CC BY
71
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ... 55
УДК 615.277.3-099:616-006.6-092.9 НА. Пятаев, П.И. Скопин, О.В. Минаева, С А. Щукин, ЕЮ. Коровина, Н.Н. Зырняева ОСОБЕННОСТИ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ДОКСОРУБИЦИНА ПРИ ВВЕДЕНИИ В ФОРМЕ КОНЪЮГАТА С ДНК У КРЫС С ТРАНСПЛАНТИРОВАННОЙ КАРЦИНОМОЙ РС-1 ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева», Саранск
Контактная информация
Пятаев Николай Анатольевич, д-р мед. наук, заведующий лабораторией таргетной фармакотерапии адрес: 430005, Республика Мордовия, г.Саранск, ул. Большевистская, д. 68; тел. +7(8342)47-67-63; e-mail: pyataevna@mail.ru
Статья поступила: 14.10.2010, принята к печати 18.03.2011.
Резюме
Цель работы - изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1. Выполнены эксперименты на крысах с перевитой холангиоцеллюляр-ной карциномой РС-1. Животные были разделены на 6 групп. В контрольной группе животные лечения не получали. Животным 1-й опытной группе вводили доксорубицин в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно, животным 2-й; 3-й и 4-й - конъюгат доксорубицина с ДНК (препарат «Деринат», ЗАО «Техномедсервис», Россия) в дозах 1; 2 и 4 мг/кг соответственно, животным 5-й опытной группы - только «Деринат». Исследовали тканевое распределение доксорубицина после инъекции и ряд показателей, характеризующих эффективность и токсичность химиотерапии: индекс массы опухоли; индекс торможения роста опухоли; летальность в процессе лечения; число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, частоту токсической энтеропатии и миокардиодистрофии. Установлено, что введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах. Показано, что конъюгированная с ДНК форма доксорубицина обладает несколько меньшей антибластомной активностью, но в эквивалентных по противоопухолевому эффекту дозах реже вызывает миокардиострофию и энтеропатию по сравнению с изолированным препаратом.
Ключевые слова: комплекс ДНК-доксорубицин, химиотерапия, кардиотоксичность, распределение, Деринат.
N.A. Pvataev, P.I. Skopin, O. V Minaeva, S.A. Tshchukin, EJ. Korovina, N.N. Zyrnyaeva TISSUE DISTRIBUTION AND ANTICANCER ACTIVITY OF DNA-CONJUGATED DOXORUBICINE IN RATS WITH TRANSPLANTED CARCINOMA RS-1
N.P. Ogarev Mordovian State University, Saransk
Resume
The purpose of this study was the investigation of doxorubicin-DNA conjugate tissue distribution and efficiency of this drug form at treatment of cholangiocellular carcinoma PC-1 in rats. Experiments were carried out on rats with trans-plantated cholangiocellular carcinoma PC-1. Animals were divided into 6 groups prior to the experiment. In the control group, animals were received distilled water using the same schedule. In the first experimental group, 1 mg/kg of doxorubicin was injected intraperitoneally. In the 2, 3 et 4 experimental groups, doxorubicin-DNA («Derinat», Tehnomedservis, Russia) conjugate was injected at the 1, 2 and 4 mg/kg. In the last group animals were injected the «Derinat» only. We have studied the tissue distribution of the doxorubicin and several other parameters of chemotherapy efficiency. We have followed the lethality, the tumor mass index, the number of leucocytes in blood, the rate of gastrointestinal tract ulcers. We have found that injection of doxorubicin in the conjugated form changes the tissue distribution of the drug in compare to poor doxorubicin. The doxorubicin is accumulated in tissues with high mitotic activity (tumor and lymphoid tissues). At the same time the concentration of drug in blood and parenchymatous organs was decreased. We have shown that DNA-conjugated form of doxorubicin has smaller antineoplastic activity than pure doxorubicin. We have also found that the side effects of the DNA-doxorubicin conjugate is much lower than for pure drug.
Keywords: DNA-doxorubicin complex, chemotherapy, cardiotoxicity, distribution, Derinat.
Введение
Проблема избирательности противоопухолевой химиотерапии является одной из наиболее актуальных в современной онкофармакологии. Принципиальный путь ее решения - направленный транспорт химиопрепаратов с помощью специфических векторов, обладающих тропностью к опухолевым клеткам. В качестве последних используются разнообразные
химические соединения, каким-либо образом избирательно поглощающиеся опухолевыми клетками [6; 8; 10]. Наше внимание привлек препарат нативной ДНК
- Деринат (ЗАО «Техномедсервис», Россия). Главной особенностью метаболизма и кинетики препарата, позволяющей использовать его в качестве вектора для доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам, является выявленный факт избирательного накопления экзогенной ДНК в опухолевой ткани [5].
В исследЗованиях, проводимых с использованием меченного ЗН-тимидином Дерината, было установлено, что концентрация радионуклида в опухоли и лимфоузлах после внутрибрюшинного введения препарата была в 5-7 раз выше, чем в плазме и ткани паренхиматозных органов [б; 10]. Высказывается мнение, что фрагменты молекулы ДНК, имеющие размер б0-120 нм, поглощаются клетками путем ре-цептор-опосредованного эндоцитоза. Кроме того, в литературе имеются сведения о создании конъюгатов ряда противоопухолевых химиопрепаратов с ДНК in vitro [1; 2; 9-12]. В качестве таких препаратов были использованы доксорубицин и карминомицин. В работах Ю.П. Вайнберга и Д.Ю. Мельникова [1-З] показано, что при экстракорпоральном взаимодействии Дерината с доксорубицином и карминомицином в среде, содержащей альбумин, образуются устойчивые к диссоциации в водной среде комплексы, причем связь химиопрепаратов с молекулой ДНК носит нековалентный характер.
Данные исследования послужили основанием для разработки методики лечения рака молочной железы, желудка и толстой кишки [4]. Однако следует отметить, что до настоящего времени не проводилось исследований кинетики и распределения, не установлена эффективная терапевтическая доза химиопрепаратов при их введении в форме конъюгатов с ДНК. Данные обстоятельства и послужили причинами проведения настоящего исследования.
Цель работы - изучить характер тканевого распределения доксорубицина при его введении в форме конъюгата с нативной ДНК и исследовать эффективность комплекса ДНК-доксорубицин у крыс с перевитой холангиоцеллюлярной карциномой РС-1.
Материалы и методы
Выполнены эксперименты на 72 лабораторных крысах линии Vistar. Животным по достижении массы 80-100 г под кожу передней брюшной стенки перевивали штамм холангиоцеллюлярной карциномы РС-1.
Животные были разделены на б групп, по 12 особей в каждой. В контрольной группе животные лечения не получали. В опытных группах на 7-й день после перевивки начинали лечение.
Животным 1-й опытной группы вводили доксорубицин («Teva», Израиль) в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно; животным 2; З и 4 опытных групп - конъюгат доксорубицина с Деринатом из расчета соответственно 1; 2 и 4 мг/кг конъюгированного доксорубицина, в б-й - Деринат (ЗАО «Техномедсервис», Россия) в дозе 7,б мг/кг (доза, соответствующая дозе Дерината во 2-4-й опытных группах). Инъекции производились 1 раз в З дня. На 21 сутки после начала лечения животных умерщвляли через З0 мин после инъекции препаратов. В
1 и 2 опытных группах исследовали характер тканевого распределения доксорубицина.
Приготовление конъюгата Дерината с доксо-рубицином осуществляли по методике Д.Ю. Мельникова [З] в собственной модификации. В стерильных условиях смешивали 2 мл водного раствора доксорубицина (12 мг/мл) и 1 мл 10%-ного человеческого сывороточного альбумина. Инкубировали З0 мин при 4 0С и непрерывном шейкировании, затем добавляли 2 мл 1,б%-ного Дерината, продолжали инкубацию в тех же условиях в течение б0 мин. Свободный доксорубицин удаляли диализом ацетатным буфером с рН 4,б. Для определения ко-
личества конъюгированного доксорубицина последний экстрагировали изопропанолом при 42 0С в теочение б0 мин, после чего раствор нагревали до б0 оС, затем центрифугировали при 10000 g в течение З0 мин, надосадок отбирали и определяли в нем концентрацию препарата. Степень конъюгации доксорубицина составляла б0-70 %.
В эксперименте определение концентрации доксорубицина производили в плазме крови, опухолевой ткани, ткани печени, почек, легких, в лимфоузлах, кишечной стенке и в мышечной ткани. Для исследований использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (хроматограф «Мили-хром б-З», Россия), анализ выполняли по методике [7]. Параметры хроматографирования: детектор ультрафиолетовый, Х=2б4 нм, колонка КАХ-б, сорбент - нуклеосил С18, подвижная фаза - ацетонитрил + фосфатный буфер с рН 4,б (v : v = 70 : З0).
Во всех группах определяли показатели, характеризующие эффективность химиотерапии: индекс массы опухоли (отношение массы опухоли к массе тела животного); индекс торможения роста опухоли (иТРО), рассчитываемый по формуле:
ТРО (Мк - Мо) 1OO
иТРО =---------------x 100 , где
Мк
Мк и М - средняя масса опухоли соответственно в контрольной и опытных группах.
Для оценки токсичности исследовали летальность в процессе лечения, определяли число лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови, проводили морфологическое исследование желудка, кишечника, печени, почек, легких и миокарда.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и критерия х2. Критический уровень значимости различий принимался равным б % (р<0,0б).
Результаты и обсуждение
Тканевые концентрации определяли в 1 и 2 опытных группах, где вводимые дозы доксоруби-цина были эквивалентны. Результаты определения представлены на рис. 1.
В 1 опытной группе характер распределения препарата был относительно равномерным. В ткани опухоли концентрация препарата была равна
0,290+0,02З мкг/г, что составило 7б % от плазменной концентрации.
Наиболее высокие концентрации регистрировались в хорошо васкуляризованных тканях - в легких, печени, почках и миокарде (0,б72+0,0б1;
0,842+0,0З1 и 0,б47+0,029 мкг/г соответственно). Примечательно, что не было выявлено повышения концентрации доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью клеток - лимфоузлах и селезенке. Концентрация исследуемой субстанции в этих тканях составила 0,421-0,б82 мкг/г ткани соответственно.
Во 2 опытной группе регистрировалось преимущественное накопление препарата в быстрорастущих и регенерирующих тканях, причем в большей степени в лимфоидной и опухолевой ткани и в меньшей - в кишечной стенке. В опухоли концентрация превышала плазменную в б,б раза и достигала 0,9б9 мкг/г. В лимфоидной ткани содержание доксорубицина составляло 0,81 б+0,021, в ткани селезенки - 0,727+0,040 мкг/г.
При этом плазменная концентрация и концентрация доксорубицина в паренхиматозных органах была в среднем в 2-2,5 раза ниже, чем в 1 опытной группе; разница же концентраций в миокарде составила почти 300 % (0,594+0,021 и 0,188±0,011 соответственно). При этом плазменная концентрация и концентрация доксорубицина в паренхиматозных органах была в среднем в 2-2,5 раза ниже, чем в 1 опытной группе; разница же концентраций в миокарде составила почти 300 % (0,594+0,021 и 0,188+0,011 соответственно). Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что введение доксорубицина в виде конъюгата с ДНК меняет характер распределения препарата. Тканевое распределение препарата в данном случае практически полностью соответствует распределению меченых нуклеотидов, полученному в исследовании [5] при введении экзогенной ДНК.
Это свидетельствует о достаточно прочной связи доксорубицина с ДНК и отсутствии значимой диссоциации комплекса доксорубицин-ДНК до момента поглощения клетками.
Учитывая, что условия экстракции вещества из тканей in vitro значительно отличаются от таковых in vivo, закономерно возникает вопрос, происходит ли расщепление комплекса доксорубицин-ДНК после поступления в клетку и сохраняется ли анти-бластомная эффективность доксорубицина после конъюгации с ДНК?
Этот вопрос стал предметом второй части нашего исследования, в которой была изучена анти-бластомная активность и токсичность доксорубицна и его конъюгатов с ДНК.
Результаты исследования антибластомной активности приведены в табл. 1.
1,2
G,8
я
и
^ G,6 р
е
? G,4
о
к
G,2
G
1-я опытная ("чистый" доксорубицин)
2-я опытная (конъюгат доксорубицин-деринат)
1
□ Плазма В Опухоль Ш Печень ЕЗ Почка
0 Лимфоузел И Селезенка Ш Миокард 0 Кишечник
□ Легкое
(Рис. 2. см. вклейка)
Рис. 1. Тканевое распределение доксорубицина в исследуемых группах. Для всех исследованных тканей различия между группами достоверны.
Противоопухолевая активность различных схем терапии
Таблица 1
Группа сравнения Значения показателей в группах
ИМО ИТРО
Контрольная 44,1+3,1 -
1 опытная («чистый» доксорубицин) 18,5+1,4* 66,4+4,8
2 опытная (конъюгат доксорубицин-деринат, 1 мг/кг) 32,1+2,2 , 30,4+1,9
3 опытная (конъюгат доксорубицин-деринат, 2 мг/кг) 20,2+2,7 69,2+3,4
4 опытная (конъюгат доксорубицин-деринат, 4 мг/кг) 7,8+0,8 , 432,7+22,1
5 опытная (деринат) 48,1+3,7* 5,8+0,6*
достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе; достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе.
SB ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ...
Исследуемый штамм карциномы РС-1 проявил достаточную чувствительность к доксорубицину:
В 1 опытной группе («чистый» доксорубицин в дозе 1 мг/кг) иТРО составил 66,4 %. Активность конъюгированной формы препарата была несколько меньшей и возрастала с увеличением дозы. Во 2 опытной группе (конъюгированный доксорубицин в дозе 1 мг/ кг) иТРО был равен 30,4 %, что на 54 % меньше показателя 1 опытной группы. Противоопухолевый эффект, эквивалентный эффекту «чистого» препарата, достигался при использовании дозы конъюгата 2 мг/кг (3 опытная группа). иТРО в данной группе был равен 69,2% и достоверно не отличался от такового в 1 опытной группе.
Конъюгированный доксорубицин в дозе 4 мг/кг (4 опытная группа) имел максимально выраженный эффект (иТРО=432 %), который, однако, в 100 % случаев сопровождался тяжелыми токсическими реакциями.
Деринат в виде монотерапии (5 опытная группа) не оказывал влияния на опухолевый рост. На рис.
2 приведены фотографии опухолей средних размеров для каждой из исследованных групп.
Анализ побочных и токсических эффектов химиотерапии показал, что встречаемость и выраженность осложнений при ее проведении различалась в сравниваемых группах (табл. 2).
Таблица 2
Побочные эффекты различных схем терапии_________________________________________________________
Группы сравнения Значения показателей в группах
Летальность, абс. (%) Лейкоциты, xl09, M+m Тромбоциты, xl09, M+m Язвенный энтероколит, абс. (%) Токс. миокардиоди-строфия, абс. (%) Токс. дистрофия печени, абс. (%)
Контрольная 0 18,9+1,6** 318+19** 0 0 0
1 опытная («чистый» доксоруби-цин) 2 (16,7)* 9,4+0,8* 116+11* 5 (41,7)* 4 (33,3)* 1 (8,3)*
2 опытная (конъюгат доксоруби-цин-деринат, 1 мг/кг) 0 15,3+1,1** 231+14*** 0 0 0
3 опытная (конъюгат доксоруби-цин-деринат, 2 мг/кг) 1 (8,3)* 11,5+0,9* 152+16* 2 (16,7)*’** 2 (16,7)*“ 0
4 опытная (конъюгат доксоруби-цин-деринат, 4 мг/кг) 7 (58,3)* 2,7+0,1*** 40,4+2,2*“ 12 (100)*** 12 (100)*** 12 (100)***
5 опытная (деринат) 0 17,1+1,8** 326+15** 0 0 0
достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного в контрольной группе; достоверное (р<0,05) отличие показателя от аналогичного во 2-й опытной группе.
При введении «чистого» доксорубицина у всех животных регистрировалась лейкопения ((9,4+0,8)х109/л против (18,9+1,6)х109/л в контроле, р<0,05), язвенные поражения кишечника встречались в 42 % наблюдений, у 4 (33 %) животных имелись морфологические признаки токсической миокардиодистрофии. Всего в процессе лечения пало 2 (16,7 %) животных (причина -язвенно-некротический энтероколит). Во 2 опытной группе частота побочных эффектов ХТ была значительно меньшей. Летальных исходов в данной группе не регистрировалось, количество лейкоцитов в периферической крови достоверно не отличалось от такового в контроле, морфологических изменений со стороны внутренних органов не наблюдалось. В 3 опытной группе отмечался 1 летальный исход, у выживших животных преобладали токсические эффекты со стороны
кроветворной системы - лейко-, тромбоцитопения и анемия, однако их выраженность была меньшей, чем при использовании «чистого» доксорубицина. Частота язвенного поражения кишечника и миокардиодистро-фии составляла 16 %, что почти в 2 раза меньше, чем в 1 опытной группе. В 4 опытной группе частота и выраженность токсических эффектов ХТ была наибольшей. Летальность в процессе терапии составила 58 %. На секции у 4 павших животных обнаружен язвеннонекротический энтероколит, у 3- выраженные дистрофические изменения во всех внутренних органах (печени, почках, миокарде). У выживших отмечалась тяжелая миелосупрессия (лейкоцитов - 2,7±0,1х109/л, тромбоцитов - 40,4х109/л), в 100 % случаев обнаруживались язвы кишечника и регистрировались морфологические проявления гепатопатии и миокадиодистрофии.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ... 59
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют: эффективные дозы доксорубицина при введении в виде конъюгата отличаются от таковых при использовании изолированной субстанции. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюгированного доксорубицина была примерно в 2 раза выше дозы чистого препарата. Наиболее вероятным объяснением является неполная диссоциация комплекса доксорубицин-ДНК в клетке. Вместе с тем, конъюгированная форма доксорубицина в эффективной дозе вызывала достоверно меньше побочных эффектов. При этом токсичность была пропорциональна степени накопления в тех или иных тканях. Так, у конъюгата, который слабо аккумулируется в миокарде и паренхиматозных органах, значительно уменьшались ульцеро-генность и кардиотоксичность. Миелосупрессии, особенно в отношении тромбоцитарного ростка, также была выражена меньше. Проведенные исследования продемонстрировали возможность повышения избирательности действия доксорубицина при введении в виде конъюгата с гетерологичной ДНК и показали перспективность проведения исследований в этом направлении.
Выводы
1. У крыс с перевитой карциномой РС-1 введение доксорубицина в форме конъюгата с нативной ДНК изменяет характер распределения препарата. Регистрируется преимущественное накопление доксорубицина в тканях с высокой митотической активностью (опухолевой и лимфоидной ткани) на фоне снижения плазменной концентрации и концентрации в паренхиматозных органах.
2. Конъюгированная с ДНК форма доксо-рубицина обладает меньшей антибла-стомной активностью по сравнению с изолированным препаратом, но оказывает меньшее токсическое воздействие на желудочно-кишечный тракт и миокард. Эквивалентная по противоопухолевой активности доза конъюгированного док-сорубицина в два раза выше, чем доза «чистого» препарата.
Литература
1. Вайнберг Ю.П. Физико-химические и биологические свойства комплекса ДНК с карминомицином // Медицина. - 1980. - № 9. - С. 18-22.
2. Вайнберг Ю.П., Носик Д.Н., Каплина Э.Н. и др. Активность лекарственных средств, полученных на основе нативной ДНК в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов // Ж. Медицина. - 1995. - № 6.
- С. 3-5.
3. Мельников ДЮ. Применение иммуноконъюгатов в химиотерапии онкологических больных // Медицинская картотека. - 1999. - № 7-8. - С. 28-32.
4. Патент России № 20049721993, 1994.
5. Русинова Г.Г. Особенности усвоения экзогенной ДНК и ее низкомолекулярных предшественников в организме животных // Биохимия. - 1971. - Т. 36, № 5. - С. 88-9.
6. Северин Е.С. Исследование эффективности различных белковых векторов в рецептор-опосредованном транспорте биологически активных веществ в клетки // Информационный бюллетень РФФИ. - 1995. -Т.3, № 4. - С. 303.
7. European pharmacopoeia 5.0. - 2005. - P. 1481-2.
8. Baurain R, Deprez-De Campeneere D, Zenebergh A., Trouet A. Plasma levels of doxorubicin after IV bolus injection and infusion of the doxorubicin-DNA complex in rabbits and man. Comparison with free doxorubicin // Cancer Chemother Pharmacol. - 1982. - 9(2). - P. 93-6.
9. Brown I., Ward H. W. The comparative toxicity and therapeutic efficacy of adriamycin and the adriamycin-DNA complex in the chemotherapy of C3H mice with transplanted mammary adenocarcinoma // Cancer Lett.
- 1977. - 2(4-5). - P. 227-32.
10. Deprez-De Campeneere D, Baurain R, Huybrechts M, Trouet A. Comparative study in mice of the toxicity, pharmacology, and therapeutic activity of daunorubicin-DNA and doxorubicin-DNA complexes // Cancer Chemother Pharmacol. - 1979. - 2(1). - P. 25-30.
11. Hall S.W, Benjamin R.S, Burgess M.A. et al. Doxorubicin-DNA complex: a phase I clinical trial // Cancer Treat Rep. - 1982. - 66(12). - P. 2033-7.
12. Severin S.E. Antitumor activity of conjugates of the oncofetal protein, alpha-fetoprotein and phthalocyanines in vitro // Biochemistry and Molecular Biology International. - 1997. - 43(4). - P. 873-81.
ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ СТАТЕЙ ДЛЯ ПУБЛИКАЦИИ В «РОССИЙСКОМ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ ЖУРНАЛЕ» (ПРОДОЛЖЕНИЕ)
В списке литературы в алфавитном порядке перечисляются курсивом фамилии и инициалы авторов на русском языке, затем на иностранных языках.
Все библиографические ссылки в тексте должны быть пронумерованы в соответствии с их положением в списке литературы. Фамилии иностранных авторов приводятся в оригинальной транскрипции. В список литературы не включаются ссылки на неопубликованные работы и учебники. Ссылки должны быть тщательно выверены авторами, которые несут ответственность за правильность приведенных данных.
Если авторов не более четырех, они упоминаются все, при большем числе авторов перечисляются первые три, далее пишется и др. или et. al.
(продолжение см. на стр. 60)
