbazon / H. Marchart // Anal. Chim. Acta. - 196, № 30. - Р. 11-17.
17. Assay of chromium(III) in microbial cultures using chromazurol S and surfactants / T.M. Honchar, H.P. Ksheminska, 1.О. Patsay et al. // Biotechnology (Kiev).
- 2008. - 1, № 4. - Р. 64-67.
18. Fedorovych D.V. Ferrireductase activity of Pichia guillermondii cells and peculiarities of its regulation / D.V. Fedorovych, G.M. Shavlovsky, O.V. Protchenko // Microbiologic - 1992. - 61. - P.11-17.
19. Schroder I. Microbial ferric iron reductases / I. Schroder, E. Johnson, S.de Vries // FEMS microbiol. Rew. - 2003. - 27. - P.427-447.
20. Hexavalent chromium stimulation of riboflavin synthesis in flavinogenic yeast / D. Fedorovych, H. Ksheminska, L. Babyak et al. //2001. - Biometals. - 14.
- P.23-31.
ВОДА - ЭТО ЖИЗНЬ
Гончаренко Игорь Владимирович
доктор сельскохозяйственных наук, профессор Трофименко Алексей Лукич доктор биологических наук, профессор Кучин Василий Данилович
доктор технических наук, профессор, Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины WA TER - THIS IS LIFE
Goncharenko I. V., doctor of agrikultural science, professor, Trofimenko A.L., doctor of biological, professor, Kuchin V.D.
doctor of technical science, professor, National University of Life and Environmental Science of Ukraine АННОТАЦИЯ
Приведены многочисленные факты о свойствах и пользе талой и дождевой воды. Подчеркнута особая роль воды в жизнедеятельности любого организма.
Дана характеристика механизма старения клеток человеческого организма или их регенерация за счет разности потенциалов на мембране клеток (окислительно-восстановительный потенциал) и наличием в воде свободных радикалов, обладающих свойством разрушать клетки.
Из-за климатических изменений на Планете выдвигается гипотеза и приводятся неоспоримые факты об очень скором дефиците питьевой воды в Украине.
Ключевые слова: вода, свойства, процессы жизнедеятельности, человеческий организм, окислительно-восстановительный потенциал.
