CC BY
42
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 4, 2015
УДК 577(112+25+354.9)+57(085.2+086.2) doi: 10.15407/biotech8.04.098
ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО АНАЛОГА SHB-EGF ЛЮДИНИ З ВИКОРИСТАННЯМ ГЕНЕТИЧНОЇ СИСТЕМИ ТРАНСПОЗОН-ТРАНСПОЗАЗА
Н. В. Короткевич
А. Ю. Лабинцев Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
Д. В. Колибо С. В. Комісаренко
E-mail: gnr.nata@gmail.com
Отримано 24.06.2015
Метою роботи було одержання рекомбінантного аналога розчинної форми гепаринзв’язувального EGF-подібного ростового фактора sHB-EGF у клітинах евкаріотів із використанням генетичної системи на основі транспозонів. Застосовано методи рекомбінантних ДНК та одержання евкаріотичних клітин-продуцентів рекомбінантних протеїнів. У результаті отримали евкаріотичні клітини-продуценти рекомбінантного аналога секреторної форми гепаринзв’язувального фактора росту людини sHB-EGF на основі лінії НЕК293. Для одержання генетичних конструкцій, що кодують ген sHB-EGF, використовували невірусну систему експресії на основі транспозонів. Експерименти на мишах виявили можливість застосування одержаних генетичних конструкцій для пошуку підходів до використання sHB-EGF у генній терапії різноманітних патологічних станів.
Ключові слова: гепаринзв’язувальний фактор росту людини HB-EGF, транспозаза, рекомбінантні протеїни, ростові фактори.
Гепаринзв’язувальний фактор росту, що подібний до епідермального фактора росту HB-EGF (від англ.: Heparin-Binding Epidermal growth factor-like Growth Factor), — це трансмембранний глікопро-теїн, який синтезується багатьма типами клітин. Уперше HB-EGF було виявлено в культуральному середовищі клітин гісто-цитарної лімфоми людини U937 [1]. Подібно до інших епідермальних факторів росту HB-EGF синтезується у формі трансмембранного попередника. Трансмембранна форма HB-EGF (proHB-EGF) складається з про-, гепаринзв’язувального, EGF-подібно-го, юкстамембранного, трансмембранного та цитоплазматичного фрагментів. ProHB-EGF злущується з клітинної поверхні під дією поверхневих матриксних протеїназ, що призводить до утворення його розчинної форми — sHB-EGF (від англ.: soluble HB-EGF). sHB-EGF є активним мітогеном і хемоатрактантом для багатьох типів клітин [2]. Трансмембранна та розчинна форми HB-EGF виконують свої біологічні функції через взаємодію з EGF-рецепторами 1 (EGFR, HER-1) і 4 (HER-4), які є регуляторами про-
ліферації, ангіогенезу, міграції та метастазування [3].
Після розщеплення молекули proHB-EGF утворюється не лише секреторний фрагмент — sHB-EGF, а й залишковий внутрішньоклітинний фрагмент CTF (від англ.: C-Terminal Fragment). За даними літератури, CTF разом із трансмембранним доменом транспортується ретроградним шляхом до ядра клітини [4]. Ядерний CTF взаємодіє з транскрипційними репресорами генів ци-клінів, що забезпечує так званий сигнал дерепресії. Водночас sHB-EGF взаємодіє з EGFR і через Ras-MAPK-сигнальні каскади сприяє прогресуванню G1-фази клітинного циклу шляхом регуляції експресії цикліну D1, c-Myc та ін. Дерепресійний вплив CTF і трансактиваційний EGFR-опосередкований вплив sHB-EGF спільно регулюють клітинний цикл у відповідь на зовнішньоклітинні чинники [5].
Особливістю proHB-EGF, що відрізняє його від інших факторів росту, є здатність формувати комплекси з іншими мембранними протеїнами. Показано, що proHB-EGF формує комплекс із CD9, CD44, CD63, CD81,
98
Experimental articles
CD82, аЗрі- інтегринами, антиапоптозним протеїном BAG-1, металопротеїназами типу ADAM та мембранно-асоційованими гепа-рансульфатпротеогліканами. Той факт, що комплекс локалізується в ділянках міжклітинних контактів, підтверджує думку, що HB-EGF відіграє важливу роль у міжклітинних взаємодіях [6].
Слід зазначити, що proHB-EGF та sHB-EGF також мають здатність взаємодіяти з дифтерійним токсином (ДТ) — основним фактором патогенності збудника Corynebacterium diphtheriae. Саме proHB-EGF виступає в ролі рецептора до ДТ, опосередковуючи проникнення та реалізацію його токсичних властивостей усередині клітини [7]. Рецепторна функція proHB-EGF є ще однією причиною інтенсивного дослідження біологічної активності цього протеїну та його ролі в механізмах патогенезу дифтерії.
Нещодавно було встановлено здатність HB-EGF сприяти загоєнню ран і перешкоджати перетворенню гострих ран на хронічні виразки [8]. Відомо, що sHB-EGF є активним мітогеном для кератиноцитів, фібробластів та міофібробластів і сприяє посиленню інфільтрації місця ушкодження тканинними макрофагами. Окрім того, sHB-EGF стимулює продукцію ростових факторів у ме-зенхімальних стовбурових клітинах і саме тому може відігравати вкрай важливу роль у процесах репарації тканин за фізіологічних та патологічних умов, зокрема опромінення, надлишок стероїдних гормонів, патології кровопостачання, цукровий діабет [9].
Суттєвою є роль HB-EGF у посиленні проліферації інсулінпродукувальних Р-клітин. Припускають, що екзогенний HB-EGF здатен посилювати проліферативний потенціал інсулінпродукувальних Р-клітин острівків підшлункової залози через активацію кінази рецептора EGFR та внутрішньоклітинної кінази mTOR [10]. Надекспресія HB-EGF у клітинах підшлункової залози дорослих мишей посилює також проліферацію Р-клітин і сприяє перетворенню дуктальних клітин на інсулінпродукувальні [11]. HB-EGF може виступати в ролі гепатопротектора за медикаментозної гепатотоксичності та посилювати проліферацію гепатоцитів за часткової гепа-токтомії [12].
З огляду на поліфункціональність молекули HB-EGF виникає потреба в розробленні генно-інженерних підходів, які б давали змогу отримувати рекомбінантну форму HB-EGF людини для подальшого застосування з терапевтичною метою на клітинному та ор-ганізменому рівнях: стимулювання проце-
сів загоєння ран, опіків, поверхневих виразок різної етіології, продукування інсуліну Р-клітинами острівків підшлункової залози, а також для фундаментальних досліджень молекулярних механізмів реалізації біологічної активності HB-EGF.
У роботі вперше запропоновано використання генно-інженерних підходів на основі невірусних систем експресії транспозон-транспозаза для одержання HB-EGF у клітинах евкаріотів з подальшою можливістю застосування отриманих генетичних конструкцій для розроблення методів генної терапії низки захворювань (цукровий діабет, печінкова недостатність тощо) на тваринних моделях.
Отже, метою роботи було одержання евкаріотичних клітин-продуцентів sHB-EGF людини. Для цього необхідно було створити невірусні генетичні конструкції, використання яких забезпечувало б стабільну експресію гена sHB-EGF у клітинах евкаріотів і уможливлювало безпосереднє застосування таких конструкцій для генної терапії за експериментальних патологій тварин (цукровий діабет, токсичні ураження печінки) у майбутніх дослідженнях.
Матеріали і методи
У роботі використовували: культураль-не середовище RPMI-1640 з L-глутаміном, фетальну сироватку великої рогатої худоби, пеніцилін-стрептоміцин, амфотерицин (ан-тимікотик), G418, праймери, імідазол, живильне середовище LB (Sigma, США), MgCl2, полімеразу Taq, вільну від нуклеаз воду, ен-донуклеази рестрикції ВатШ, XhoI, HindIII, ApaLI, XbaI, NcoI, NotI, ДНК-лігазу Т4, лужну фосфатазу, набір для виділення ДНК, набір для виділення геномної ДНК Genomic DNA Purification Kit, ізопропіл-рШ-тіога-лактопіранозид (IPTG), протеїнові маркери молекулярної маси (діапазон від 10 до 180 кДа), ДНК-маркери молекулярної маси в діапазоні від 100 до 10 000 п. н. (Fermentas, Литва), дезоксирибонуклеотидтрифосфати (dNTPs) (Amersham, США), Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA), електроблотер Hoefer ТЕ77 (Amersham, США) та електропоратор Eppendorf 2510 (Eppendorf, ФРН).
У дослідженнях застосовували рекомбі-нантну розчинну форму sHB-EGF людини, отриману нами раніше у бактерійній системі експресії [13]. Експресію та виділення ре-комбінантного протеїну проводили згідно з протоколами та рекомендаціями, описаними у вищезазначеній публікації.
99
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 4, 2015
Генетичні конструкції рТ2/ВН та pCMV-SB11 були люб’язно надані prof. Perry Hackett (Addgene plasmid # 26556, # 26552) [14, 15].
Культивування клітин евкаріотів. Клітинні лінії НЕК293, U937, 3Т3 таА431 отримали з банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України. Клітини культивували за стандартних умов у культуральному середовищі RPMI-1640 з додаванням 5-10% сироватки ембріонів телят за 5%-ї концентрації СО2 в атмосфері.
Одержання генетичної конструкції pEF1a-HB-EGF A149208 та генетичних конструкцій pT2/BH-EF1a, pT2/BH-EF1a-HB-EGFA14g_208 на основі транспозона pT2/BH. Як джерело нуклеотидної послідовності ділянки гена, що кодує HB-EGFA149-208 людини, використали кДНК, отриману з клітин гістоцитарної лімфоми людини U937. За допомогою ПЛР із застосуванням специфічної пари праймерів отримано нуклеотидну послідовність, яка кодує ген секреторної форми HB-EGF людини разом із сигнальним пептидом, що є необхідним для секреції в куль-туральне середовище. Генетичну конструкцію pEF1a-HB-EGFA149208 було створено на основі вектора pEGFP-N1 (Clontech, USA), де послідовність зеленого флуоресцентного протеїну (EGFP) замінено на промоторну ділянку гена фактора елонгації EF1a. Джерелом нуклеотидної послідовності промоторної ділянки гена EF1a слугував вектор pcDEF3 (модифікація вектора pcDNA3, де промотор CMV замінено на промотор гена EF1 a). Таким чином, було отримано векторpEF1a, що містить усі необхідні регуляторні елементи, та ген стійкості до селективного антибіотика G418. Для проведення необхідних маніпуляцій ДНК вектора виділяли з клітин E. coli DH10B методом лужного лізису [16]. З метою одержання генетичної конструкції pEF1a-HB-EGFA149208 вектор pEF1a послідовно обробляли ендонуклеазами рестрикції HindIII та NotI і лужною фосфатазою. Отриману в ході проведення ПЛР послідовність гена, що кодує HB-EGFA149_208, обробляли відповідними рестриктазами для подальшого об’єднання з векторною ДНК. Лінійну послідовність вектора та послідовність гена, що кодує HB-EGFA149-208, об’єднували в єдину генетичну конструкцію за допомогою ДНК-лігази фага Т4. Клонування виконували за «липкими» кінцями. Усі вищезазначені маніпуляції з ДНК здійснювали, дотримуючись рекомендацій виробника. Клітини E. coli штаму DH10B трансформували отри-
маною генетичною конструкцією pEF1a-HB-EGFA14g_208 за методом електропорації [17] з наступним висіванням на тверде живильне середовище LB (триптону — 10 г/л, дріжджового екстракту — 5 г/л, NaCl — 10 г/л, агару — 15 г/л), що містило як селективний антибіотик 0,005%-й канаміцин. Одержані після описаних маніпуляцій колонії перевіряли на наявність нуклеотидної послідовності вставки гена HB-EGFA14g-208 у складі вектора за допомогою ПЛР із використанням специфічної пари праймерів. Під час проведення ПЛР 25 мкл суміші містили: 0,6 мМ кожного з праймерів, 0,2 мМ кожного з dNTP, 0,8 мМ MgCl2, 1х буфер для Taq-полі-мерази, 1 одиницю активності Taq-полімера-зи. Продукти ПЛР аналізували в 1%-му агарозному гелі. Результатом цієї маніпуляції був ПЛР-продукт, що містив нуклеотидну послідовность HB-EGFA149208. Колонії, що містили вектор pEF1a, у складі якого є ген HB-EGFA149208 , нарощували в рідкому живильному середовищі з додаванням селективного антибіотика й далі використовували для напрацювання генетичної конструкції pEF1a-HB-EGFA149208 у кількостях, достатніх для подальшої трансфекції клітин евка-ріотів.
Дослідження функціональної активності системи транспозонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA14g-208 (транспозон) та pCMV-SB11 (транспозаза) in vivo. Дослідження проводили на мишах лінії Balb/c. ДНК вводили в організм тварин шляхом гідродинамічних ін’єкцій ДНК у розчині Рінгера (кількість рідини дорівнювала 10% від загальної маси тіла) у хвостову вену з розрахунку 25 мкг ДНК транспозона та 1,5 мкг ДНК транспозази на тварину. Контрольним тваринам вводили лише ДНК транспозона. Через 72 год тварин забивали. Аналіз наявності транспозона, що несе ген HB-EGFA14g-208 у клітинах печінки тварин, здійснювали шляхом ПЛР-ампліфікації маркерних ділянок «залишкової ДНК» транспозона (ДНК, що утворюється після вищеплен-ня цільового гена транспозазою) із геном-ної ДНК клітин печінки. Для проведення ПЛР використовували пару праймерів: 5'— CTGGAACAACACTCAACCCT —3' та 5'— CACACAGGAAACAGCTATGA — 3'. Геномну ДНК виділяли, застосовуючи набір Genomic DNA Purification Kit. Усі маніпуляції виконували згідно з рекомендаціями виробника.
Для зворотного вищеплення «корової» частини транспозона геномну ДНК обробляли ендонуклеазами рестрикції HindIII, ApaLI та XbaI з наступним самолігуванням.
100
Experimental articles
Отриманою сумішшю трансформували компетентні клітини E. coli штаму DH10B, висіваючи далі на селективне середовище (ген стійкості до антибіотика містився в «коровій» ДНК).
Трансфекція клітин евкаріотів. Транс-фекцію клітин проводили за умов 70%-ї конфлюентності на наступний день після пересіву клітин. Як трансфікувальний реагент було використано катіонний полімер поліе-тиленімін (PEI). Готували трансфікувальну суміш: плазмідну ДНК розчиняли у безсиро-ватковому середовищі RPMI, потім розчин плазмідної ДНК змішували з розчином PEI (1 мкг/мкл) та інкубували 15 хв за кімнатної температури. Середовище в клітинах замінювали на свіже і додавали трансфіку-вальну суміш. Клітини інкубували протягом 5-6 год, відмивали забуференим фосфатним розчином (ЗФР), додавали повне свіже середовище. Через 2 доби до клітин додавали селективний антибіотик неоміцин G418 з розрахунку від 0,3 до 0,5 мг/мл залежно від типу клітин. Наступні 7-10 діб спостерігали масову загибель нетрансфікованих клітин. Після такого періоду селекції поодинокі трансфіковані клітини росли на чашці Петрі впродовж 2-3 тижнів до моменту утворення поодиноких колоній. Відбір окремих клонів здійснювали з використанням колодязів. Окремі колонії переносили в лунки 24-лун-кового планшета, далі пересівали на чашки Петрі. Підтримувальна концентрація G418 становила від 0,2 до 0,4 мг/мл.
Електрофорез протеїнів у ПЛАТ. Електрофорез протеїнів проводили у блоках 10%-го поліакриламідного гелю за присутності ДСН у трис-трипсиновій буферній системі. Для електрофоретичного розділення наносили 100 мг протеїнів клітинного та 20 мл кондиційованого лізатів культурального середовища протягом 2 діб. Електрофорез проводили за сили струму 25 мА на пластину та напруги 100 В протягом 2 год. Отримані гелі використовували для наступного імуно-блот-аналізу. Для визначення молекулярної маси протеїнів застосовували маркери молекулярної маси.
Отримання імунної сироватки мишей проти sHB-EGF людини. Імунізацію мишей лінії Balb/c здійснювали одержаним раніше рекомбінантним аналогом sHB-EGF людини з використанням повного й неповного ад’ю-ванту Фрейнда [18].
Вестерн-блот-аналіз. В основу методу покладено перенесення протеїнів в електричному полі з ПААГ на нітроцелюлозну мембрану з наступним обробленням отриманих блотів
антитілами. Протеїнові зони, з якими зв'язувались антитіла, виявляли за допомогою підсиленої хемілюмінесценції (ECL-детекція).
Протеїни після розділення в ПААГ переносили на нітроцелюлозну мембрану (Amersham Hybond-ECL — GE Healthcare). Процедуру проводили протягом 3 год за сили струму 250 мА у буфері, що містив: 25 мМ трис-HCl, pH 8,3, 20%-й метанол, 192 мМ гліцин. Вільні центри зв’язування на мембрані блокували протягом 1 год 5%-м сухим знежиреним молоком у ЗФРТ (ЗФР, 1%-й Твін-20). Мембрану інкубували з першими антитілами у блокувальному буфері упродовж ночі за 4 °С з наступним промиванням блокувальним буфером 3 рази по 10 хв. Як другі антитіла застосовували антитіла кози проти Fc-фрагментів імуноглобулінів миші (розведення 1:30 000), кон’юговані з перокси-дазою хрону. Інкубацію з другими антитілами проводили за кімнатної температури протягом 1 год, після чого мембрану відмивали ЗФРТ 3 рази по 10 хв. Для імуноблот-аналізу культурального середовища клітин-проду-центів використовували поліклональні антитіла до рекомбінантного аналогу розчинної форми sHB-EGF людини, виділеної із клі-тин-продуцентів E. coli. Для аналізу брали однакову кількість середовища, отриманого під час культивування однакової кількості клітин.
Для візуалізації результатів імунобло-тингу застосовували метод підсиленої хемілюмінесценції. Мембрану експонували на рентгенівській плівці (Kodak, Китай). Час експозиції оброблених мембран на рентгенівській плівці залежав від інтенсивності хемілюмінесценції і тривав 5-30 хв. Плівки проявляли у стандартному фенідонгідрохі-ноновому проявнику та фіксували кислим фіксажем.
Результати та обговорення
Отримання генетичної конструкції pEF1a-HB-EGF А149-208 і генетичних конструкцій pT2/BH-EF1a та pT2/BH-EF1a-HB-EGF А149208 на основі транспозона pT2/ BH. Використана в роботі система транспо-зонів Sleeping Beauty (SB) є двокомпонентною системою, що складається із транспо-зази SB та певної специфічної нуклеотидної послідовності (IR/DR, inverted repeat/direct repeat) у складі транспозона (рТ2/ВН), за допомогою якої відбувається цілеспрямована інтеграція нуклеотидної послідовності певного гена в місцях ТА-повторів у структурі генома клітини. Транспозаза, що входить до
101
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 4, 2015
складу системи, здатна забезпечувати інтеграцію цільової нуклеотидної послідовності певного гена за рахунок повторів IR/DR, що її фланкують, забезпечуючи довготривалу експресію цільового гена [14]. Схематично роботу системи зображено на p^. 1.
Рис. 1. Схематичне зображення принципу дії системи транспозонів Sleeping beauty
У роботі використано систему транспозонів pCMV-SB11 та pT2/BH, де pCMV-SB11-вектор, що забезпечує експресію транспоза-зи Sleeping Beauty, а pT2/BH — вектор, що містить специфічні нуклеотидні послідовності (IR/DR, inverted repeat/direct repeat), які розпізнаються транспозазою, і це забезпечує їх послідовне «вирізання» та інтеграцію в геном у місцях ТА-повторів. При цьому утворюється «залишкова» ДНК транспозона та «основна» частина, яка несе специфічну нуклеотидну послідовність цільового гена і безпосередньо інтегрується в геном фис. 2). Оскільки інтеграція відбувається випадково і може мати різну ефективність (кількість інтегрованих копій), це може певним чином впливати на рівень експресії цільового гена у клітині. Проте безумовними перевагами такого підходу є стабільна й довготривала експресія цільового гена, а також можливість використання отриманих генетичних конструкцій для досліджень in vivo. Адже система є повністю сумісною з живим організмом і може виступати як альтернатива вірусних систем експресії.
На початкових етапах роботи було одержано генетичну конструкцію pEF1a-HB-EGFA149208, що несе в собі вставку гена, яка кодує секреторну форму HB-EGF (разом із сигнальним пептидом, проте позбавлену юкстамембранного, трансмембранного та цитоплазматичного доменів HB-EGFA149208)
і міститься в єдиній рамці зчитування із промоторною ділянкою евкаріотичного фактора елонгації EF1a (рис. 3, 4). Колонії бактеріальних клітин, що несли в собі генетичну конструкцію pEF1a-HB-EGFA149208, були згодом використані для її напрацювання, перевірки на наявність цільової нуклеотидної послідовності HB-EGFA149 208, а також як джерело об’єднаної в єдину рамку зчитування нуклеотидної послідовності HB-EGF A149208 та промоторної ділянки EF1a для подальшого субклонування у вектор pT2/BH.
Генетичну конструкцію pEF1a-HB-EGFA149_208 отримали на основі векторарEF1a й перевірили на наявність специфічної нукле-отидної послідовності HB-EGFA149 208 шляхом проведення рестриктного аналізу з використанням ендонуклеази рестрикції NcoI (рис. 4). Наявність фрагмента ДНК розміром « 700 п. н. вказує на присутність у складі pEF1a нукле-отидної послідовності HB-EGFA149208. Таким чином, було одержано й перевірено генетичну конструкцію pEF1a-HB-EGF A149208, яку далі використано для отримання транспозона на основі вектора pT2/BH.
З метою одержання генетичної конструкції транспозона обидва вектори, pEF1a-HB-EGFA149-208 та рТ2/ВН, обробляли ендо-нуклеазою рестрикції HindIII з подальшим лігуванням (рис. 5). Отриманою сумішшю трансформували компетентні клітини E. coli DH10B з подальшим висіванням на живильне селективне середовище. Слід зазначити, що оскільки обидва плазмідні вектори несуть у своїй структурі точку початку реплікації — оріджин (Ori), у разі їх поєднання в єдину генетичну конструкцію має утворюватися генетична конструкція, не здатна реплі-
Рис. 2. Схематичне зображення функціонування системи транспозон—транспозаза на основі отриманої генетичної конструкції pT2/ BH-EF1a-HB-EGFA149.208
102
Experimental articles
|1 2 3 4 5 6 7 8 9
3000 ii.ii.
1000 п.н 500 ц.и
Рис. 3. Результати ПЛР-аналізу бактерій E. coli DH10B, проведеного з використанням специфічної пари праймерів, які фланкують ген HB-EGFA149-208 і дають змогу одержувати ПЛР-продукт ( « 500 п. н.), що вказує на наявність цільової нуклеотидної послідовності (гена HB-EGFA149-208) у складі вектора рEF1aл: колонії 3-5 та 7, 8 несуть у собі цільову нуклеотидну послідовність гена HB-EGFA149-208 у складі вектора pEF1a
1 2 3 4 5 M 6
3000 п.н.
1000 п.я. 500 п.в.
Рис. 4. Рестрикційний аналіз плазмідного вектора рEF1a-HB-EGFA149-208 на наявність специфічної нуклеотидної послідовності гена HB-EGFA149-208 за допомогою ендонуклеази рестрикції NcoI:
1-5 — генетична конструкція рEF1a- HB-EGFA149-208, гідролізована ендонуклеазою рестрикції NcoI після виділення з попередньо відібраних колоній E. coli;
М — маркери молекулярної маси (пар нуклеотидів);
6 — вектор рEF1a, що не несе цільової нуклеотидної послідовності гена HB-EGFA149-208
куватись усередині бактеріальних клітин через внутрішню конкуренцію кожного з двох оріджинів. Тому було проведено попередній етап, що передбачав видалення ділянки, яка відповідає оріджину рТ2/ВН, з наступним самолігуванням (дані не наведено).
У результаті трансформації електроком-петентних клітини E. coli DH10B з подальшим висіванням на селективне живильне середовище було отримано транспозон pT2/ BH-EF1a-HB-EGFA149-208, що мав здатність реплікуватись у клітинах та забезпечувати стійкість до селективного антибіотика — ка-наміцину (рис. 6).
Рис. 5. Електрофореграми плазмідних векторів рТ2/ВН (А) та рEF1a-HB-EGFA149-208 (Б), гідролізованих ендонуклеазою рестрикції HindIII:
1, 3 — гідролізований вектор;
2, 4 — не гідролізований вектор;
М — маркери молекулярної маси (пар нуклеоти-дів)
Рис. 6. Електрофореграма отриманого плазмідного вектора рEF1a-HB-EGFA149-208 (2) і транспозона pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149-208 (і):
М — маркери молекулярної маси (пар нуклео-тидів)
Дослідження здатності системи транс-позонів pT 2 / BH-EF 1a-HB-EGF A149-208 (транспозон) та pCMV-SB11 (транспо-заза) спричинювати інтеграцію цільового гена, що кодує секреторну форму HB-EGF людини, в геном миші. Наступним етапом роботи була перевірка здатності одержаного транспозона pT2/BH-EF1a-HB-EGF A149208 забезпечувати інтеграцію гена HB-EGF людини в геном евкаріотичних клітин за участю транспозази SB11. Для перевірки роботи системи транспозонів існують два підходи: такий, що базується на детектуванні «залишкової»
103
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 4, 2015
ДНК транспозона (рис. 2), та/або який ґрунтується на зворотному «вищепленні» «основної» ДНК транспозона, інтегрованої в геном.
У наших дослідженнях ми використали 2 експериментальні групи мишей лінії Balb/c (по 4 тварини) та одну інтактну (2 тварини). Експериментальним тваринам шляхом гідродинамічних ін’єкцій у хвостову вену вводили необхідну кількість ДНК-векто-ра транспозона (І група) або ДНК-вектора транспозона разом із ДНК-вектором транспо-зази (ІІ група) у розчині Рінгера. Інтактним тваринам вводили відповідний об’єм розчину Рінгера (ІІІ група). Через 72 год тварин забивали і проводили забір проб печінки для подальшого виділення геномної ДНК, яку використовували для аналізу роботи системи транспозонів.
Дослідження здатності системи транс-позонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149208 (транс-позон) та pCMV-SB11 (транспозаза) спричинювати інтеграцію цільового гена, що кодує секреторну форму HB-EGF людини, у геном миші, виходячи з наявності «залишкової ДНК» транспозона. Метод оцінювання роботи системи транспозонів з урахуванням наявності «залишкової ДНК» транспозона базується на проведенні ПЛР з використанням специфічної пари праймерів, що фланкують регіон із цільовою нуклеотидною по-
рТ2/ВН-ЕЕ1а-НБ-ЕСЕІМ»-2М
І Щ
І НИ.ЕСЕ,, Тралено»» SB Q І
Ін'єкція у хвостову вену
bo* ЗОО
4 «ївлвшконц ДНК» транспорт
СХЗ-^ЕЕЕЗОО і % J
І
Вшцсцленвя цільової
■ УКЛООТЦДЦОІ ПОСЛІДОВНОСТІ
тв Інтеграції у геион
Оброблення
ецдояуклеазамн рестрикції Hindi 11, ApaLI, ХЬаІ т подальшим самолікуванням. Трансформація бактерій
Виділення геномної ДНК / \
1 - % .
Ш1Р,
детектування «залишкового» ПЛР продукту
Рис. 7. Схематичне зображення методу оцінювання здатності системи транспозонів спричинювати інтеграцію цільового гена в геном з урахуванням наявності у клітинах «залишкової ДНК» транспозона та/або ампліфікації залишкового ПЛР-продукту
слідовністю всередині транспозона. Зазвичай розмір такої ділянки є достатньо великим (від 1 000 п. н.). Однак у разі інтеграції цільової нуклеотидної послідовності в геном із подальшою репарацією «залишкової» ДНК транспозона стає можливою ампліфікація невеликої за розміром ділянки ДНК так званого «залишкового» ПЛР-продукту (рис. 7). Наявність такого ПЛР-продукту дає змогу визначити, чи відбулась інтеграція цільової нуклео-тидної послідовності ДНК у геном, чи ні.
Таким чином, геномну ДНК із печінки інтактних та експериментальних тварин було використано для оцінювання функціональної активності системи транспозонів детектуванням «залишкового» ПЛР-продукту. У результаті проведення ампліфікації виявлено продукт ПЛР необхідної молекулярної маси (« 450 п. н.) лише у тварин групи ІІ (рис. 8), що є свідченням утворення «залишкової» ДНК транспозона внаслідок інтеграції цільової нуклеотидної послідовності в геном.
Дослідження здатності системи транс-позонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA14d208 (транс-позон) та pCMV-SB11 (транспозаза) спричинювати інтеграцію цільового гена, що кодує секреторну форму HB-EGF людини, у геном миші зворотним вищепленням «основної» ДНК. Метод оцінювання роботи системи транспозонів зворотним вищепленням «корової» ДНК базується на обробленні ге-номної ДНК відповідними ендонуклеазами рестрикції з наступним самолігуванням. Отриману суміш фрагментів геномної ДНК використовують для трансформації клітин E. coli DH10B з подальшим висіванням на селективне живильне середовище. У результаті утворюються колонії клітин, що несуть репаровану «основну» частину транспозона.
Рис. 8. Електрофореграма ПЛР-продуктів після ампліфікації «залишкової ДНК» транспозона з геномної ДНК печінки мишей:
1, 3 — тварини, яким уводили ДНК системи транспозонів pT2/BH-EF1a-HB-
EGFA149.208 (транспозон) та pCMV-SB11 (транспозаза);
2,4 — тварини, яким уводили ДНК лише транспозона pT2/BH-EF1a-HB-
EGFA149-208;
ЕР — «залишковий» ПЛР-продукт;
ПЛР контроль — ПЛР-продукт фрагмента гена Р-глюкоронідази;
М — маркери молекулярної маси (пар нуклео-тидів)
104
Experimental articles
Так, у результаті трансформації клітин E. coli DH10B геномною ДНК з печінки мишей групи ІІ, обробленої ендонуклеазами рестрикції HindIII, ApaLI та XbaI з подальшим самолігуванням, утворювалися колонії, що мали здатність рости на селективному середовищі (ген стійкості до антибіотика несе «основна» частина транспозона). Відповідно у разі групи І можна було детектувати лише поодинокі колонії (рис. 9).
Надалі було обрано декілька випадкових колоній бактеріальних клітин, що утворилися за трансформації геномною ДНК миші з групи ІІ, для подальшого виділення плазмід-ної ДНК. Електрофоретичне розділення виділеної плазмідної ДНК свідчить про зниження молекулярної маси векторів, що наближалася до вектора рEF1a-HB-EGF А149208 і була значно нижчою за молекулярну масу вихідного транспозона (рис. 10).
Отримані результати свідчать про здатність системи транспозонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149208 (транспозон) та pCMV-SB11 (транспозаза) спричинювати інтеграцію цільового гена, що кодує секреторну форму HB-EGF людини, у геном клітин печінки миші.
Одержання евкаріотичних клітин-про-дуцентів секреторної форми HB-EGF людини на основі клітинної лінії НЕК293. З метою отримання евкаріотичних клітин-про-дуцентів рекомбінантної секреторної форми sHB-EGF людини було використано клітинну
лінію НЕК293, що була трансфікована системою транспозонів з подальшим проведенням процедури селекції для одержання окремих клонів клітин. Для порівняння використовували клітини, трансфіковані лише ДНК транспозона.
Оскільки створена генетична конструкція pT2/BH-EF1a-HB-EGF А149208 дає змогу експресувати рекомбінантний sHB-EGF у культуральне середовище, для аналізу його продукції застосували культуральне середовище після культивування окремих клонів клітин. Детектування наявності sHB-EGF у культуральному середовищі евкаріотичних клітин-продуцентів проводили за допомогою вестерн-блот-аналізу з використанням імунної поліклональної сироватки мишей, імунізованих рекомбінантним sHB-EGF, який було експресовано у клітинах E. coli Rosetta DE3. Результати вестерн-блот-аналізу засвідчили наявність цільового протеїнового продукту в культуральному середовищі клітин, трансфікованих системою транспозонів. Натомість рівень продукції цільового протеїнового продукту був значно нижчим за умов трансфікування клітин лише ДНК транспо-зона (рис. 11).
Отже, в результаті проведеної роботи було отримано евкаріотичні клітини-проду-центи рекомбінантного аналога секреторної форми гепаринзв’язувального фактора росту людини sHB-EGF на основі лінії НЕК293.
Рис. 9. Фотографічне зображення типового результату тесту зі зворотним вищепленням «корової» ДНК:
А — колонії клітин E. coli DH10B після
трансформації геномною ДНК з печінки миші групи ІІ, обробленої ендонуклеазами рестрикції HindIII, ApaLI, XbaI з подальшим самолігуванням;
Б — колонії клітин E. coli DH10B після
трансформації геномною ДНК з печінки миші групи І, обробленої ендонуклеазами рестрикції HindIII, ApaLI, XbaI з подальшим самолігуванням
Рис. 10. Результати тесту зі зворотним вищепленням «корової» ДНК:
М — маркери молекулярної маси (пар нуклео-тидів);
1, 2 — плазмідна ДНК, виділена з двох випадкових колоній клітин E. coli DH10B після трансформації геномною ДНК з печінки миші за ін’єкції системи транспозонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149_208 (транспозон) та pCMV-SB11 (транспозаза);
3, 4 — плазмідна ДНК транспозона pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149-208
105
BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 8, No 4, 2015
К 1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 11. Вестерн-блот-аналіз вмісту рекомбінантної секреторної форми sHB-EGF людини в культуральному середовищі клітин НЕК293:
К — контроль (клітин, які не трансфікували);
1-4 — культуральне середовище клонів клітин, трансфікованих генетичною конструкцією pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149-208 (без додавання транспозази);
5-8 — культуральне середовище клонів клітин, котрансфікованих системою транспозонів pT2/BH-EF1a-HB-EGFA149-208 (транспо-зон) та pCMV-SB11 (транспозаза)
Для одержання генетичних конструкцій, що кодують ген sHB-EGF для експресії в клітинах евкаріотів, було використано новітній генно-інженерний підхід із застосуванням невірусної системи експресії на основі транс-позонів. Експерименти на мишах також виявили можливість застосування отриманих генетичних конструкцій для досліджень in vivo, спрямованих на розроблення підходів до застосування sHB-EGF у терапії різноманітних патологічних станів.
Роботу частково виконано за рахунок гранту Президента України докторам наук для здійснення наукових досліджень, Проект № Ф50/059 «Одержання рекомбінантно-го аналога гепаринзв’язувального ростового фактора в клітинах евкаріотів».
REFERENCES
1. Higashiyama S., Abraham J.A., Miller J., Fiddes
J. C., Klagsbrun M. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF. Science. 1991, 251(251), 936939. doi:10.1126/science.1840698
2. Raab G., Klagsbrun M. Heparin-binding EGF-like growth factor. Biochimica et biophysica acta. 1997, 1333(3): F179-199. doi:10.1016/ S0304-419X(97)00024-3
3. Higashiyama S, Nanba D. ADAM-mediated ectodomain shedding of HB-EGF in receptor cross-talk. Biochim BiophysActa. 2005, 1751(1), 110-117. doi:10.1016/j.bbapap.2004.11.009
4. Hieda M., Isokane M., Koizumi M., Higashi C., Tachibana T., Shudou M., Taguchi T., Hieda Y., Higashiyama S. Membrane-anchored growth factor, HB-EGF, on the cell surface targeted to the inner nuclear membrane. The Journal of Cell Biology. 2008, 180(4), 763-769. doi: 10.1083/jcb.200710022
5. Higashiyama S., Iwabuki H., Morimoto C., Hieda M., Inoue H., Matsushita N. Membrane-anchored growth factors, the epidermal growth factor family: beyond receptor ligands. Cancer Science. 2008, 99(2), 214-220. doi: 10.1111/j.1349-7006.2007.00676.x.
6. Harris R. C., Chung E., Coffey R. J. EGF
receptor ligands. Experimental cell research. 2003, 284(1), 2-13. doi:10.1016/S0014-
4827(02)00105-2
7. Naglich J., Metherall E., Russell D., Eidels L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 1992, 69(6), 1051-1061. doi:10.1016/0092-8674(92)90623-K
8. Shirakata Y., Kimura R., Nanba D., Iwamoto R., Tokumaru S., Morimoto C., Yokota K., Nakamura M., Sayama K., Mekada E., Higashiyama S., Hashimoto K. Heparin-binding EGF-like growth
factor accelerates keratinocyte migration and skin wound healing. Journal of Cell Science. 2005, 118(11), 2363-2370. doi: 10.1242/jcs.02346
9. Singh B., Tsukada T., Zent R., Harris C. Membrane-associated HB-EGF modulates HGF-induced cellular responses in MDCK cells. Journal of Cell Science. 2004, 117(8), 1365-1379. doi: 10.1242/jcs.01037
10. Zarrouki B., Benterki I., Fontes G., Peyot M., Seda O., Prentki M., Poitout V. Epidermal growth factor receptor signaling promotes pancreatic P-cell proliferation in response to nutrient excess in rats through mTOR and FOXM1. Diabetes. 2014, 63(3), 982-993. doi: 10.2337/db13-0425
11. Kozawa J., Tokui Y., Moriwaki M., Li M.,
Ohmoto H., Yuan M., Zhang J., Iwahashi H., Imagawa A., Yamagata K., Tochino Y., Shimomura I., Higashiyama S., Miyagawa J. Regenerative and therapeutic effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on diabetes by gene transduction through retrograde pancreatic duct injection of adenovirus vector. Pancreas. 2005, 31(1), 32-42.
doi: 10.1097/01.mpa.0000163177.59920.f8
12. Kiso S., Kawata S., Tamura S., Inui Y., Yoshida Y., Sawai Y., Umeki S., Ito N., Yamada A., Miya-gawa J., Higashiyama S., Iwawaki T., Saito M., Taniguchi N., Matsuzawa Y., Kohno K. Liver regeneration in heparin-binding EGF-like growth factor transgenic mice after partial hepatectomy. Gastroenterology. 2003, 124(3), 701-707. doi:10.1053/gast.2003.50097
13. Korotkevych N. V., Kolybo D. V., Labyntsev А. Yu., Romaniuk S. І., Komisarenko S. V. Obtaining of recombinant human heparin-binding EGF-like growth factor and perspectives of its application in biotechnology. Biotekhnolohiia. 2010, 3(4), 44-54. (In Ukrainian).
106
Experimental articles
14. Aronovich E., McIvor R., Hackett P. The Sleeping Beauty transposon system: a nonviral vector for gene therapy. Human Molecular Genetics. 2011, 20(R1), R14-R20. doi: 10.1093/hmg/ddr140
15. Bell J., Podetz-Pedersen K., Aronovich E., Belur L., McIvor S., Hackett P. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nature protocols. 2007, 2(12), 3153-3165. doi: 10.1038/nprot.2007.471
16. Green M., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.-Y.: Cold Spring Harbor Laboratory. 2012, 726 p.
17. Dower J., Miller F., Ragsdale W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 1988, 16(13), 6127-6145.
18. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory
manual. N.-Y.: Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988, 720 p.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА SHB-EGF ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ТРАНСПОЗОН-ТРАНСПОЗАЗА
Н. В. Короткевич А. Ю. Лабынцев Д. В. Колибо С. В. Комисаренко
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины,
Киев
E-mail: gnr.nata@gmail.com
Целью работы было получение рекомбинантного аналога растворимой формы гепа-ринсвязывающего EGF-подобного ростового фактора sHB-EGF в клетках эукариот с использованием генетической системы на основе транспозонов. Использованы методы рекомбинантных ДНК и получения эукариотических клеток-продуцентов рекомбинантных протеинов. В результате были получены эукариотические клетки-продуценты рекомбинантного аналога секреторной формы гепаринсвязывающего фактора роста человека sHB-EGF на основе линии НЕК293. Для получения генетических конструкций, кодирующих ген sHB-EGF, применяли невирусную систему экспрессии на основе транс-позонов. Эксперименты на мышах показали возможность использования полученных генетических конструкций для поиска подходов применения sHB-EGF в генной терапии разнообразных патологических состояний.
Ключевые слова: гепаринсвязывающий фактор роста человека HB-EGF, транспозаза, рекомбинантные протеины, ростовые факторы.
OBTAINING OF RECOMBINANT ANALOGUE OF HUMAN SHB-EGF BY TRANSPOSON-TRANSPOSASE GENETIC SYSTEM
N. V. Korotkevych A. Yu. Labyntsev
D. V. Kolybo S. V. Komisarenko
Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Scienses of Ukraine, Kyiv
E-mail: gnr.nata@gmail.com
The goal of work was obtaining of recombinant soluble form of heparinbinding EGF-like growth factor sHB-EGF in eukaryotic cells based on transposon genetic system. We used methods of recombinant DNA and obtaining of eukaryotic cells for producing of recombinant proteins. We have obtained stable eukaryotic producer of recombinant analogue of soluble form of human heparinbinding EGF-like growth factor sHB-EGF based on HEK293 cells. We used transposon based non-viral expression system for sHB-EGF expression. Moreover, studies in mice have shown the possibility of using sHB-EGF expressing genetic constructs for gene therapy of various pathological conditions.
Key words: heparin-binding EGF-like growth factor HB-EGF, transposase, recombinant proteins, growth factors.
107
