CC BY
70
УДК 615.322:582.632.2].015:616-002.77
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В МУЖСКИХ СОЦВЕТИЯХ КАШТАНА ПОСЕВНОГО И ОЦЕНКА ИХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
© М.В. Гаврилин, Ю.В. Гриценко, А.Ю. Терехов
Пятигорская государственная фармацевтическая академия, Калинина пр.,
11, Пятигорск, 357532 (Россия), e-mail: farmnauka@mail.ru
С помощью метода ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием установлено наличие в мужских цветках каштана посевного большого количества фенольных соединений катехинового типа. Проведены исследования по оптимизации методик и количественному определению фенольных соединений в изучаемом сырье. С использованием реактива Фолина-Дениса установлено, что общая сумма фенольных соединений превышает 11%, содержание проантоцианиди-нов в исследуемом образце составило 2,84±0,06%. Изучение противовоспалительной активности сухого экстракта из мужских цветков каштана посевного показало, что по фармакологической эффективности данный экстракт превосходит настойку сабельника.
Ключевые слова: каштан посевной, соцветия, фенольные соединения, проантоцианидины.
Введение
Каштан посевной (Castanea sativa Mill.), сем. Буковые (Fagaceae) - стройное, величественное дерево до 35 м высотой, с правильной яйцевидной или овальной кроной. У молодых растений ствол прямой, гладкий, со временем покрывающийся темно-коричневой коркой с глубокими продольными трещинами. По красоте, мощности роста и долговечности способен конкурировать с дубом. Побеги красноватые или оливково-коричневые, ребристые, с многочисленными железистыми волосками. Женские цветки зеленоватые, в коротких малоцветковых колосовидных соцветиях. Цветение длится около месяца. Мужские соцветия колосовидные, стоячие, густые, желтоватые, до 35 см длиной, с прицветниками [1]. В настоящее время имеются сведения о применении данного сырья в традиционной медицине, в то же время в доступной литературе сведений о химическом составе данного сырья не обнаружено.
Предварительно при помощи качественных реакций установлено наличие фенольных соединений, в том числе катехинов в мужских соцветиях, в связи с чем представлялось актуальным определение их содержания. Для выполнения исследования использовали мужские соцветия каштана посевного, представленные ООО «Красная поляна» (Сочи), 2008 г. сбора.
Экспериментальная часть
С целью предварительной оценки природы основных фенольных соединений мужских соцветий каштана посевного применяли метод ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием. ИК спектры регистрировали на приборе ФСМ 1201 с использованием приставки многократного нарушенного полного внутреннего отражения горизонтального типа.
Для количественного определения в исследуемом сырье содержания суммы фенольных соединений была использована методика с реактивом Фолина-Дениса, основанная на образовании окрашенных продуктов окисления фенольных соединений с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом в щелочной среде, создаваемой насыщенным раствором натрия карбоната. При этом интенсивность окраски при длине волны 720 нм позволяет судить о количестве фенольных соединений [2, 3]. В качестве стандартных образцов использовали субстанцию «камеллин», представляющую собой сумму катехинов чая (изготовитель ООО «Альтфарм», Московская обл.) и кислоту галловую (Sigma).
На первом этапе проведен выбор оптимальных условий проведения реакции. В первую очередь было необходимо выбрать оптимальное соотношение реактива и определяемого вещества. Для установления соотно-
* Автор, с которым следует вести переписку.
шения использовали 100 мкл раствора стандартного образца камеллина, содержащего 0,04 мг/мл суммы кате-хинов. К испытуемому раствору в мерной колбе вместимостью 25 мл добавляли 2,5 мл насыщенного раствора натрия карбоната, определенное количество реактива и после перемешивания доводили водой до метки.
При этом объем реактива изменялся от 50 до 800 мкл. Требуемое количество фосфорномолибдено-во-вольфрамового реагента определяли по максимальному значению оптической плотности, которое для камеллина наблюдалось при соотношении раствора и реактива 0,04 мг/0,5 мл соответственно.
Вторым этапом стало определение зависимости концентрации от оптической плотности.
Далее точную навеску сырья (около 1 г) подвергали экстракции 50 мл этилового спирта 70% в течение 2 ч. Полученное извлечение охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили тем же растворителем до метки. Затем опытным путем устанавливали оптимальное соотношение суммы экстрактивных веществ и реактива, которое составило 0,7 мг суммы экстрактивных веществ на 0,8 мл. После чего было установлено содержание суммы фенольных соединений в исследуемом сырье. В целях повышения точности анализ проводили в трех повторностях с различными объемами проб. Содержание суммы фенольных соединений, (в процентах в пересчете на камеллин) вычисляли по градуировочному графику у = 804,^ + 0,016. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Следующим этапом было установление содержания фенольных соединений после предварительного гидролиза с использованием 0,1 М кислоты хлороводородной. Гидролиз в таких условиях позволяет расщепить проантоцианидины (наличие последних качественно подтверждено в сырье по реакции Портера) до катехинов. Полученные результаты представлены в таблице 1.
В связи с тем, что в доступной литературе приведено достаточно много сведений об использовании в качестве стандартного образца кислоты галловой, представляло интерес определение суммы фенольных соединений в сырье в пересчете на данное соединение.
Предварительно было установлено оптимальное соотношение количества кислоты галловой и реактива, которое составило 0,02 мг/0,5 мл. Затем была изучена зависимость оптической плотности от концентрации раствора стандартного образца кислоты галловой.
Для количественного определения проантоцианидинов в исследуемом сырье использовали метод Портера, основанный на окислении проантоцианидинов до антоцианидинов в среде бутанола кислого [4, 5]. Экстракцию суммы проантоцианидинов проводили 70% спиртом, при соотношении сырья и экстрагента 1/20, затем 0,1 мл полученного извлечения переносили в бутанол, содержащий кислоту хлороводородную концентрированную и железосодержащий реактив, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали при температуре 80 °С в течение 50 мин. В результате развивалось красно-розовое окрашивание. Оптическую плотность полученного раствора измеряли спектрофотометрически относительно бутанола при длине волны 567 нм. Расчет содержания фенольных соединений в пересчете на цианидина хлорид вели с учетом E111%[ = 136 [5].
Результаты и обсуждение
Анализ ИК-спектров камеллина и порошка сырья (рис. 1) показывает значительное сходство полос поглощения и позволяет выделить такие общие структурные элементы, как ароматические кольца с различной степенью замещения (800-1000 см-1), вторичные спиртовые гидроксилы (1050-1200 см-1), фенольные гидроксилы (1400 см-1), карбонильные группы в виде кетогрупп и карбоксильных групп (15001600 см-1), а также ассоциированные водородными связями гидроксилы (3000-3200 см-1). Все это однозначно указывает на присутствие в сырье значительного количества фенольных соединений.
Из полученных данных следует, что линейная зависимость светопоглощения продукта окисления камеллина от концентрации находится в широком диапазоне концентраций (2-10 мкг/мл), а среднее значение удельного показателя поглощения (E11%[) составляет 857,98±39,32. Для продукта реакции реактива Фолина и кислоты галловой значение удельного показателя поглощения (E111%[) составляет 1206,54±27,16, а линейная область находится в интервале 1-6 мкг/ мл.
Как следует из представленных данных (табл. 1), среднее содержание суммы фенольных соединений в пересчете на камеллин в сырье без обработки кислотой составило 9,12±8,99%, а при проведении экстракции параллельно с гидролизом - 10,92±1,06%. При этом установлено, что разница в содержании суммы фенольных соединений при экстракции с добавлением и без добавления кислоты - 1,8%.
Полученные результаты по определению фенольных соединений в сырье в пересчете на галловую кислоту представлены в таблице 2. Среднее содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в сырье без обработки кислотой составило 6,82±4,77%, а при проведении экстракции параллельно с гидролизом - 7,76±0,97%.
Как следует из полученных результатов, содержание суммы фенольных соединений, вычисленное с использованием различных стандартных образцов, существенно отличается друг от друга. На наш взгляд, более достоверными следует считать результаты в пересчете на камеллин, так как структурно катехины более близки к полифенольным соединениям, содержащимся в мужских соцветиях каштана посевного, чем кислота галловая, тем более что хроматографически данное соединение в сырье не обнаружено.
Вместе с тем различия в результатах, полученных при экстракции с добавлением кислоты и без добавления, в обоих случаях достаточно близки, что косвенно указывает на присутствие в сырье проантоциа-нидинов в количестве около 2%.
Параллельно установлено, что содержание проантоцианидинов в сырье составляет 2,84±0,06%.
Затем было проведено определение суммы фенольных соединений в сухом экстракте, представляющем собой суммарное извлечение из исследуемого сырья. Анализ также проводился в трех повторностях.
Из представленных данных (табл. 3) среднее содержание суммы фенольных соединений в пересчете на камеллин в сухом экстракте без обработки кислотой составило 26,60±1,42%, а при проведении экстракции параллельно с гидролизом - 27,03±2,87%.
Среднее содержание суммы фенольных соединений (табл. 4) в пересчете на кислоту галловую в сухом экстракте без обработки кислотой составило 18,91±1,46%, а при проведении экстракции параллельно с гидролизом - 19,22±2,85%.
Содержание проантоцианидинов в пересчете на цианидин в сухом экстракте составило 9,86%.
Так как, согласно данным литературных источников, проантоцианидины обладают широким спектром терапевтического действия, представляло интерес изучение противовоспалительного действия суммарного извлечения из сырья.
Изучение противовоспалительной активности проводилось на модели адъювантного артрита, представляющего собой хроническое иммунное воспаление. Исследование проводили на 18 крысах-самцах линии ’^єіаг, массой 200-220 г, находящихся на стандартном рационе питания. Животным контрольной группы в правую заднюю лапу вводили 0,1 мл полного адъюванта Фрейда. За неделю до этого животным опытных групп вводили исследуемое вещество в дозе 200 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали настойку сабельника, производства ЗАО «Эвалар», в дозе 1 мл/кг. Первичная реакция (отек на правой лапе) оценивалась онкометрически на 3-й день инъекции адъюванта, вторичная иммунологическая реакция (отек на левой лапе) - на 14-й день после введения адъюванта. Было изучено профилактическое действие, для чего исследуемые вещества вводили зондом в желудок в течение 7 дней до инъекции адъюванта и продолжали их введение в течение последующих 14 дней.
%
100 во 601 40 20
Рис. 1. ИК-спектры камеллина (сплошная линия) и порошка анализи- 0
руемого сырья (пунктирная линия) 1000 1600 2000 2500 3000 350011
Таблица 1. Содержание суммы фенольных Таблица 2. Содержание фенольных соединений
соединений в исследуемом сырье в исследуемом сырье в пересчете
в пересчете на камеллин на галловую кислоту
Уа мкл Извлечение без добавления кислоты Извлечение без добавления кислоты
А Х,% А Х,%
50 0,3420 9,96 50 0,3420 7,09
100 0,4675 9,08 100 0,4675 6,46
200 0,5711 8,32 200 0,5711 6,92
Уа, мкл Извлечение с добавлением кислоты Извлечение с добавлением кислоты
А Х,% А Х,%
50 0,3725 10,85 50 0,3725 7,72
100 0,5686 11,05 100 0,5686 7,85
200 0,7449 10,85 200 0,7449 7,72
При оценке первичной воспалительной реакции получены следующие результаты. В группе животных, получавших сухой экстракт мужских соцветий каштана посевного в дозе 200 мг/кг, наблюдалось снижение воспалительной реакции на 42% по отношению к контролю. В группе же, получавшей настойку сабельника в дозе 1 мл/кг, данный показатель снизился лишь на 8,9%.
Оценка вторичной иммунологической реакции также показала большую эффективность изучаемого экстракта. Снижение воспалительной реакции на 36% относительно контроля также превышало результаты в группе, получавшей препарат сравнения, где наблюдалось снижение данного показателя на 20%. Все полученные результаты являются достоверными относительно контроля (см. рис. 2 и 3).
Таблица 3. Содержание суммы фенольных соединений в сухом экстракте в пересчете на камеллин
Таблица 4. Содержание суммы фенольных соединений в сухом экстракте в пересчете на галловую кислоту
Va, мкл извлечение без добавления кислоты Va, мкл извлечение без добавления кислоты
А Х,% А Х,%
50 0,2715 2б,28 50 0,2715 18,б8
100 0,5478 2б,51 100 0,5478 18,85
200 0,8374 27,02 200 0,8374 19,22
Извлечение с добавлением кислоты Извлечение с добавлением кислоты
А Х,% А Х,%
50 0,2741 2б,48 50 0,2741 18,83
100 0,5780 27,92 100 0,5780 19,85
200 0,8292 2б,70 200 0,8292 18,99
Контроль
Настойка Сабельника 1 мл/кг
Каштан 200 мг/кг
Контроль
Настойка Сабельника 1 мл/кг
Каштан 200 мг/кг
'-достоверно по отношению к контролю "-достоверно по отношению к настойке Сабельника
Рис. 2. Результаты измерения первичной воспалительной реакции
'-достоверно по отношению к контролю ''-достоверно по отношению к настойке Сабельника
Рис. 3. Результаты измерения вторичной иммунологической реакции
Выводы
1. Установлено наличие фенольных соединений катехинового типа.
2. С использованием метода Портера найдено содержание проантоцианидинов в исследуемом сырье в количестве 2,84±0,06%.
3. Полученный экстракт обладает ярко выраженной противовоспалительной активностью, по действию превосходящей настойку сабельника.
Список литературы
1. Каштан посевной [Электронный ресурс]. URL: http:// www.flower.onego.ru/kustar/castanea.html.
2. Ёршик О.А. Компонентный состав проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного Comarum Palustre L. // Вестник фармации. 2008. №3. С. 28-37.
3. Рудиковская Е.Г. Влияние температуры выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха // Физиология растений. 2008. Т. 55, №5. С. 793-797.
4. Porter L.J., Hrstich L.N., Chan B.G. The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin // Phytochemistry.1986. V. 25. Pp. 223-230.
5. Хишова О.М., Бузук Г.Н. Количественное определение процианидинов плодов боярышника // Химикофармацевтический журнал. 2006. Т. 40, №2. С. 20-21.
Поступило в редакцию 14 июня 2010 г.
