CC BY
23
«Вестник хирургии»*2009
ВОПРОСЫ ОБЩЕЙ И ЧАСТНОЙ ХИРУРГИИ
© Коллектив авторов, 2009 УДК 616.137.83/.93-004.6:612.6.05
Н.А.Кленкова, С.И.Капустин, Н.Б.Салтыкова, В.М.Шмелева, М.Н.Блинов
ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА ГОМОЦИСТЕИНА И ФОЛАТОВ У БОЛЬНЫХ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ АРТЕРИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ
Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии (дир. — чл.-кор. РАМН проф. Е.А.Селиванов) Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, Санкт-Петербург
Ключевые слова: атеросклероз, ген, гипергомоци-стеинемия, полиморфизм.
Введение. Атеросклероз артерий нижних конечностей (ААНК) относится к числу наиболее распространенных и прогностически неблагоприятных проявлений артериальной патологии [1]. Многочисленные исследования убедительно свидетельствуют о многофакторном генезе данного заболевания, включая существенный вклад генетической предрасположенности к его развитию [7]. Независимым фактором риска возникновения и прогрессия атеросклероза является повышенное содержание в плазме крови гомоцистеина (ГЦ) — высокореактивной серосодержащей аминокислоты, являющейся промежуточным продуктом метаболизма метио-нина [6]. Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) может быть обусловлена как наследственными, так и приобретенными факторами (курение, чрезмерное употребление кофе, сниженное потребление фолатов и витаминов Вб и В^, прием некоторых лекарственных препаратов), а также рядом заболеваний (сахарный диабет, почечная недостаточность, некоторые солидные опухоли и др.). Поиск генетических вариантов, предрасполагающих к ГГЦ и повышенному риску атеросклероза, является актуальной задачей. В этой связи особый интерес привлекает аллельный полиморфизм генов, продукты которых непосредственно вовлечены в процессы метаболизма метионина и фолатов. Наряду с исследованной многими авторами нуклеотидной заменой С677Т в гене метилентетрагидрофолат редуктазы (МТЫБЯ), возможное влияние на уровень ГЦ могут оказывать иные аллельные варианты — А1298С, а также ряда других генов — метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (МТЫББ 01958Л),
метионинсинтазы (MS A2756G), редуктазы мети-онинсинтазы (MTRR A66G).
Цель исследования — выявить ассоциацию между аллельным полиморфизмом генов, вовлеченных в метаболизм метионина (MS A2756G, MTRR A66G) и фолатов (MTHFR C677T и A1298C, MTHFD G1958A), и риском возникновения ГГЦ у больных с ААНК.
Материал и методы. Обследованы 126 больных с ААНК (102 мужчины, 24 женщины), проходивших лечение в клиническом отделении «Хирургия» нашего института. Средний возраст больных составил (60,5±1,5) лет. Клинический диагноз подтверждался данными ультразвукового дуплексного сканирования или/и ангиографии. Критерием отбора пациентов в исследуемую группу являлось отсутствие в анамнезе заболеваний, ассоциированных с риском развития ГГЦ. Контрольная группа, сопоставимая по полу и возрасту группе больных, состояла из 121 индивида (кадровых доноров крови и сотрудников нашего института), не имевших в анамнезе заболеваний, обусловленных артериальной патологией. Материалом для идентификации аллельных вариантов MTHFR С677Г, MTHFR A1298C, MS A2756G, MTRR A66G и MTHFD G1958A являлись лейкоциты, выделенные из 3-5 мл венозной крови больных с ААНК и людей контрольной группы. Для генотипирования был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (ПЦР-ПДРФ). Концентрацию ГЦ в плазме крови (уровень ГЦ) определяли с помощью жидкостной хроматографии под высоким давлением, в качестве верхней границы «нормы» было принято значение 13,5 мкмоль/л [2].
Статистический анализ выполняли с использованием программ GraphPad Prism4 и StatGraphics Plus 5.1. Оценку межгрупповых различий в распределении аллелей и генотипов проводили с использованием точного теста Фишера. Показатель «отношение шансов» («odds ratio» — OR) определяли при двустороннем доверительном интервале («confidence interval» — CI), равном 95%. Статистическую значимость различий устанавливали при значениях p<0,05.
Результаты и обсуждение. В зависимости от уровня ГЦ, обследованные больные
были разделены на две подгруппы. 1-ю составили 40 (31,7%) пациентов с ГГЦ, 2-ю — 86 (68,3%) человек с нормальной концентрацией ГЦ в плазме крови (<13,5 мкмоль/л). Средний уровень ГЦ составил в указанных подгруппах 19,9 и 9,7 мкмоль/л соответственно (р<0,0001). В распределении по полу и возрасту статистически значимых различий между выделенными подгруппами не было.
В таблице представлены частоты встречаемости (ЧВ) генотипов у больных с ГГЦ и без нее, а также в группе контроля. В распределении аллель-ных вариантов большинства изученных генов были выявлены существенные различия между подгруппами пациентов. В частности, среди пациентов с ГГЦ доля носителей аллеля МТЫБЯ 677Т составила 67,5%, что статистически значимо превысило соответствующий показатель у больных с нормальным уровнем ГЦ — 46,5% (ОЯ=2,4; 95% С1: 1,1-5,2; р=0,03), а также в контрольной группе — 47,9% (ОЯ=2,3; 95% С1: 1,1-4,8; р=0,04). Особенно заметным оказалось увеличение ЧВ гетерозиготного генотипа МТЫБЯ 677СТ в подгруппе пациентов с ГГЦ (55% против 36,1% у больных с нормальным уровнем ГЦ (ОЯ=2,2; 95% С1: 1,0-4,7; р=0,05). Несмотря на то, что большинство авторов в качестве возможной причины развития ГГЦ рассматривают лишь гомозиготное носительство аллеля МТЫБЯ 677Т [4], полученный результат свидетельствует в пользу гипотезы о «доминантном» характере влияния варианта
677Т на уровень ГЦ и соответственно необходимости рассмотрения гетерозиготного генотипа (677СТ) в качестве значимого наследственного фактора риска ГГЦ.
Характерные для группы больных с ГГЦ особенности были выявлены и при анализе другого полиморфизма гена МТЫБЯ (А1298С), приводящего к замене глутамина на аланин (Е433А) в аминокислотной последовательности этого фермента. Доля носителей аллеля 1298А в указанной подгруппе (97,5%) статистически значимо превысила таковую у пациентов с нормальным уровнем ГЦ — 82,6% (ОЯ=8,2; 95% С1: 1,0-64,8; р=0,02), а также была существенно выше, чем у людей контрольной группы — 87,6% (ОЯ=1,7; 95% С1: 0,9-3,0; р=0,09). Генотип 1298СС обнаруживался лишь у 1 (2,5%) больного с ГГЦ, т.е. почти в 7 раз реже, чем среди пациентов с уровнем ГЦ в пределах «нормы» — 17,4% (ОК^,^; 95% С1: 0,02-0,95; р=0,02). Имеющиеся в литературе данные о влиянии полиморфизма МТЫБЯ А1298С на уровень ГЦ весьма противоречивы. Большинство исследователей указывают на отсутствие такого влияния либо считают обнаруживаемый эффект следствием генетического сцепления между полиморфными позициями 677 и 1298 в гене МТЫБЯ. Тем не менее, авторы исследования [3] при одновременном рассмотрении мутаций С677Т и А1298С выявили некоторое снижение концентрации ГЦ в плазме крови у лиц с сочетанием 677СС/1298СС по сравнению с таковым у пациен-
Распределение генотипов у больных с атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от наличия гипергомоцистеинемии
Ген/полиморфизм Генотип Частота встречаемости генотипа, п (%)
больные с ГГЦ (п=40) больные без ГГЦ (п=86) здоровые (п=121)
MTHFR/C677T ГС 13 (32,5)* 46 (53,5) 63 (52,1)
СТ 22 (55) 31 (36) 48 (39,6)
ТТ 5 (12,5) 9 (10,5) 10 (8,3)
MTHFR/A1298C М 22 (55,0) 38 (44,2) 53 (43,8)
АС 17 (42,5) 33 (38,4) 53 (43,8)
СС 1 (2,5)* 15 (17,4) 15 (12,4)
MS/A2756G М 30 (75,0) 50 (58,1) 73 (60,3)
AG 9 (22,5) 32 (37,2) 40 (33,1)
GG 1 (2,5) 4 (4,7) 8(6,6)
MTRR/A66G М 7 (17,5) 13 (15,1) 18 (14,9)
AG 17 (42,5) 49(57) 75 (62)
GG 16 (40)** 24 (27,9) 28 (23,1)
MTHFD/G1958A GG 13 (32,5) 19 (22,1) 30 (24,8)
GA 20 (50) 48 (55,8) 63 (52,1)
М 7 (17,5) 19 (22,1) 28 (23,1)
* p<0,05 (сравнение с группой больных без ГГЦ).
* p<0,05 (сравнение с здоровыми).
Том 168 • № 6
Полиморфизм генов у больных с ААНК
тов с комбинацией 677СС/1298АА. Полученные нами результаты соответствуют этим данным и, возможно, свидетельствуют о протективной роли аллеля 1298С гена МТЫБЯ в развитии ГГЦ. Однако для окончательного подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие исследования, в том числе и в группе здоровых лиц.
При анализе полиморфизма А27560 в гене метионинсинтазы нами было установлено существенное увеличение ЧВ генотипа 2756АА у больных с ГГЦ (75,0% против 58,1% у пациентов с нормальным уровнем ГЦ; ОЯ=2,2; 95% С1: 0,9-5,0; р=0,07). Данный показатель значительно превышал соответствующее значение и в КГ — 60,3% (ОЯ=2,0; 95% С1: 0,9-4,4; р=0,13). Отсутствие статистической значимости выявленных различий не позволяет с уверенностью говорить о наличии корреляции между генотипом М8 2756АА и риском развития ГГЦ. Результаты исследований, посвященных изучению ассоциации между аллельными вариантами гена М8 и уровнем ГЦ, носят неоднозначный характер. Как известно, Мв является катализатором реакции переноса метильной группы от 5-метилтетрагидрофолата к ГЦ, в результате которой синтезируются метио-нин и тетрагидрофолат. Нуклеотидная замена А27560 приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин в позиции 919 аминокислотной последовательности фермента (Б9190) и, предположительно, является функционально значимой, оказывая влияние на эффективность его взаимодействия с кофактором — витамином В12 [5]. Для подтверждения роли полиморфизма Мв А27560 в формировании предрасположенности к развитию ГГЦ и(или) ААНК, безусловно, необходимы дальнейшие исследования, в том числе направленные на поиск возможных эффектов на уровне «ген-генных взаимодействий».
В подгруппе больных с ГГЦ также наблюдалось заметное увеличение доли гомозиготных носителей аллеля 660 гена МТЯЯ (40,0% против 27,9% у пациентов с нормальным уровнем ГЦ; ОЯ=1,7; 95% С1: 0,8-3,8; р=0,22). При сравнении с контрольной группой различие по этому показателю оказалось статистически значимым (40,0% против 23,1%; ОЯ=2,2; 95% С1: 1,0-4,7; р=0,04). Таким образом, несмотря на противоречивость данных ряда зарубежных авторов о влиянии полиморфизма МТЯЯ А660 на концентрацию ГЦ в плазме крови, наши результаты позволяют сделать предположение о неблагоприятной роли гомозиготного генотипа МТЯЯ 6600 в развитии ГГЦ и ассоциированного с ней ААНК. Кроме того, среди больных с повышенным уровнем ГЦ почти в 1,5 раза чаще встречались лица с генотипом 195800 гена МТЫББ (32,5% против 22,1%
в группе пациентов с нормальным содержанием ГЦ; ОЯ=1,7; 95% С1: 0,7-3,9; р=0,27), однако указанное различие не достигало пределов статистической значимости. К настоящему времени практически отсутствуют данные относительно возможного влияния полиморфизма МТЫББ 01958А на уровень ГЦ в плазме крови и риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.
В результате проведенного нами анализа аллельного полиморфизма некоторых генов, вовлеченных в метаболизм метионина и фолатов, в группе больных с ААНК обнаружены значительные различия в распределении отдельных аллелей и/или генотипов в подгруппах пациентов, выделенных в зависимости от уровня ГЦ в плазме крови. Выявленное преобладание носителей определенных аллельных вариантов среди больных с ГГЦ свидетельствует о влиянии соответствующих генетических вариаций на функциональную активность кодируемых ферментов и риск развития ГГЦ. Важно отметить, что в подгруппе больных с нормальным содержанием ГЦ в плазме проведенный анализ не обнаружил отличительных особенностей при сравнении с выборкой здоровых лиц. Более того, отсутствие статистически значимых различий в распределении изученных генетических вариантов наблюдалось и при сравнении общей группы пациентов с нормой. Полученные результаты отражают гетерогенность молекулярного патогенеза атеросклероза и подчеркивают важность учета данных клинико-лабораторного обследования больных для адекватной оценки роли генетических факторов в возникновении и прогрессии заболевания.
Выводы. 1. Аллельный полиморфизм генов, вовлеченных в метаболизм метионина и фолатов, играет важную роль в формировании ГГЦ и увеличении риска возникновения ААНК.
2. Частоты встречаемости аллелей МТЫБИ 677Т и 1298А в подгруппе больных с ААНК с ГГЦ статистически значимо превышают соответствующие значения у пациентов с нормальной концентрацией ГЦ в плазме крови. По сравнению со здоровой популяцией в подгруппе больных с ГГЦ достоверно чаще обнаруживается носитель-ство вариантов МТЫБЯ 677Т и МТЯЯ 6600.
3. Влияние наследственной компоненты на предрасположенность к развитию ГГЦ носит полигенный характер и требует дальнейшего изучения, в том числе анализа «ген-генных взаимодействий» неблагоприятных аллельных вариантов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Климов А. Н. Атеросклероз // Превентивная кардиология.—М.:
Медицина, 1987.—С. 239-316.
2. Шмелева В.М., Капустин С.И., Блинов М.Н., Папаян Л.П. Гипергомоцистеинемия — значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов // Мед. акад. журн.— 2003.—№ 4.—C. 28-34.
3. Friedman G., Golsschmidt N., Friedlander Y et al. A common mutation A1298C in human methylenetetrahydrofolate reductase gene: association with plasma homocysteine and folate concentrations // J. Nutr.—1999.—Vol. 129.—P. 1656-1661.
4. Harmon D.L., Woodside J.V., Yarnell J.W. et al. The common «thermolabile» vaiant of methylenetetrahydrofolate reductase is a major determinant of mild hyperhomocysteinemia // QJM.— 1996.—Vol. 89, № 8.—P. 571-577.
5. Leclerc D., Campeau E., Goyette P et al. Human methionine synthase: cDNA cloning and identification of mutations in patients of the cblG complementation group of folate/cobalamin disorders // Hum. Mol. Genet.—1996.—Vol. 5.—P. 1867-1874.
6. Lievers K.J., Kluijtmans L.A., Blom H.J. Genetics of hyperhomocysteinemia in cardiovascular disease // Ann. Clin. Biochem.— 2003.—Vol. 40.—P. 46-59.
7. Valentine R.J., Guerra R., Stephan P. et al. Family history is a major determinant of subclinical peripheral arterial disease in young adults // J. Vasc. Surg.—2004.—Vol. 39.—P. 351-356.
Поступила в редакцию 15.07.2009 г.
N.A.Klenkova, S.I.Kapustin, N.B.Saltykova, V.M.Shmeleva, M.N.Blinov
FEATURES OF ALLELE POLYMORPHISM OF GENES INVOLVED IN HOMOCYSTEINE AND FOLATE METABOLISM IN PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS OF THE LOWER EXTREMITY ARTERIES
Under study were features of allele polymorphism of genes of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T and A1298C), methionine synthase (MS A 2756G), methionine synthase reductase (MTRR A66G) and methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (MTHFD G1958A) in patients with atherosclerosis of the lower extremity arteries (ALEA). Patients with hyperhomocysteinemia (HHcy) had statistically significant increase of allele MTHFR 677T and MTRR 66GG as compared both with the control group and with the group of patients without HHcy. It suggests that polymorphism of genes involved in homocystein and folate metabolism might affect the risk of HHcy in patients with ALEA.
