CC BY
253
Аналитическая химия находится в постоянном развитии. Методы и приборное оснащение, ранее бывшие прерогативой данной области и используемые именно в научно-исследовательских лабораториях, теперь все более интенсивно внедряются в производственную практику промышленных предприятий.
В пищевой промышленности широко применяются такие методы, как хроматография, атомная абсорбция, спектрометрия в УФ- и ИК-областях, вольтамперометрия и пр.
Cегодня аналитическая химия предлагает новые методы для контроля и безопасности продуктов питания: атомно-силовую микроскопию, ЭПР-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию с Фурье-преобразованием и др. В настоящее время эти методы, работающие на нано-и молекулярном уровне, применяют в основном в исследовательских целях. Однако дальнейшее поступательное развитие таких направлений, как нано- и биотехнологии, информационно-компьютерные технологии, приведет к тому, что данные аналитические методы станут неотъемлемой частью и в производственных условиях на предприятиях пищевой промышленности.
УДК 615.072; 615.322
Определение витамина Е
методом флуориметрии
Д. В. Демченко, О. Н. Пожарицкая, канд. фарм. наук, А. Н. Шиков, д-р фарм. наук, В. Г. Макаров, д-р мед. наук, проф. ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации»
Под названием «Витамин Е» известен ряд соединений (токоферолов и токотриенолов), близких по химической природе и биологическому действию. Из соединений этой группы наиболее активны - О-а-токофе-рол, выделяемый из растительных масел, и его синтетический аналог -ОД-а-токоферол. Токоферолы содержатся в зеленых частях растений, особенно в высокой концентрации в молодых ростках злаков, богаты токоферолами растительные масла (подсолнечное, хлопковое, кукуруз-
Рис. 1. a-токоферилацетат - 6-ацетокси-2,5,7,8-тетраметил-2 - (4Н,8Н,12Н-триметилтридецил) хроман (витамин Е)
Таблица 1
Интенсивность флуоресценции и пропускание кукурузного масла с добавлением витамина А
Модельная смесь Т I
Кукурузное масло 0,560 0,426
0,003%-ный раствор витамина А в кукурузном масле 0,563 0,430
0,006%-ный раствор витамина А в кукурузном масле 0,559 0,428
0,015%-ный раствор витамина А в кукурузном масле 0,529 0,429
0,03%-ный раствор витамина А в кукурузном масле 0,507 0,425
0,15%-ный раствор витамина А в кукурузном масле 0,411 0,354
Ключевые слова: витамин Е; флуо-риметрия; валидация; количественное определение; масляные экстракты и препараты.
ное, арахисовое, соевое, облепихо-вое, зародышей пшеницы). Некоторое количество их содержится в мясе, жире, яйцах, молоке [1-3].
Поскольку соединения этой группы неустойчивы к действию кислорода воздуха, то широкое применение в биологически активных добавках к пище, косметических продуктах, лекарственных препаратах нашли более стабильные сложные эфиры токоферолов, в частности а-токоферилацетат - 6-ацетокси-2,5,7,8-тетраметил-2 - (4Я,8Я,12Я-триметилтридецил) хроман (рис. 1) [1, 2]. В масложировой промышленности а-токоферилацетат добавляется в качестве антиоксиданта для стабилизации растительных масел.
Лекарственные препараты витамина Е выпускаются в виде растворов в растительных маслах с концентрацией 5, 10, 30 мас. % и в форме капсул -50%-ный раствор в масле. Контроль качества этих препаратов, в том числе на различных стадиях процесса их производства, требует применения максимально точных и быстрых методов. Допустимые погрешности в определении массовой доли а-токофери-лацетата не должны превышать ± 5 %. При этом эффективность любого способа анализа должна рассматриваться с учетом расхода реактивов, затрат времени и стоимости всех стадий, включая отбор проб, их подготовку к анализу, собственно анализ и обработку результатов.
Существуют различные методы определения витамина Е: обращено-
Keywords: vitamin E; fiuorometry; validation; quantitative definition; oil extracts and preparations.
фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с УФ-детектированием, титриметрический, электрохимические методы, масс-спектрометрические, методы ядерного магнитного резонанса (ПМР), активного кислорода и др. [4].
В рутинной лабораторной практике широко применяются оптические методы [4]. Для качественного и количественного колориметрического определения D-a-токоферола используется возможность его окисления с образованием окрашенных продуктов [4-7].
Известны методики определения витамина Е, включающие получение неомыляемой фракции и последующее флуориметрическое определение [8], но эти работы значительно удлиняют и усложняют анализ, а также флуориметрического анализа витамина Е в плазме [9, 10].
Цель работы - разработка специфичного, чувствительного и быстрого флуориметрического метода определения a-токоферилацетата в масле без использования стадии омыления, а также его валидация.
Подготовка проб для анализа включала растворение навесок модельных смесей и стандартного образца a-токоферилацетата (BASF, содержание основного вещества 96 %) в гексане квалификации «хч».
Определение интенсивности флуоресценции проводили на анализаторе жидкости «ФЛЮОРАТ-02-1» (ООО «Люмэкс», Россия).
Интенсивность флуоресценции измеряли при длине волны возбужде-
ANALYTICAL DEVICES FOR FOOD PROCESSING INDUSTRY
ния 292 нм и длине волны испускания 305-395 нм.
Предлагаемая методика определения витамина Е была надлежащим образом валидирована. Процесс ва-лидации обязателен в практике качественного производства медицинской продукции и является важной частью системы обеспечения и контроля качества. Валидация методики определения витамина Е в масле была выполнена в соответствии с «Analytical method development and validation» [11] и с учетом нашего предыдущего опыта [12, 13].
В качестве параметров валидации методики были выбраны: специфичность (Specif icity), линейность (Linearity) и аналитическая область методики (Range), прецизионность (Precision), точность (или правильность, Accuracy), предел обнаружения (Limit of detection - LOD) и предел количественного определения (Limit of quantitation - LOQ).
Для проверки специфичности (Specificity) методики готовили модельные смеси витамина А (BASF, 1000000 МЕ/г). Витамин А выбран как потенциально мешающий определению витамина Е в масле.
Модельные смеси готовили на основе кукурузного масла (ГОСТ 8808-2000), «Аведовъ» (ООО «МЭЗ Юг Руси», Россия), а также кукурузного масла с добавлением витамина А в различных концентрациях, исходя из его возможного содержания в масле: 0,003 % (99 МЕ); 0,006 % (198 МЕ); 0,015 % (495 МЕ); 0,03 % (990 МЕ); 0,15 % (4950 МЕ). Одинаковые навески модельных смесей разводили в гексане и измеряли интенсивность флуоресценции (I) и пропускание (Т), параметр, характеризующий отношение интенсивнос-тей прошедшего и падающего на кювету потоков излучения. Для того чтобы методика флуориметрическо-го определения была адекватна и воспроизводима, значения параметра Т должны находится в пределах 0,5-1,0.
Интенсивность флуоресценции и пропускание, полученные при анализе, представлены в табл. 1.
Таким образом, показано, что витамин А в концентрации менее 0,03 % (990 МЕ витамина А) не мешает определению витамина Е в масле данным методом.
Для построения калибровочного графика и определения вышеуказанных параметров валидации методики готовили раствор стандартного образца а-токоферилацетата с концентрацией 2 мг/мл. Для построения калибровочного графика использовали метод кратных разбавлений.
Диапазон концентраций для проверки линейности и аналитической области методики выбран в соответствии с ожидаемым содержанием витамина Е в растворах анализируемого масла в гексане - от 10 до 200 мкг/мл.
Оценка сходимости (Repeatability) выполнена по результатам анализа градуировочных растворов на трех уровнях концентраций (нижний, средний и высокий) в течение одного дня (Intraday precision) и в разные дни (Interday precision) в необходимом количестве повторностей. Оценка точности (Accuracy) методики выполнена методом добавок известных количеств а-токоферилаце-тата в масло. Значения пределов обнаружения (LOD) и количественного анализа (LOQ) определены расчетным путем по данным уравнения регрессии. Валидационные параметры методики представлены в табл. 2, график линейной кривой - на рис. 2.
Коэффициент корреляции полученного уравнения регрессии 0,9989 свидетельствует о высокой степени линейной корреляции аналитического отклика (флуоресценции раствора) от концентрации определяемого вещества. Относительное стандартное отклонение (RSD), характеризующее разброс экспериментальных точек около прямой, характеризуется низким уровнем значений (3,55 %). Прецизионность, как внутридневная, так и междневная на всех уровнях концентраций, не превышает 5,0 % (табл. 3).
Дополнительно оценивали точность методики при внесении известных количеств а-токоферилацетата в раствор (табл. 4). Во всех случаях определения по тесту «внесено-найдено» находились в пределах 97103 %. Наибольшая погрешность определения характерна для значений, близких к пределу количественного определения. Критерий незначимости систематической погрешности 0,68JD^n =0,97 выполняется [11].
Таким образом, по всем критериям получены результаты, свидетельствующие о специфичности, линейности, прецизионности и точности предлагаемой методики.
Для оценки стабильности а-токо-ферилацетата в среде растворения (в гексане) анализировали один и тот же градуировочный раствор ежедневно в течение двух суток при комнатной температуре, в защищенном от света месте (табл. 5).
Показано, что на всех трех уровнях концентраций (высоком, среднем и низком) растворы а-токоферилаце-тата стабильны в течение 8 ч при комнатной температуре.
Таблица 2
Валидационные параметры методики определения витамина Е
Показатель Значение
Линейность (Linearity) и аналитическая область (Range), мкг/мл 10 - 120
Уравнение регрессии* У=0,07252 + 0,00397-Х
Коэффициент корреляции, r 0,9987
Относительное стандартное отклонение, RSD, % 3,55
Стандартное отклонение для b (Sb) 0,000076
Стандартное отклонение для a (Sa) 0,0054
Точность (Accuracy), % 97,0 - 103,0
Предел обнаружения LOD, мкг/мл 0,021
Предел количественного определения LOQ, мкг/мл 0,064
*Х - концентрация раствора а-токоферилацетата, мкг/мл; У - флуоресценция.
0,6
0-1-.-.-.-.-.-.-.
0 20 40 60 80 100 120 140 Концентрация раствора а-токоферилацетата, мкг/мл
Рис. 2. График линейной зависимости интенсивности флуоресценции раствора а-токоферилацетата от концентрации
Таблица 3
Экспериментальные данные, полученные при оценке прецизионности методики
Концентрация раствора День эксперимента Флуоресценция Т+ДТ RSD, %
20 1 0,138; 0,140; 0,140+0,011 2,17
мкг/мл 0,144
2 0,144; 0,155; 0,152 0,150+0,014 3,78
3 0,140; 0,154; 0,144 0.146+0,018 4,94
Interday precision 0,145+0,012 3,46
60 1 0,294; 0,290; 0,289+0,014 1,93
мкг/мл 0,283
2 0,296; 0,295; 0,287 0,293+0,012 1,68
3 0,294; 0,304; 0,307 0,302+0,017 2,26
Interday precision 0,295+0,016 2,26
100 1 0,463; 0,463; 0,465+0,007 0.62
мкг/мл 0,468
2 0,471; 0,474; 0,469 0,471+0,006 0,53
3 0,473; 0,469; 0,477 0,473 + 0,010 0,84
Interday precision 0,470+0,010 0,89
Количество витамина Е в пересчете на а-токоферилацетат в масляных экстрактах или масляных препаратах
Таблица 4
Оценка точности методики по тесту «внесено - найдено»
Внесено, мкг/мл Найдено, мкг/мл Абсолютная ошибка, мкг/мл Найдено в % к введенному (Z)
5,00 5,15 +0,15 101,0
9,41 1С 1А 9,15 1А 7П -0,26 —П АА 97,24 Q7 ПО
15, 14 20,00 14,7 0 19,66 IF, 1Г\ 0,44 -0,34 —1 АП 97,09 98,30 ОЯ СП
26,60 32,00 /| п пп 26,20 32,15 А П 1С +0,15 _1_П 1С 98,50 100,4 1ПП 3
4U,U0 58,18 7П ЛЛ 4U, 15 58,16 71 +U, 15 -0,02 -t-П If, 99,96 1П1 п&
/U,40 Среднее, Z 1 1, ID % + 0,7 6 10 !,U8 99,32
Относительное стандартное отклонение, Б2, % 1,57
Относительный доверительный интервал Д%= t (90%, 8)Б2=1,86Б2 2,92
Критическое значение для сходимости результатов Д% (Руководство ..., 2007) 2,96
Систематическая погрешность 8 = Й-100 0,68
витамина Е(Х) (мас. %) ли по формуле (1):
X = аИ00/т106,
рассчитыва-
(1)
Таблица 5
Стабильность растворов а-токоферилацетата при хранении
Время, ч Значения интенсивности флуоресценции а-токоферилацетата для растворов с концентрацией
20 мкг/мл 60 мкг/мл 100 мкг/мл
Исходный 0,149 0,310 0,471
1 0,151 0,310 0,468
3 0,147 0,312 0,465 0,466
6 0,156 0,308 0,470 0,469
24 0,254* 0,483* 0,474 0,591*
Среднее (Г± до 0,151± 0,003 0,311± 0,003 0,469± 0,003
Относительное стандартное отклонение, RSD, % 2,31 0,97 0,65
* При расчете среднего значения и РБР для образцов, хранившихся при комнатной температуре, данные для 24 ч не учитывались.
Таблица 6
Результаты количественного определения витамина Е в образах и относительная погрешность определения
Объект исследования Х±Дх, мас. % е, %
Кукурузное масло «Аведовъ», ООО «МЭЗ Юг Руси» (с добавлением витамина Е в качестве антиоксиданта) 1,36±0,06 4,44
БАД к пище «Кедрол», ЗАО «СПб Институт фармации» 1,25±0,06 4,80
Масляный экстракт шалфея, ЗАО «СПб Институт фармации» 0,81±0,04 4,94
Масляный экстракт печени рыб семейства тресковых, ЗАО «СПб Институт фармации» 0,50±0,02 4,00
«а-Токоферола ацетат (витамин Е)», ООО «Люми», капсулы 0,2 г 50,86±1,54 3,03
где а - а-токоферилацетата, определенное по калибровочному графику, мкг/мл; т - навеска масляного экстракта или масляного препарата витамина Е, г; V- объем гексана, взятого для разведения навески, мл; 106-пересчет микрограммов в граммы.
Результаты количественного определения витамина Е в различных масляных образцах приведены в табл. 6.
Основной недостаток колориметрических методов определения витамина Е - их неспецифичность. С целью повышения селективности определения посторонние мешающиеся вещества (каротиноиды, стеролы, витамин А) удаляют, применяя щелочное омыление спиртовым раствором КОН с добавкой антиокси-дантов (пирогаллола, аскорбиновой кислоты) и последующей экстракцией токоферола из неомыляемой части сернокислым эфиром. Щелочной гидролиз оказывает отрицательное влияние на а-токоферилацетат, который нестоек в щелочной среде [4].
Перечисленных недостатков лишен флуориметрический метод, так как он позволяет сократить суммарное время анализа при достаточно высокой точности результатов.
Флуориметрический метод анализа витамина Е заключается в том, что молекула хромана под действием ультрафиолетового излучения переходит в возбужденное состояние, причем максимальное возбуждение происходит при 290-295 нм. Энергия молекул витамина Е, поглотивших лучевую энергию, высвобождается в виде излучения с максимумом интенсивности, смещенном в более длинноволновую область по сравнению с возбужденным излучением. Для того чтобы перевести в возбужденное состояние только витамин Е и избежать искажения результатов в результате рассеивающих свойств самих растворов, а также присутствия в растворе пыли и других твердых частиц, используют первичный фильтр (290295 нм). Вторичный фильтр, пропускающий флуоресценцию возбужденного хомана и блокирующий рассеянное возбуждение, выбирают на 30 нм больше и обычно используют в пределах 323-340 нм [8, 9, 10].
Преимущество разработанного метода заключается в его быстроте по сравнению с хроматографическими методами. Исключение стадии омыления значительно упрощает и делает более быстрым анализ определения
витамина Е в масле. Таким образом, в результате исследования разработана и валидирована методика флуоримет-рического количест-венного анализа витамина Е. Предлагаемый способ применим для анализа витамина Е в маслах и масляных препаратах, обладает высокой точностью и селективностью и может быть рекомендован для выполнения серийных определений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Машковский М.Д. - В кн.: Лекарственные средства: В 2 т.- М.: Изд-во «Новая Волна», 2002.
2. Зенкевич И.Г., Макаров В.Г., Дада-ли Ю.В., Соколова Л.И. Рефрактометрическое определение а-токоферила-цетата в препаратах витамина Е//За-водская лаборатория. Диагностика материалов. 2001. Т. 67. № 12. С. 13-16.
3. Косман В.М., Фаустова Н.М., Зенкевич И.Г., Пожарицкая О.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г. Сравнительная характеристика состава масла зародышей пшеницы//Масложировая промышленность. 2007. № 6. С. 32-34.
4. Варламова И.А., Калугина Н.Л. Применение оптических методов для определения витамина Е в продуктах питания//Вестник МГТУ им. Г.И. Носова. 2007. № 1. С. 109-110.
5. ГОСТ 30417-96. Масла растительные. Методы определения массовых долей витаминов А и Е.
6. Wong M.L., Timms R.E., Goh E.M. Colorimetric determination of total tocopherols in palm oil, olein and stearin/ /JAOCS. 1988. Vol. 65. № 2. Р. 258-261.
7. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. - М.: Медицина, 1964.
8. Taylor S.L., Lamden M.P., Tappel A.L. Sensitive fluorometric metod for tissue tocopherol analysis//Lipids. 1976. Vol.11. № 7. Р. 530-538.
9. Davidson B. C. Stoppers of Blood-Collecting tubes as sources of contamination in the fluorometry of vitamins A and E//Clinical Chemistry. 1979. Vol. 25. №7. Р. 1340-1341.
10. Черняускене Р.Ч., Варшакявичене З.З., Грибаускас П.С. Одновременное флуориметрическое определение концентрации витамина Е и А в сыворотке крови//Лаб. дело. 1984. № 6. С. 362-365.
11. Swatz M.E., Krull I.S. Analytical method development and validation. -New York: Markel Dekker Inc., 1997.
12. Urakova I.N., Pozharitskaya O.N., Shikov A.N., Kosman V.M., Makarov V.G. Development and validation of an LC method for simultaneous determination of ascorbic acid and three phenolic acids in sustained release tablets at single wavelength//Chromatographia. 2008. Vol. 67. № 9-10. Р.709-713.
13. Pozharitskaya O.N., Kosman V.M., Shikov A.N., Demchenko D.V., Eschenko A. Yu, Makarov V.G. Comparison between HPLC and HPTLC densitometry for the determin ation of icariin from Epimedium koreanum extracts//J. Sep. Sci. 2007. Vol. 30. №5. Р. 708-712.
