CC BY
461
УДК 615.07
ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА MALDI/TOF/MS В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
Д.И. ПИСАРЕВ1, О.О. НОВИКОВ1 Г.В. ВАСИЛЬЕВ1, О.А. СЕЛЮТИН2
1 Белгородский государственный национальный исследовательский университет
2 Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств, г.Воронеж
e-mail: pisarev@bsu.edu.ru
Введение. В данной статье представлены результаты собственных исследований, посвященных разработке методологии анализа некоторых тест-препаратов, относящихся к различным химическим группам, с помощью метода MALDI/TOF/MS. Выбор объектов исследования является практически случайным, так как именно такой подход, на наш взгляд, в полной мере позволил наглядно показать возможности метода масс-спектрометрии, широту его аналитических возможностей.
Кроме того, предлагаемые наборы разработанных методик имеют реальную практическую значимость, так как решают в достаточной степени весь спектр аналитических задач, связанных с конкретными объектами исследования.
Для решения задач, стоящих перед современной химией и фармацией, требуется использование методов быстрого и надежного анализа на молекулярном уровне как индивидуальных веществ, так и сложных смесей. Использование классических методов разделения (колоночная, тонкослойная, бумажная хроматография) и анализа (УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопия) до сих пор широко распространено, поскольку предоставляет большой объем важной информации о строении соединения. Так, УФ-спектр указывает на тип ароматической системы или сопряжденного хромофора, ИК-спектр позволяет обнаружить наличие функциональных групп, спектр ЯМР позволяет определить атомы, входящие в молекулу, и то, как они между собой соединены химическими связями, т. е. определить или подтвердить структуру вещества (основная задача метода). Эти методы не требуют дорогостоящего аппаратурного оснащения (исключение ЯМР). Однако их использование в большинстве случаев оправдано только тогда, когда устанавливается структура нового соединения, поскольку они имеют ряд существенных недостатков. В частности, требуют наличия большого количества образца в очень чистом состоянии, сопровождаются длительной пробоподготовкой, имеют недостаточную чувствительность, экспрессность и селективность, характеризуют какой-либо один структурный элемент молекулы, что обусловливает их совокупное использование для характеристики вещества, часто сопряжены с использованием базы данных.
Поэтому для анализа биологически активных веществ в настоящее время наибольшее распространение приобрели хроматографические методы, а именно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ). Настоящие хроматографические методы являются многоканальными источниками информации, то есть с их помощью одновременно реализуется большое число параметров, характеризующих разделение, идентификацию, количественную оценку компонентов. Метод ВЭЖХ является более гибким, чем ГЖХ, что определяется его возможностью определения термолабильных и малолетучих веществ. Поэтому ВЭЖХ
В статье представлены результаты исследований, посвященных разработке методологии анализа некоторых тест-препаратов, относящихся к различным химическим группам, с помощью метода MALDI/TOF/MS.
Ключевые слова: масс-спектрометрия, карно-
зин, резвератрол, флавоноиды.
идеально отвечает всем требованиям, предьявляемым к аналитическим методам по селективности и чувствительности. Метод ВЭЖХ, однако, не всегда удобен из-за его низкой пропускной способности и большой продолжительности исследований.
Несмотря на практически полное отсутствие слабых сторон ВЭЖХ, конкуренцию ему может составить масс-спектрометрический метод (МС).
Установлено, что с помощью МС решается большое количество аналитических задач. Качественные исследования используются для установления структуры неизвестных органических соединений различного происхождения, в том числе природных, синтетических, метаболитов лекарственных веществ. МС дает важную информацию для определения молекулярной массы, структуры молекул. Среди масс-спектрометрических методов метод MALDI/TOF/MS стал мощным аналитическим инструментом в химических и биологических исследованиях за счет высокой производительности и чувствительности, мягкой и эффективной ионизации нелетучих веществ, толерантности к присутствию примесей, быстроте определения молекулярных масс, а также относительной простоте получаемых масс-спектров [1, 2].
Несмотря на это, МС до сих считается методом, дополняющим информацию, получаемую с помощью других физических методов. К тому же зачастую МС — это весьма удобный метод детекции результатов хроматографического разделения [З-5].
Существующий подчиненный характер данного метода ограничивает его применение в индивидуальном приложении для анализа таких весьма сложных объектов, как природные соединения. Имеющиеся в литературе данные [4-7] по изучению с помощью масс-спектрометрии природных соединений не имеют системного характера, поэтому требуют обобщения.
Нами выбран метод MALDI для разработки количественного определения, поскольку он имеет значительные преимущества перед другими методами масс-спектрометрии, основные из которых перечислены в таблице.
Как видно из данных таблицы, конкурентные MALDI/TOF/MS методы электро-спрейной ионизации и химической ионизации при атмосферном давлении имеют исключительно вторичный характер в качестве детекторов в методе ВЭЖХ и самостоятельного применения не имеют. К тому же метод ESI/MS требует нахождения вещества в растворенном виде в полярном растворителе, что подходит для анализа только полярных соединений. Хотя этого недостатка лишен метод APCI/MS, однако при его использовании возможно термическое разложение образца.
Чтобы полностью и реалистически оценить возможности MALDI/TOF/MS, необходимо установить его сильные и слабые стороны.
Основные достоинства метода:
1. Универсальность. Метод MALDI/TOF/MS подходит для анализа соединений любой степени сложности, полярности и термочувствительности.
2. Высокая чувствительность. Замечательной особенностью МС является сверхвысокая чувствительность, недостижимая никакими другими методами. Следствием этого является возможность обойтись незначительным количеством образца для анализа.
3. Широкий диапазон измерений масс. Метод MALDI/TOF/MS позволяет определять молекулярную массу соединений от 0 до 300000 дальтон.
4. Использование для неочищенных образцов. Вследствие дифференцирующей возможности времяпролетного анализатора масс (TOF/MS), на одном спектре можно наблюдать наличие всех компонентов сложной смеси без предварительного сложного и длительного по времени ее разделения и очистки на индивидуальные компоненты. Следовательно, для анализа не требуется сложной пробоподготовки.
5. Возможность идентификации. Поскольку MALDI/TOF/MS относится к методам мягкой ионизации, то в спектре можно наблюдать пик молекулярного иона, что может служить в качестве способа идентификации. Точное измерение массы с высоким разрешением является важным инструментом, наряду с другими спектральными методами для подтверждения структуры природных соединений. Он также использу-
ется в качестве структурного доказательства, когда элементный анализ не представляется возможным, например, при изучении второстепенных компонентов.
Таблица
Сравнение основных способов ионизации в масс-спектрометрии
Способ ионизации Диапазон масс ^а) Влияние матрицы Разложение Сложные смеси Совместимость с ЖХ Чувствитель- ность
Ионизация электроспрея дая) 70000 Нет Нет Ограничено Превосходно От фемтомоль до пикомоль
Коммен- тарии Подходит для совмещения жидкостной хроматографии (ЖХ) и МС; устойчивость к небольшим концентрация солей (до нескольких мМ); многократная зарядка полезна, но значительно подавлена в случае смесей; низкая устойчивость к смесям; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов)
NanoESI 70000 Нет Нет Несколько ограничено, но лучше, чем ESI Возможно От зепто-моль до фемтомоль
Коммен- тарии Очень чувствителен и очень малые скорости потока; применим для ЖХ/МС, но малые скорости потока требуют специальных систем; умеренная устойчивость к солям (до нескольких мМ); многократная зарядка полезна, но может быть подавлена в случае смесей; умеренно применим для смесей; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов)
АРС1 1200 Нет Терми- ческое разложе- ние Ограничено Превосходно Фемто- моли
Коммен- тарии Превосходно для совмещения ЖХ и МС; малая устойчивость к солям (до нескольких мМ); применимо к гидрофобным образцами
MALDI 300000 Есть Фотораз-ло-жение иреакции с матрицей Хорошо для сложных смесей Возможно Фемто- моли
Коммен- тарии Несколько устойчиво к солям; высокая чувствительность; фон матрицы может быть проблемой для ионов с малой массой; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов); возможно фоторазложение; применимо к сложным смесям. Многократная зарядка весьма ограничена, так что данные не соотносятся с некоторыми другими способами.
Коммен- тарии Относительно слабочувствителен; малая фрагментация; мягкая ионизация; высокая устойчивость к солям —до 0,01М; необходима растворимость в матрице
Электронная ионизация (Е1) 500 Нет Терми- чес-кое разложе- ние Ограничено, если не используется ГЖХ/МС Очень ограничено Пико- моли
Коммен- тарии Хорошая чувствительность; уникальные данные по фрагментации с возможностью просмотра по базам данных; термическое разложение — основная проблема для биомолекул и других высокомолекулярных соединений
6. Возможность количественного определения. МС является мощным методом количественного анализа, основанием к этому является факт, что масс-спектрометрический сигнал пропорционален потоку частиц.
7. Надежность и точность. При использовании МС возможно получение очень точного значения молекулярной массы. Значение прямого определения молекулярной массы с точностью до 0,1 единицы трудно переоценить.
8. Структурная информация. По данным масс-спектра можно сделать вывод относительно размера и структуры углеродных заместителей, структурной информации, характера агликона и заместителей (сахара, ацильные группы и т. д.); межглико-зидных связей и позиции замещения агликона, а также углеводной последовательности. К тому же в масс-спектрах можно наблюдать структурные изменения в молекуле (гидролиз, окисление).
9. Экспрессность. MALDI/TOF/MS позволяет быстро получать и обрабатывать результаты, часто требуя меньше минуты для фактического анализа после элементарной пробоподготовки. Это позволяет осуществлять быстрый скрининг веществ.
10. Простота. Предоставляемая MALDI/TOF/MS информация понятна даже непрофессионалам, поскольку интерпретация масс-спектрометрических данных не требует глубоких знаний в данной области. Также прибор не требует особого обслуживания, расходных материалов.
Недостатки метода:
1. Высокая стоимость оборудования. Стоимость оборудования некоторых приборов может достигать десятков тысяч евро, хотя имеющиеся настольные приборы позволяют компенсировать этот недостаток.
2. Влияние пиков матрицы. Наблюдению молекулярного пика иона могут мешать пики матрицы. Поскольку для регистрации спектров веществ используется матрица, она может накладываться на пики основных веществ с молекулярной массой ниже 500 Da. Но в общем случае матрица пригодна к использованию для анализа малых молекул, если она обеспечивает эффективную ионизацию, минимальную фрагментацию и не вызывает наложений сигналов в масс-спектре.
3. Невозможность определить изомеры. Поскольку изомеры имеют одиноко-вую молекулярную массу, следовательно, с помощью масс-спектрометрии их различить нельзя. К тому же масс-спектрометрия дает мало информации о конфигурации гликозидной связи.
Таким образом, представленные результаты сравнительного анализа MALDI/TOF/MS позволяют сделать вывод о существенном преобладании достоинств настоящего метода. Большинство перечисленных недостатков может быть легко скомпенсировано.
Ниже в качестве примеров представлены результаты анализа ряда соединений различного происхождения методам MALDI/TOF/MS.
Экспериментальная часть Использование MALDI/TOF/MS для идентификации резвератрола
Для идентификации субстанции резвератрола методом MALDI/TOF/MS использовали 2,5*10-5 г/мл раствор в смеси спирта этилового 96% и ацетонитрила, который в количестве 0,5 [Л с помощью дозатора наносили на мишень, высушивали и сверху наносили каплю матрицы, и после высушивания регистрировали масс-спектр, который приведен на рис. 1.
В масс-спектре резвератрола наблюдаются интенсивные пики молекулярных ионов с зарядом m/z = 228,347 и 229,231. Это свидетельствует о том, что резвератрол ионизируется частично (пик иона с зарядом m/z = 229,321), а часть молекулы не претерпевает ионизации и показывает пик незаряженной молекулы (пик иона с зарядом m/z = 229,321). Данное поведение резвератрола при ионизации в методе
MALDI/TOF/MS может являтся его специфической особенностью и однозначно характеризовать его подлинность. Отсутствие других интенсивных пиков молекулярных ионов в масс-спектре дает дополнительнительную информацию о чистоте субстанции. Чувствительность метода составляет <1,2*10-8 г/мл.
Представленный метод позволяет однозначно подтвердить подлинность и чистоту резвератрола, характеризуется минимальной пробоподготовкой, исключительно высокой чувствительностью, не достижимой другими методами, легко реализуется за весьма короткий промежуток времени (общее время анализа, включая пробоподготов-ку, составляет несколько минут).
Рис. 1. Масс-спектр резвератрола, полученный MALDI/TOF/MS
Определение резвератрола в продуктах растительного происхождения
Для разработки идентификации резвератрола в объектах растительного происхождения использована экспресс-методика MALDI/TOF/MS, подтверждение правильности получаемых результатов осуществляли с помощью ВЭЖХ на обращенных фазах в градиентном режиме элюирования.
В качестве объектов исследования задействованы плоды винограда (черный сорт кишмиш), биологически активная добавка — пищевой концентрат полифенолов винограда «Эноант» (Украина).
Полученные результаты масс-спектрометрического определения представлены на рис. 2.
На представленном рис. 2 видно, что компонент, имеющий пик молекулярного иона т^ = 228,218, соответствует молекулярной массе резвератрола.
Таким образом, использованная методика позволяет экспрессно, достоверно подтвердить присутствие резвератрола в анализируемых образцах без предварительного хроматографического разделения. Результаты масс-спектрометрического определения подтверждали с помощью обращеннофазной ВЭЖХ.
Для определения резвератрола в плодах винограда 10,0 г свежих плодов измельчали в ступке, помещали в плоскодонную колбу емкостью 100 мл, добавляли 25 мл спирта этилового и экстрагировали на ультразвуковой водяной бане при температуре 80°С в течении 2 часов. Полученное извлечение фильтровали и в количестве 5 [Л вводили в хроматограф. Детектировали при длине волны А = 306 нм, результаты представлены на рис. 3.
Рис. 2. Масс-спектр спиртового извлечения из плодов винограда
Рис. 3. Хроматограмма спиртового извлечения из плодов винограда
В образце ягод винограда, взятых на анализ, удалось обнаружить резвератрол. На представленной хроматограмме время его удерживания составило 17,847 мин.
В пищевом концентрате полифенолов винограда «Эноант» также удалось обнаружить резвератрол. Для этого вышеобозначенный объект в количестве 5 [Л вводили в хроматограф. Результаты представлены на рис. 4. На хроматограмме резвератрол имел время удерживания 13,481 мин по характерному электронному спектру.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что присутствие резвератрола можно обнаружить методом MALDI/TOF/MS с большей экспрессностью, чем методом ВЭЖХ.
Рис. 4. Хроматограмма пищевого концентрата полифенолов винограда «Эноант»
Использование масс-спектрометрии MALDI/TOF/MS для идентификации карнозина
Идентификация карнозина с помощью МС разработана очень мало. В доступной нам литературе найдены ссылки на использование тандемной масс-спектрометрии и электроспрейной ионизации для характеристики карнозина в биохимических исследованиях [8-10]. Для целей фармацевтического анализа они малопригодны, поэтому нами предложена методика идентификации карнозина с помощью MALDI/TOF/MS.
Для масс-спектрометрического исследования получали водный раствор карнозина, который в количестве 0,5 [Л наносили на мишень и после высыхания сверху капали каплю матрицы — а-цианокоричной кислоты. При регистрации масс-спектра наблюдается наиболее интенсивный пик молекулярного иона с зарядом т/г = 227,489, что соответствует протонированной форме карнозина. Кроме того, встречаются пики молекулярных ионов меньшей интенсивности с зарядами т/г = 249,485 и 265,440, свидетельствующие о нахождении карнозина в виде аддуктов с ионами натрия и калия. Весьма полезную информацию для идентификации может предоставить частичная фрагментация молекулы карнозина. Поскольку карнозин является дипептидом, построенным из остатков р-аланина и гистидина, то на спектре можно увидеть фрагментацию молекулы с образованием гистидина — пик иона с т/г = 156,492, что несомненно можно охарактиеризовать как специфический признак карнозина (рис. 5).
Рис. 5. Масс-спектр карнозина
Чувствительность методики составила < 0,221 пикомоль (2,21*10-12 моль), что гораздо превышает чувствительность известных способов идентификации.
Определение флавоноидов будры плющевидной
Для анализа использовали экстракт густой травы будры плющевидной, который в количестве около 0,1 г помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 10 мл спирта этилового 70%, взбалтывали до его полного растворения и доводили тем же растворителем до метки. Полученный раствор в количестве 0,5 [Л наносили на мишень и после высыхания сверху капали каплю матрицы — а-цианокоричной кислоты. Результаты представлены на рис. 6.
Полученный масс-спектр позволил без предварительного фракционирования обнаружить молекулярные массы флавоноидов будры плющевидной. В частности, пики молекулярных ионов с зарядами т/г = 272,408; т/г = 287,364; и т/г =303 принадлежат молекулярным массам агликонов флавоноидов, а именно апигенину, лютеоли-ну/кемпферолу и кверцетину соответственно. Пик молекулярного иона с зарядом т/г = 433,221 соответствует гликозидной форме апигенина, пик иона с т/г = 449 указывает на гликозидирование агликона лютеолина/кемпферола, а пик иона с т/г = 487,266 и 633,249 соответствует моно- и дигликозидной формам кверцетина.
Таким образом, можно утверждать, что метод MALDI/TOF/MS применим для идентификации флавоноидов будры плющевидной.
Рис. 6. Масс-спектры экстракта будры плющевидной
Резюме
В результате проведенных исследований наглядно продемонстрированы возможности метода MALDI/TOF/MS применительно к исследуемым объектам.
Предложенная MALDI/TOF/MS-методика позволила достоверно подтвердить присутствие резвератрола в нативном виде и анализируемых образцах пищевой добавки «Эноант» без ее предварительного хроматографического разделения и с большей экспрессностью, чем методом ВЭЖХ.
Чувствительность MALDI/TOF/MS-методики обнаружения карнозина составила < 0,221 пикомоль (2,21х10-12 моль), что значительно превышает чувствительность известных способов идентификации.
Также без предварительного фракционирования с помощью MALDI/TOF/MS удалось обнаружить молекулярные массы флавоноидов будры плющевидной.
Работа выполнена в рамках задания Министерства образования и науки РФ НИУ «БелГУ» № 4-959-2011 по теме «Разработка оригинальной малостадийной технологии получения субстанций биологически активных соединений класса анто-цианов в виде стабильныхметаллорганических комплексов».
Литература
1. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. — М. : Бином. Лаборатория знаний, 2003. — 494 с.
2. Клюев, Н.А. Современные методы масс-спектрометрического анализа органических соединений / Н.А. Клюев, Е.С. Бродский // Рос. хим. ж-л. — 2002. — Т. XLVI, № 4. - C. 57-63.
3. Dass, C. Fundamentals of contemporary mass spectrometry / C. Dass // New Jersey: John Wiley & Sons. — 2007. — 585 p.
4. Tanaka, K. Protein and Polymer Analyses up to m/z 100,000 by Laser Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry / K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido [et al.] // Rapid Commun. Mass Spectrom. — 1988. — Т. 2. — С. 151.
5. Karas, M. Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules / M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp // Anal. Chem. — 1985. — № 57. — С. 2935.
6. Knochenmuss, R.A quantitative model of ultraviolet matrix-assisted laser desorption/ionization / R. Knochenmuss // J. Mass Spectrom. — 2002. — № 37. — Р. 867.
7. Chaurand, P. Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry / P. Chaurand, F. Luetzenkirchen, B. Spengler // J Am Soc. Mass Spectrom. — 1999. — № 10(2). — P. 91-103.
8. Aldini, G. Detoxification of cytotoxic a,b-unsaturated aldehydes by carnosine: characterization of conjugated adducts by electrospray ionization tandem mass spectrometry and detection by liquid chromatography/mass spectrometry in rat skeletal muscle / G.Aldini, P.Granata, M.Carini // J. Mass Spectrom. - 2002. — № 37. — Р. 1219-1228.
9. Aldini, G.Carnosine is a quencher of 4-hydroxy-nonenal: through what mechanism of reaction?/ G.Aldini, M.Carini, G.Beretta et al.//Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2002. — Vol. 298. — P.699-706.
10. Yi-Hong Chen. Mass spectrometric determination of dabsyl-chloride derivatised anserine, carnosine and taurine in commercial chicken essences / Chen Yi-Hong, Lin Ya-Ping, Liou Su-Er et al./ International Journal of Food Science and Technology. — 2007. — Vol. 42. — P. 593-600.
EXPERIENCES OF MALDI / TOF / MS IN PHARMACEUTICAL ANALYSIS
D.I. PISAREV1 O.O. NOVIKOV1 G.V.VASILIEV1 O.A. SELJUTIN2
1 Belgorod National Research University
2 Center for quality control and certification of medical products, Voronezh e-mail: pisarev@bsu.edu.ru
The paper presents results of studies on the devel- opment of methodology for analysis of some of the test drugs belonging to different chemical groups, using theMALDI / TOF / MS.
Key words: mass spectrometry, carnosine, resve- ratrol, flavonoids
