CC BY
95
DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10204 УДК 634.11:581.1:631.526.321
Особенности морфогенеза клонового подвоя яблони М9 в культуре in vitro
О. В. МАТУШКИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: invitro82@ yandex.ru)
И. Н. ПРОНИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник Д. Г. ШОРНИКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, ученый секретарь
Федеральный научный центр им. И. В. Мичурина, ул. Мичурина, 30, Мичуринск, Тамбовская обл., 393774, Российская Федерация
Резюме. Подвой яблони М9 - наиболее перспективный для Западной Европы и южной зоны садоводства России, но трудноразмно-жаемый in vitro. Изучали особенности его морфогенеза в культуре изолированной ткани. Исследования проводили в2017-2018гг. В качестве эксплантов использовали меристематические верхушки размером 0,5...1,0 мм, почки, сегменты стебля с почкой. Культивирование проводили на питательных средах Мурасиге-Скуга, Линсмайер-Скуга, Гамбурга, Кворина-Лепуавра, Кнопа, Ллойда-МакКоуна, Мастер (М6) с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) - 0,3 мг/л; тидиазурона(TDZ) - 0,03мг/л; БАП, индолил-3-масляной (ИМК) и гибберелловой кислот (ГК) по 0,5 мг/л. А также витаминов В1 и В6 по 0,5 мг/л и 1,5 мг/л аскорбиновой кислоты для немодифицированньх сред; по 0,1 мг/л и 1,0 мг/л для модифицированных сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра. Субкультивирование проводили через 4 недели. Опыты закладывали в 3-х кратной повторности по 15.20 эксплантов в каждой. Оптимальный тип эксплантов - меристематические верхушки, у которых уровень регенерации на немодифицированной среде Кворина-Лепуавра с БАП 0,3 мг/л составил 65,0 и 15,0 % через 1 и 2 месяца культивирования соответственно. Использование ИМК и ГК с БАП, а также TDZ приводило к гибели всех эксплантов через 2.3 недели. На всех немодифицированных средах с БАП 0,3 мг/л экспланты в основании микропобега формировали каллусную ткань, что приводило к их гибели через 2.3 месяца культивирования. Использование модифицированных сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра с БАП 0,3 мг/л полностью решило проблему интенсивного каллусообразования. Регенерационная способность эксплантов через 1 месяц культивирования на этих средах была на 19,3.55,2 % выше (86,8 и 92,7% соответственно), чем на остальных. Прекращение дифференциации меристематической ткани, ее некроз и гибель эксплантов на них происходила через 3.4 месяца культивирования.
Ключевые слова: клональное микроразмножение, in vitro, клоно-вый подвой яблони, каллус, морфогенез, регенерация. Дляцитирования: Матушкина О. В., Пронина И. Н., ШорниковД. Г. Особенности морфогенеза клонового подвоя яблони М9 в культуре in vitro //Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 2. С. 14-16. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10204.
В условиях ухудшающейся экологической ситуации и дефицита плодовой и ягодной продукции, потребляемой населением нашей страны, все большее значение приобретает разработка эффективных технологий производства сертифицированного посадочного материала и создания адаптивных форм и сортов растений с использованием биотехнологических приемов. Освоение таких приемов в садоводстве позволяет не только повысить морфогенети-ческий потенциал маточных и плодоносящих насаждений, а также в короткие сроки создавать новые генотипы с хозяйственно ценными признаками, толерантные к неблагоприятным факторам среды, но и повысить эффективность отрасли в целом. Значительное место в системе производства сертифицированного посадочного материала отводят методу клонального микроразмножения, использование которого в сочетании с хемо- и термотерапией открывает
возможности для освобождения растений от патогенных организмов и вирусов.
Регенерационная способность в культуре изолированной ткани хорошо изучена применительно к клоновым подвоям яблони средней зоны садоводства - 54-118, 62-396, Малыш Будаговского, 57-195, 57-497 и др. [1, 2]. Достигнуты определенные результаты по размножению in vitro подвоев из серии М (М4, М7, М26, М27, ММ106) [3, 4, 5], серии Р (Р2, Р16, Р22, Р59, Р60) [1, 6, 7] и серии СК (СК2, СК3, СК4, СК7) [3, 8]. При этом размножение методом in vitro наиболее перспективного для Западной Европы и южной зоны садоводства России клонового подвоя яблони М9 связано с рядом проблем (сильное разрастание каллусной ткани на этапе введения, выделение фенольных соединений и витрификация микропобегов) [9, 10, 11].
В связи с изложенным цель исследований - изучение особенностей морфогенеза клонового подвоя яблони М9 в культуре изолированной ткани.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории биотехнологии ФГБНУ «ФНЦ им. И.В. Мичурина» в 2017-2018 гг. В качестве исходного материала для изоляции меристематических верхушек размером 0,5...1,0 мм, почек и сегментов стебля с почкой использовали растущие верхушки побегов подвоя М 9 (фаза активного роста, май-июнь) длиной 3.5 см, а также одревесневшие побеги, выведенные из состояния покоя в зимний и ранневесенний периоды (февраль-апрель). Растительный материал получали из маточника клоновых подвоев ООО «Плодообъединение «Сады Ставрополья» (Ставропольский край, Минераловодский район, с. Сунжа).
Исходный материал стерилизовали в растворе «Белизна», разбавленном в 3 раза, в течение 4.5 мин., затем многократно промывали в стерильном дистилляте. Исследования по определению оптимального типа эксплантов проводили только на среде Кворина-Лепуавра с концентрацией БАП 0,3 мг/л. Культивирование - на питательных средах Мурасиге-Скуга, Линсмайер-Скуга, Гамбурга, Кворина-Лепуавра, Кнопа, Ллойда-МакКоуна, Мастер (М6) с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) - 0,3 мг/л; тидиазурона (TDZ) - 0,03 мг/л; индолил-3-масляной (ИМК) и гибберелловой кислот (ГК) в сочетании с БАП по 0,5 мг/л. А также витаминов В1 и В6 по 0,5 мг/л и 1,5 мг/л аскорбиновой кислоты для немодифи-цированных сред; по 0,1 мг/л и 1,0 мг/л соответственно для модифицированных сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра. Субкультивирование проводили через 4 недели. Использованные питательные среды и концентрации регуляторов роста, согласно многолетних исследований оптимальны для большинства плодовых культур, в том числе яблони, культивируемых in vitro [2, 3, 6].
Опыты закладывали в 3-х кратной повторности по 15.20 эксплантов в каждой. Достоверность различий по количеству регенерировавших эксплантов оценивали с помощью t-критерия Дункана. Одинаковые буквенные индексы указывают на отсутствие различий между отмеченными вариантами при р=0,05, разные - на существенные различия.
Цитологические исследования выполнены старшим научным сотрудником отдела экологии сада ФГБНУ «ФНЦ им. И. В. Мичурина», кандидатом сельскохозяйственных наук Е. Н. Ткачевым.
Рис. 2. Зарастание эксплантов каллусом после пересадки на свежую питательную среду (через 2 мес. после введения в культуру, К- каллус).
Рис. 1. Влияние типа экспланта на жизнеспособность подвоя яблони М 9 на среде Кворина-Лепуавра с БАП 0,3 мг/л ^-критерий Дункана рассчитан для каждого срока субкультивирования): □ -меристематическая верхушка; □ - почка; ■ - сегмент с почкой.
Результаты и обсуждение. Тип экспланта оказывал существенное влияние на жизнеспособность растительного материала. При использовании меристематических верхушек размером 0,5...1,0 мм уровень регенерации через 1 и 2 мес. культивирования на среде Кворина-Лепуавра с БАП 0,3 мг/л составил 65,0 и 15,0 % соответственно, почек - на 17,9 и 2,5 % меньше, в то время как при использовании сегмента стебля с почкой уже через 1.3 дня культивирования погибло 100 % введенного материала (рис. 1). Основная причина гибели - интенсивное выделение фенолов в питательную среду из сегментов стебля и почек с характерным потемнением ткани и культуральной среды, которые подавляют деление и рост клеток. Поэтому во всех последующих исследованиях использовали меристематические верхушки.
При дальнейшем культивировании клонового подвоя М9 экспланты, регенерировавшие в нулевом пассаже, после пересадки на свежую питательную среду начинали активно формировать в основании микропобега рыхлую немор-фогенную каллусную ткань. При этом дедифференциация затрагивала клетки проводящих пучков, что приводило к нарушению транспорта питательных веществ и остановке в развитии экспланта. Клетки не только лишались элементов питания, но и теряли способность к органо- и гистогенезу, что в свою очередь нарушало формирование всех органов и первичных тканей побега, приводило к остановке роста и постепенной их гибели на всех исследуемых немодифици-рованных питательных средах (см. табл., рис. 2).
Применение TDZ в концентрации 0,03 мг/л; ИМК, ГК в сочетании с БАП по 0,5 мг/л не оказало эффективного
воздействия на морфогенез меристематических тканей подвоя М9 и уже через 2.3 недели культивирования в связи с отсутствием дифференциации меристемати-ческой ткани происходила 100 %-ная гибель введенных в культуру in vitro эксплантов.
Дальнейшие исследования позволили решить проблему интенсивного роста каллуса путем изменения состава биологически активных веществ питательной среды (см. табл.).
Наиболее эффективно процесс морфогенеза протекал на модифицированных средах Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра. На них регенерационная способность эксплантов через 1 мес. культивирования была на 19,3.55,2 % выше, чем на остальных исследуемых средах. Однако через 4 мес. культивирования и на этих средах наблюдали гибель эксплантов, связанную с прекращением дифференциации меристематической ткани и ее некрозом по неизвестным причинам, на что указывают и другие исследователи [9].
Изучение питательных сред, модифицированных по витаминному составу (с пониженной концентраций аскорбиновой кислоты до 1,0 мг/л и витаминов группы В до 0,1 мг/л), показало преимущество среды Мурасиге-Скуга как по количеству регенерировавших, так и достигших фазы розетки эксплантов, а также позволило решить проблему каллусообразования (рис. 3).
Однако на этой среде часто формировались витрифи-цированные микропобеги, поэтому все последующие субкультивирования проводили на модифицированную среду Кворина-Лепуавра. Несмотря на то, что в первые 2 мес. на ней образовывались розетки, состоящие из 3...4 листьев, в то время как линейного роста не наблюдали (что и является проблемой размножения in vitro подвоя М9), через 3.4 мес. культивирования морфогенез прекращался, листья
Таблица. Влияние состава питательной среды с БАП 0,3 мг/л на регенерационную способность подвоя М9 in vitro
Питательная среда Длительность культивирования (пассаж), мес.
1 2 3 4
гибель, % регенерировало**, % гибель, % регенерировало, % гибель, % регенерировало, % гибель, %
Мурасиге-Скуга 32,5 67,5c
Модифицированная 13,2 86,8ab Мурасиге-Скуга
Кворина-Лепуавра 35,0 65,0cd
Модифицированная 2,8 92,7a Кворина-Лепуавра
Ллойд-Мак Коуна 52,9 41,7f
Линсмайер-Скуга 60,0 40,0f
Гамборга 37,5 62,5cde
Кнопа 62,5 37,5f
Мастер_600_40,0f
100* 15,0
100* 5,0
87,5 100* 100* 100* 50,0
0,0 85,0a
0,0 95,0a
12,5c 0,0 0,0 0,0 50,0b
19,2
25,7 100*
100*
80,8a
74,3a 0,0
0,0
100 100
*образование каллуса; **долю регенерировших эксплантов считали в каждом пассаже от количества субкультивируемых на свежую питательную среду.
Выводы. Подвой яблони М9 относится к трудноразм-ножаемым в культуре in vitro. Оптимальным типом экс-плантов среди исследованных были меристематические верхушки размером 0,5.1,0 мм, у которых уровень регенерации составил 65,0 и 15,0 % через 1 и 2 мес. культивирования. Для введения в культуру возможно использование питательных сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра, с пониженной концентраций аскорбиновой кислоты до 1,0 мг/л и витаминов В1 и В6 до 0,1 мг/л с БАП 0,3 мг/л. Несмотря на то, что в первые 2 мес. культивирования на среде Кворина-Лепуавра образовывались розетки, состоящие из 3...4 листьев, через 3.4 мес. морфогенез прекращался, и происходила гибель всех эксплантов.
Основной проблемой при культивировании подвоя яблони М9 в культуре изолированной ткани было обильное каллусообразование. Использование таких регуляторов роста как индолил-3-масляная и гибберелловая кислоты с БАП в соотношении 1:1 (0,5 мг/л), а также тидиазурона (0,03 мг/л) не оказывало эффективного воздействия на морфогенез меристематических тканей и приводило к гибели всех эксплантов. Для успешного решения проблемы морфогенеза in vitro клонового подвоя яблони М9 требуется проведение дополнительных исследований, связанных с изучением не только химических и физических факторов культивирования, но и физиологического состояния вводимого в культуру in vitro экспланта, а также особенностей генома этого подвоя.
Литература.
1. Матушкина О. В., Пронина И. Н. Особенности воздействия экзогенных цитокининов и их производных на регенерацию яблони и груши in vitro //Достижения науки и техники АПК. 2010. №8. С. 34-35.
2. Минаев В. А. Биологические особенности слаборослых клоновых подвоев яблони при клональном микроразмножении: дис.... канд. с.-х. наук. Мичуринск: МичГАУ, 2005. 144с.
3. Беседина Е. Н. Усовершенствование метода клонального микроразмножения подвоев яблони in vitro:дис.... канд. с.-х. наук. Краснодар: СКФНЦСВВ, 2015. 142 с.
4. Amiri E. M., Elahinia A. Optimization of medium composition for apple rootstocks/S. Naija, N. Elloumi, S. Ammar, etc. // African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10 (18). Рр. 3594-3601.
5. Involvement of polyamines in the adventitious rooting of micropropagated shoots of the apple rootstock MM 106// In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant. 2009. Vol. 45. No. 1. Pp. 83-91.
6. Матушкина О. В., Пронина И. Н. Размножение яблони и груши in vitro //Достижения науки и техники АПК. 2009. № 2. С. 15-17.
7. SzynczykA., Hodun J., Beilicki P. Influence of micropropagation on the performance and quality of P 22 rootstock in mother plantation //J. Fruit ornamental Plant Res. 1994. Vol. 2. No. 3. Pp. 91-100.
8. Оптимизация питательных сред при клональном микроразмножении подвоев яблони серии СК/Л. Л. Бунцевич, А. Т. Киян, Е. Н. Беседина и др. // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. статей. ВСТИСП. М., 2013. Т. XXXV1I. Ч. 1. C. 46-50.
9. Стаканова Р. В., Абраменко Н. М. Ускоренное размножение подвоев яблони в асептических условиях// Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии. 1984. № 6. С. 29-31.
10. Kepenek K., Karoglu Z. The effects of paclobutrazol and daminozide on in vitro micropropagation of some apple (Malus domestica) cultivars and M9-rootstock//African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10 (24). Pр. 4851-4859.
11. Mert C., Soylu A. Shoot location and collection time effects on meristem tip culture of some apple rootstocks // Pak. J. Bot. 2010. Vol. 42 (1). P. 549-557.
12. Dobránszki J., Teixeira da Silva J.A. Micropropagation of apple -A review// Biotechnology Advances. 2010. Vol. 28. Pр. 462-488.
Morphogenesis Peculiarities of M9 Clonal Rootstock of Apple Tree In Vitro Culture
0. V. Matushkina, I. N. Pronina, D. G. Shornikov, I. V. Michurin
1. V. Michurin Federal Scientific Center, ul. Michurina, 30, Michurinsk, Tambovskaya obl., 393774, Russian Federation
Abstract. M9 apple rootstock is the most promising one for Western Europe and the southern zone of horticulture in Russia. But it is difficult to propagate it in vitro. The characteristics of the rootstock morphogenesis were studied in isolated tissue culture. The experiments were carried out in 2017-2018. Meristematic tips with the size of 0.5-1.0 mm, buds, stem segments with a bud were used as explants. The explants were cultivated in vitro on Murashige-Skoog medium as well as on Linsmaier-Skoog, Hamburg, Quoirin-Lepoivre, Knop, Lloyd-McCown and Master (M6) media supplemented with 6-benzylaminopurine (BAP) - 0.3 mg/L, thidiazuron (TDZ) - 0.03 mg/ L; BAP, indole-3-butyric (IBA) and gibberellic acid - 0.5 mg/ L, and vitamins B1 and B6 (0.5 mg/L) with ascorbic acid (1.5 mg/L) for unmodified media; vitamins B1 and B6 (0.1 mg/L) with ascorbic acid (1.0 mg/L) for modified Murashige-Skoog and Quoirin-Lepoivre media. Subculturing was performed in 4 weeks. The experiments were laid in 3 replicates of 15-20 explants in each. The meristematic tips occurred to be the optimal type of explants because the regeneration level of them was 65.0 and 15.0% in 1 and 2 months of cultivation on unmodified Quoirin-Lepoivre medium with BAP 0.3 mg/L. Use of IBA and GA with BAP and TDZ caused the death of all explants in 2-3 weeks of culturing. On all unmodified media with BAP 0.3 mg/L, explants formed callus tissue at the bottom of microshoots that led to their death in 2-3 months of cultivation. Utilization of modified Murashige-Skoog and Quoirin-Lepoivre media with BAP 0.3 mg/L solved the problem of intensive callus formation. Regeneration ability of the explants in l month of cultivation on the given media was higher by19.3-55.2% than on other media (86.8 and 92.7% respectively). Termination of differentiation of meristematic tissue, its necrosis and the death of explants on them occurred in 3-4 months of cultivation. Keywords: clonal micropropagation; in vitro; clonal apple rootstock; callus; morphogenesis; regeneration.
Author Details: O. V. Matushkina, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow (e-mail: invitro82@yandex.ru); I. N. Pronina, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow; D. G. Shornikov, Cand. Sc. (Agr.), academic secretary.
For citation: Matushkina O. V., Pronina I. N., Shornikov D. G. Morphogenesis Peculiarities of M9 Clonal Rootstock of Apple Tree In Vitro Culture. Dostizheniya naukiitekhniki APK. 2019. Vol. 33. No. 2. Pp. 14-16. (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10204.
Рис. 3. Регенерация подвоя яблони М 9 на модифицированных питательных средах с БАП 0,3 мг/л через 1,5 месяца культивирования: □ - регенерировано всего; □ - достигло фазы розетки.
постепенно бурели, начинался некроз тканей и происходила гибель всех эксплантов. Аналогичные процессы отмечены в исследованиях других авторов [9, 11, 12], что указывает на общие генотипические особенности подвоя М9 при культивировании in vitro. Возможно, гибель эксплантов связана с несбалансированным гормональным составом сред. Этот вопрос нуждается в дополнительном изучении.
Среди использованных нами регуляторов роста, наилучшие результаты на этапе введения в культуру in vitro обеспечил БАП в концентрации 0,3 мг/л.
