CC BY
75
Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 4-5, стр 673-660 © 2002, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
Шибаев М.И., Олейник Е.К., Олейник В.М.
Лаборатория иммунологии, Институт биологии Карельского НЦ РАН
Резюме. Рак желудка остается одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний. Понимание механизмов нарушения иммунологического контроля при данной патологии позволит определить критерии оценки иммунодефицита и найти оптимальные подходы к проведению адекватной противоопухолевой терапии. В настоящей работе проведен анализ функционального состояния иммунной системы больных раком желудка. Показано, что при этом заболевании наблюдается повышение уровня экспрессии ряда активационных антигенов, который изменяется в зависимости от стадии развития опухоли и типа ее гистологического строения. Подобные изменения характеризуют нарушение иммунологического равновесия и могут быть использованы для определения степени иммунодефицита при раке желудка.
Ключевые слова: рак желудка, лимфоциты, активационные маркеры.
Shybaev M.I., Oleyinik Е.К., Oleyinik V.M.
FUNCTIONAL STATE PECULIARITIES OF THE IMMUNE SYSTEM
OF PATIENTS WITH STOMACH CANCER
Abstract.
Stomach cancer remains one of the most wide-spread oncological diseases. The understanding of mechanisms, leading to immune control violation in this disease, will make it possible to estimate evaluation criteria of immunodeficiency and find approaches to adequate antitumor therapy. The present experiments were performed to determine functional state of the immune system of patients with stomach cancer. The increased level of activation antigens expression was observed in this disease, which differs according to the tumor stage and its histological type. The similar changes characterize the immunological imbalance and may be used for the immunodeficiency degree estimation in stomach cancer. (MecLImmunol., 2002, vol.4, N4-5, pp 673-660)
обеспечивающие избегания опухоли от иммунного надзора, остаются до конца еще невыясненными. В конечном итоге понимание этих механизмов может помочь определить критерии оценки состояния иммунной системы при онкологической патологии, создать подходы для восстановления адекватного иммунного ответа и дать импульс к развитию более эффективного лечения рака. Поэтому иммунологические исследования при онкологических заболеваниях остаются актуальными.
Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости раком желудка в большинстве стран, включая Россию, общее число больных и смертность от этой патологии остаются высокими. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями рак желудка устойчиво занимает второе место после рака легкого. Ежегодно диагностируется более 900 ООО новых случаев заболевания раком желудка [14].
Россия относится к странам с наивысшими показателями заболеваемости раком этой локализации
Взаимоотношения иммунной системы и опухоли являются одной из важнейших проблем онкоиммунологии. Ежедневно в любом организме появляются десятки тысяч трансформированных клеток. При нормальном функционировании иммунной системы, особенно клеточного иммунитета, иммуно-компетентные клетки распознают и элиминируют злокачественно перерожденные. В тех случаях, когда имеет место дефект иммунологической регуляции, не происходит адекватного распознавания трансформированной клетки, что приводит к формированию клона опухолевых клеток, а соответственно образованию и росту опухоли. Механизмы,
Адрес для переписки:
185610, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11.
Институт биологии КарНЦ РАН.
Тел.: (814-2)-55-85-93.
Факс: (814-2)-77-98-10.
Р-тпИг п]р.(ГйЪгс Ьлгр.Ил т
(более 40 на 100000 населения). В настоящее время рак желудка в России по частоте занимает второе место у мужчин и третье место у женщин среди всех злокачественных новообразований [1]. Максимальная заболеваемость лиц обоего пола зарегистрирована в Северном (соответственно, 42,8 и 17,6 на 100 тыс. человек), Северо-Западном (42,5 и 19,2), Волго-Вятском (41,9 и 17,6) и Дальневосточном (41,2 и 16,7) экономических районах. Республика Карелия относится к неблагоприятным регионам по уровню заболеваемости раком желудка. Одной из причин высокой частоты встречаемости рака данной локализации в Карелии является наличие характерных почв, содержащих недостаточное количество ряда микроэлементов [2].
Несмотря на расширение и совершенствование методов диагностики возможность раннего выявления опухолей желудка ограничена. В 1996 году рак желудка 1-П стадии был диагностирован лишь в 17.5% [5]. В результате подавляющее большинство выявляемых случаев рака данной локализации приходится на поздние стадии заболевания, что предопределяет неблагоприятный прогноз для лечения и высокий уровень летальности на первом году с момента установления диагноза (до 55.5%). В связи с этим представляет особый интерес развитие и внедрение новых методов диагностики и мониторинга данной патологии.
В литературе немного исследований, в которых уделяется внимание особенностям экспрессии поверхностных антигенов на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка, и при этом
они носят противоречивый характер. Ряд работ указывают на отсутствие изменений популяционного состава лимфоцитов периферической крови больных с опухолями желудка. Одновременно не выявлены изменения уровня экспрессии HLA-DR+лимфоцитов при данной патологии [3; 13]. В то же время некоторые авторы отмечают снижение уровня субпопуляций T(CD3, CD4, CD8)-, B(CD19)- и NK(CD 16)-лимфоцитов периферической крови у больных раком желудка. Причем эти изменения усиливаются по мере прогрессирования заболевания [11]. Но есть данные и об увеличении уровня СБ8+лимфоцитов в периферической крови больных раком данной локализации [12].
В связи с этим была поставлена задача: изучить уровень экспрессии маркеров основных субпопуляций лимфоцитов и активационных антигенов на мононуклеарных клетках периферической крови у больных раком желудка, проживающих в Карелии. Так как Карелия, как указано выше, является эндемичной зоной по раку желудка, то мы изучаем эту патологию, связывая ее с региональными особенностями.
Материалы и методы
Обследовано 45 больных раком желудка I-IV стадии. В группу обследованных вошли женщины (27%) и мужчины (73%) в возрасте от 38 до 76 лет. Пациенты были разбиты на группы: по возрасту (до 60 лет (16 человек) и после 60 лет (29 человек)), по полу, по месту жительства, по стадии заболевания,
HLA-DR
I I I I I I I I
CD4 CD8 CD16 CD19
■ контроль
до 60 лет □ после 60 лет
I-II стадии ■ III стадия ■ IV стадия
Рис.1. Зависимость экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах периферической крови от возраста больных раком желудка.
Рис.2. Уровень основных субпопуляций лимфоцитов на различных стадиях рака желудка.
по локализации опухоли и по типу гистологического строения. Стадия онкопроцесса и тип строения опухоли устанавливались после оперативного вмешательства и гистологического исследования операционного материала. В качестве контроля обсле-
довано 38 практически здоровых людей (мужчин -18, женщин - 20) в возрасте от 17 до 68 лет. Моно-нуклеарные клетки крови получали из гепаринизи-рованной венозной крови на градиенте плотности фиккол-верографин (1.077 г/мл). Субпопуляцион-
Табл. 1. СОДЕРЖАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА, ПРОЖИВАЮЩИХ В КАРЕЛИИ
Субпопуляции лимфоцитов Контроль (п-38) Больные раком желудка
Всего (п=45) Женщины (п=12) Мужчины (п=33)
+ со о о % 57.55±3.77 61.73±2.80 60.33+5.42 62.24±3.38
абс. 1013±66 1049+47 953±86 1052±57
СР4+ % 29.78±3.23 32.84±2.47 31.00±4.47 33.51+3.01
абс. 524+57 558+42 490±71 566+51
+ СО О О % 28.83+4.37 31,20±2.35 30.58+6.10 31.42+2.53
абс. 507±77 530±40 483±96 531 ±43
С016+ % 16.05±3.72 20.29±2.54 19.58+2.78 20.54+3.36
абс. 282±65 345±43 309±44 347±57
СЭ19+ % 12.11 ±3.83 18.18+2.24* 17.75+4.77 18.33±2.63
абс. 213±67 309+38 280+75 310+47
СР25+ % 15.77±2.35 17.20±6.74 15.24±2.39
абс. Нет данных 268±40 272±106 257+40
СЭ7Г % 8.55±4.06 15.97±2.02* 18.25+3.59* 15.14±2.43*
абс. 150±71 271+34 288±57* 256±41
С095+ % 8.00+4.60 15.81±2.11* 18.25±4.26* 14.89±2.46
абс. 141+81 269+36* 289±67* 252±41
С098+ % 13.88±2.26 14.80±3.88 13.54±2.88
абс. Нет данных 236±38 234±61 229±49
НЬА-ОРГ % 15.83±2.71 18.84±2.02 20.50+4.26 18.24±2.36
абс. 279±47 320±34 324±67 308±40
Примечание. *р<0.05 по сравнению с контролем; все абс. показатели приведены в расчете на 1ммі крови.
Табл. 2. УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ АКТИВАЦИОННЫХ МАРКЕРОВ ЛИМФОЦИТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ РАКА ЖЕЛУДКА
Активационные антигены контроль (п=38) І-ІІ стадии (п=13) III стадия (п=22) IV стадия (п=10)
С07Г % 8.55±4.06 14.33±3.36 16.02+3.46 16.44±3.63*
абс. 150+71 264±62 291 ±63* 215±47
С025+ % 12.22±3.81 17.57±5.16 16.78±3.13
абс. Нет данных 225±70 320±94 218±41
С095+ % 8.00±4.60 15.67±4.12 16.66±3.69* 13.78±5.62
абс. 141±81 288+76 303+67* 180±74
О о со со + % 15.00±3.04 14.63±4.32 13.00±6.27
абс. Нет данных 276±56 266±79 170±82
Н1А-0РГ % 15.83±2.71 17.50±4.34 21,60±3.13 17.00±4.41
абс. 279±47 322+79 393±57* 223±58
Примечание. *р<0.05 по сравнению с контролем; все абс. показатели приведены в расчете на 1ммі крови.
ный состав лимфоцитов исследовали с использованием моноклональных антител ЛТ фирмы “Сорбент ТМ”, Москва, соответственно к молекулам CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD45, CD71, CD95, CD98 и HLA-DR методом непрямой иммунофлюоресценции [4]. Оценивали флюоресценцию не менее чем 200 клеток. В каждом опыте проводили кон-
CD25
CD71
CD95
CD98 HLA-DR
□ высокодифференцированная аденокарцинома ■ низкодфференцированная аденокарцинома в перстневидно-клеточный рак
уровень лимфоцитов <19% уровень лимфоцитов 19%-37%
□ уровень лимфоцитов >37%
Рис.4. Зависимость экспрессии дифференцировочных антигенов от количества лимфоцитов в крови.
троль неспецифического связывания меченой сыворотки. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием I критерия Стьюдента.
Результаты
Рис.З. Влияние гистологического строения опухоли желудка на уровень экспрессии активационных маркеров.
70% і
В общей группе больных раком желудка выявлено увеличение количества В-лимфоцитов, тогда как значительных изменений субпопуляций Т-лим-фоцитов и !^1К-клеток не отмечено. В то же время у онкологических больных заметно выше оказался уровень экспрессии активационных антигенов (СБ71 и СБ95) на лимфоцитах периферической крови, причем наиболее выражены оказались эти изменения у пациентов женского пола (таблица 1).
Сравнение иммунологических показателей в зависимости от возраста пациентов показало значительное усиление экспрессии а-цепи рецептора 1Ь-2 (СБ25) в группе больных старше 60 лет (18,36±3,25% по сравнению с 11,97±2,63% у лиц моложе 60 лет). У этой же группы больных отмечено некоторое повышение уровня СБ71+ и С095+лимфоцитов (рис. 1).
Особый интерес представляет исследование экспрессии дифференцировочных и активационных антигенов на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка на различных стадиях онкопроцесса. Мы разделили больных на три группы в зависимости от стадии заболевания: 1-П (29% пациентов), III (49%) и IV стадии (22%). Отмечено, что по мере прогрессирования процесса имеется незначительная тенденция к снижению СОЗ+клеток, тогда как уровень остальных субпопуляций лимфоцитов существенно не изменялся от стадии заболевания (рис. 2). Особенности экспрессии активационных маркеров на различных стадиях рака желудка представлены в таблице 2.
Поскольку в литературе нет данных о зависимости экспрессии поверхностных антигенов на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка от типа гистологического строения, мы изучали эти показатели при аденокарциноме и перстневидно-клеточном раке желудка. В исследуемой группе высокодифференцированная аденокарцинома была выявлена у 62% больных, низкодифференцированная у 19% и перстневидно-клеточный рак у 19% лиц с опухолью желудка. Наиболее существенные изменения наблюдали в особенностях экспрессии СВ98 при этих типах опухолей. При раке со сниженной дифференцировкой отмечен более низкий уровень С098+лимфоцитов, чем при высокодифференцированной аденокарциноме (9,75±4,76% и 9,50±1,72% при низкодифференцированной аденокарциноме и перстневидно-клеточном раке соответственно по сравнению с 17,71±3,48% при высокодифференцированной аденокарциноме). Уровень
экспрессии других активационных антигенов при этих видах рака показан на рисунке 3. Количественных изменений основных субпопуляций лимфоцитов в зависимости от типа гистологического строения опухоли не выявлено.
Была прослежена связь между относительным количеством лимфоцитов, определяемым в клиническом анализе крови, и уровнем экспрессии поверхностных маркеров. На рисунке 4 показано, что по мере снижения количества лимфоцитов уменьшается число клеток, несущих маркеры СБЗ и СБ4 и увеличивается уровень СБ19 'лимфоцитов. Показатели экспрессии активационных антигенов изменялись незначительно в зависимости от количества лимфоцитов. Таким образом, полученные данные показали, что у наших больных снижение числа лимфоцитов характеризуется падением уровня Т-клеток.
Обсуждение
В целом, при раке желудка нет существенных изменений уровня основных субпопуляций лимфоцитов, что подтверждается рядом работ как отечественных, так и зарубежных авторов [3; 13]. По мере прогрессирования заболевания отмечается незначительная тенденция к снижению уровня СОЗ+клеток, в то же время показатели СВ4+, СБ8+, С016+ и СБ19+лимфоцитов не изменяются в зависимости от стадии заболевания. Подобная закономерность описана при раке пищевода и кардиального отдела желудка [7].
Сравнительная оценка показателей активированных лимфоцитов периферической крови показала усиление экспрессии СБ71 и СГ395 антигенов при данной патологии. Повышение уровня СБ95+лимфоцитов периферической крови отмечено при опухолях других локализаций, например, рак толстой кишки [9], рак тела матки [6]. В последнем случае экспрессия СБ95 коррелировала с экспрессией С071, что также выявлено в нашем исследовании. Повышение экспрессии СБ95 на лимфоцитах периферической крови, вероятно, указывает на усиление Т-клеточного апоптоза при раке желудка. В литературе имеются упоминания о том, что при раке желудка происходит активация каспаз Т-лимфоцитов крови, что является также свидетельством усиления апоптоза [16]. В зависимости от возраста пациентов отмечено значительное усиление экспрессии С025 и повышение уровня СБ71+ и СВ95+лимфоцитов у больных старше 60 лет. Правда, подобные изменения отмечены и у относительно здоровых лиц [8; 15], что говорит об особенностях функционального состояния иммунной системы у пожилых лиц, связанных с сопутствующими и ранее перенесенными заболеваниями в течение жизни (своеобразный иммунологический опыт индиви-
да). Исследование уровня экспрессии активационных антигенов на лимфоцитах периферической крови при разных гистологических типах опухолей желудка выявило высокий уровень экспрессии CD98 при высокодифференцированной аденокарциноме по сравнению с низкодифференцированным раком. CD98 известен как ранний Т-клеточный активационный антиген, который интенсивно экспрессируется на поверхности активированных лимфоцитов и различных опухолевых клетках [10]. Полученные данные об экспрессии CD98 на лимфоцитах периферической крови при аденокарциноме и перстне-видно-клеточном раке представляют особый интерес и требуют дальнейшего исследования в этом направлении.
Усиление экспрессии ряда активационных маркеров на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка характеризует нарушение иммунологического равновесия и может использоваться для определения степени иммуносупрессии, а также должно учитываться в комплексной оценке состояния иммунной системы при онкологических заболеваниях желудка.
Работа поддержана РФФИ (грант № 98-04-03521).
Список литературы
1. Вишняков A.A. Современные аспекты клиники, диагностики и лечения рака желудка // Русский медицинский журнал. - 1998. - Т.6. - №10.
2. Клименков A.A., Патютко Ю.И., Губина Г.И. Опухоли желудка. - М.: Медицина, 1988.
3. Лыков А.П., Басс A.A., Ложкин И.Д., Егоров Д.Н., Вардосанидзе К.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Цитотоксическая активность клеток крови у больных раком желудка с различной активностью нервной системы // Иммунология. - 2000. - №6. - С. 43-46.
4. Стандартизация методов иммунофенотипиро-вания клеток крови и костного мозга (методические рекомендации) // Мед. иммунология. - 1999. -Т.1. - №5. - С. 21-43.
5. Трапезников H.H., Аксель Е.М. Состояние онкологической помощи населению стран СНГ. - М.: РАМН, ОНЦ. - 1996.
6. Baryshnikov A.Yu., Polosukhina E.R., Zabotina T.N., Lazareva N.I., Lukashina M.I., Shishkin Yu.V., Chinarjova I.V., Tenuta M.R., Metelitsa I.S., Kadagidze Z.G. Fas (APO-1/CD95) antigen: new activation marker for evaluation of the immune status // Russian Journal of Immunology. - 1997. - Vol. 2. - №2. - P. 115-120.
7. Bentdal O.H., Froland S.S., Bosnes V., Bergan A., Soreide О., Fiatmark A. Alterations in lymphocyte subsets in blood may predict resectability in carcinoma of cardia or oesophagus // Cancer Lett. - 1996. - Vol.100 (1-2). - P. 133-138.
8. Born J., Uthgenannt D., Dodt C., Nunninghoff D., Ringvolt E., Wagner T., Fehm H.L. Cytokine production and lymphocyte subpopulations in aged humans. An assessment during nocturnal sleep // Mech. Ageing Dev. - 1995. - Vol.84 (2). - P. 113-126.
9. Donina S., Engele L., Jaunalksne I., Zakenfelds G. TNF-a and CD95+cells in peripheral blood in colorectal cancer and benign large bowel patients // Annals of Oncology. - 2000. - Vol. 11, Suppl. 4. - P. 47.
10. Hara K., Kudoh H., Enomoto T., Hashimoto Y., Masuko T. Malignant transformation of NIH3T3 cells by overexpression of early lymphocyte activation antigen CD98 // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1999. - Vol.262 (3). - P. 720-725.
11. Hong W.S., Min Y.I., Son Y.S., Hong S.I. Peripheral blood lymphocyte subsets in patients with stomach cancer //J. Korean Med. Sci. - 1995. - Vol.10, Issue 3. - P. 164-168.
12. Kim C.W., Choi S.H., Chung E.J., Lee M.J., Byun E.K., Ryu M.H., Bang Y.J. Alteration of signal-transducing molecules and phenotypical characteristics
in peripheral blood lymphocytes from gastric carcinoma patients // Pathobiology. - 1999. - Vol. 67 (3). - P. 123-128.
13. Koyama S., Ebihara T., Fukao K., Osuga T. [Two-color flow cytometry analyses of peripheral blood lymphocytes (PBL) and lymphokine-activated PBL in gastric cancer patients] // Gan No Rinsho. - 1988. -Vol.34 (4). - P. 435-441.
14. Munoz N., Franceschi S. Epidemiology of gastric cancer and perspectives for prevention // Salud Publica Mex. - 1997. - Vol.39. - P. 318-330.
15. Schindowski K., Leutner S., Muller W.E., Eckert A. Age-related changes of apoptotic cell death in human lymphocytes //Neurobiol. Aging. - 2000. - Vol.21 (5). - P.661-670.
16. Takahashi A., Kono K., Amemiya H., Iizuka H., Fujii H., Matsumoto Y. Elevated caspase-3 activity in peripheral blood T cells coexists with increased degree of T-cells apoptosis and down-regulation of TCR zeta molecules in patients with gastric cancer // Clin. Cancer Res. - 2001. - Vol.7 (1). - P. 74-80.
поступила в редакцию 15.11.2002 принята к печати 05.12.2002
